一种具有肿瘤靶向性的多肽及其制备方法

专利名称：一种具有肿瘤靶向性的多肽及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学技术领域，具体地说是一种具有肿瘤靶向性的多肽及其制备方法。
背景技术：
肿瘤的攻克一直是生物医学界的焦点问题。近百年来已经发展形成了手术、放疗、 化疗三大肿瘤临床治疗方法。这些治疗手段在一定程度上延长了患者的带瘤生存期，但它 们在临床应用过程中除了切除和破坏肿瘤还损伤到正常组织的结构和功能，尤其是在全身 使用化疗药物时，药物通过血液循环到达人体的各组织并对正常细胞也发挥杀伤作用，