专利名称：流式微球检测人心肌钙蛋白t的方法
技术领域：
本发明属于生物物质的分析方法，具体来说，属于流式细胞分析中的流式微球分 析技术方法。
背景技术：
心肌肌钙蛋白是目前诊断心肌损伤、坏死时特异度最高和敏感性较高的生物标志 物，在急性冠脉综合征(ACS)的危险分层中也有重要的应用价值，是检测心肌损伤和坏死 的“金标准”。目前，检测人心肌钙蛋白T的方法主要有1.免疫金标法，能进行快速定性 或半定量；2.电化学发光法，灵敏(最低检测限10pg/mL)、精密，但试剂成本高，需价值昂 贵的电化学发光仪；3.免疫比浊法，实用、方便、快速、成本低，但是影响因素较多，如抗原 或者抗体过量，可以出现可溶性复合物，造成误差，标本中血脂含量影响浊度，造成假性增 高，不利于检验方法的统一和比对；其它方法，如放免、酶免等，实用性差。目前临床上检测 人心肌钙蛋白T方法众多，也有一些专利技术方案，例如200720140932. 1号“人肌红蛋白/ 肌酸激酶同工酶/心肌钙蛋白I诊断试纸”、200720140929. X号“心肌钙蛋白I颜色颗粒诊 断试纸”、200780010683. 7号“在有症状的患者中鉴别急性和慢性心肌坏死的工具和方法”、 200810036418. 2号“肌钙蛋白I血清快速检测试剂盒(胶体金法)”等，但都存在着标准化 问题。流式细胞分析是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或 微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(或微粒)的物理、生化、免疫、 遗传、分子生物学性状及功能定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。流式微球分析技 术是使用单克隆抗体包被聚苯乙烯微球，捕获检测物，再加入荧光检测抗体，具有敏感性 高，特异性强，最低检测限可以达到10pg/ml。
发明内容
本发明的目的在于提供流式微球检测人心肌钙蛋白T的方法，实现在流式细胞仪 检测微球上的荧光强度来间接检测标本中人心肌钙蛋白T的含量。发明人提供的流式微球检测人心肌钙蛋白T的方法包括3个步骤，即先进行微球 激活，再单克隆抗体偶联，最后进行人心肌钙蛋白T的检测；具体做法是激活微球后，制备 羧基化微球偶联鼠抗人心肌钙蛋白T的单克隆抗体，然后捕获标本中的人心肌钙蛋白T， 再加入羊抗人肌钙蛋白τ的多抗和FITC(异硫氰酸荧光素)标记的驴抗羊的免疫球蛋白 G(IgG)，FITC的强度与微球捕获的人心肌钙蛋白T的分子数成线性相关。因此，通过在流 式细胞仪上检测微球上FITC的荧光强度，即可间接检测标本中人心肌钙蛋白T的含量。本发明的方法可将单抗偶联微球、羊抗人心肌钙蛋白T的多克隆抗体、异硫氰酸 荧光素标记的驴抗羊的IgG制成商品试剂盒，随时可对人心肌钙蛋白T进行检测。本方法 简便易行，能够快捷地检测人心肌钙蛋白T，为诊断疾病提供依据。适用于各类医院，尤其适 用于治疗心血管病症的医院。
具体实施例方式按照以下步骤检测人心肌钙蛋白T 第一步微球激活①取100 μ L微球原液(约1. 25 X IO6个微球)放入1. 5mL离心管里，漩涡振荡器 震荡微球30s，用超声波清洗器清洗微球30s。转速14000r/min (离心半径IOcm)下离心 4min，小心弃上清； ②加入100 μ L的微球洗涤缓冲液[ρΗ 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制的5%土 温-20]，漩涡震荡10s，超声波清洗10s，转速14000r/min (离心半径IOcm)下离心4min，小 心弃上清；③重悬微球于80 μ L激活缓冲液(0. ImoVLNaH2PO4, ρΗ = 6. 2)，漩涡震荡30s，超 声波清洗30s ；④用激活缓冲液配置新鲜的50mg/mL的EDC(1_乙基_3-(3_ 二甲氨基丙基)碳二 亚胺盐)和50mg/mL的Sul fo-NHS (硫化N-羟基琥珀酰亚胺)，然后在激活的微球里分别 各加入10 μ L，室温避光摇震20min ；⑤加入150 μ L PBS，高速漩涡震荡10s，转速14000r/mi η (离心半径IOcm)下离 心4min，小心弃上清；⑥重悬激活微球于100 μ L PBS中，漩涡震荡30s，超声波清洗15s。第二步单克隆抗体偶联①加入10 μ g的鼠抗人心肌钙蛋白T单克隆抗体到激活的微球里，用PBS调节最 终体积至500 μ L，室温避光摇震2h ；②转速14000r/min (离心半径IOcm)下离心4min，小心弃上清；③加入500 μ L PBS，转速14000r/min (离心半径IOcm)下离心4min，小心弃上清；④重悬微球于250 μ L封闭储存缓冲液(PBS配制的1 %苯磺酰胺和0. 05% NaN3)， 漩涡震荡15s，室温避光摇震30min ；⑤转速14000r/min (离心半径IOcm)下离心4min，小心弃上清；⑥加入500 μ L封闭储存缓冲液(PBS配制的苯磺酰胺和0.05% NaN3)，转速 14000r/min (离心半径IOcm)下离心6min，小心弃上清；⑦重悬于200 μ L封闭储存缓冲液，用血细胞计数板计算微球的浓度，4°C下避光 保存备用。此单抗偶联微球可批量生产，在低温(4°C左右)避光可长期保存。第三步人心肌钙蛋白T的检测①取约10000个包被好的微球，加入50 μ L标本，再分别加入50 μ L羊抗人心肌钙 蛋白T的多克隆抗体和50 μ L FITC(异硫氰酸荧光素)标记的驴抗羊的IgG，避光室温摇震 反应30min ；②转速14000r/min (离心半径IOcm)下离心4min，小心弃上清；③加入200 μ L缓冲液(PBS配制的％苯磺酰胺)，漩涡震荡重悬，转速14000r/ min (离心半径IOcm)下离心4min,小心弃上清；④再加入200 μ L缓冲液(PBS配制的％苯磺酰胺)，漩涡重悬，上流式细胞仪检测，观测微球上FITC的荧光强度，即可间接检测标 本中人心肌钙蛋白T的含量。
权利要求
1.流式微球检测人心肌钙蛋白T的方法，其特征包括3个步骤，即先进行微球激活，再 单克隆抗体偶联，最后进行人心肌钙蛋白T的检测；具体做法是先激活微球，接着制备羧 基化微球偶联鼠抗人心肌钙蛋白T的单克隆抗体，然后捕获标本中的人心肌钙蛋白T，再加 入羊抗人肌钙蛋白T的多抗和异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊的免疫球蛋白G ；通过在流式 细胞仪上检测微球上FITC的荧光强度，即可间接检测标本中人心肌钙蛋白T的含量。
全文摘要
流式微球检测人心肌钙蛋白T的方法，该方法包括3个步骤，即先进行微球激活，再单克隆抗体偶联，最后进行人心肌钙蛋白T的检测；具体做法是先激活微球，接着制备羧基化微球偶联鼠抗人心肌钙蛋白T的单克隆抗体，然后捕获标本中的人心肌钙蛋白T，再加入羊抗人肌钙蛋白T的多抗和异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊的免疫球蛋白G；通过在流式细胞仪上检测微球上FITC的荧光强度，即可间接检测标本中人心肌钙蛋白T的含量。本方法可将单抗偶联微球、羊抗人心肌钙蛋白T的多克隆抗体、异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊的IgG制成商品试剂盒，随时可对人心肌钙蛋白T进行检测。方法简便易行，能快捷地检测人心肌钙蛋白T，为诊断疾病提供依据。
文档编号G01N33/577GK102128934SQ201010041810
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者许健, 郑金鼎, 黄山 申请人:贵州省临床检验中心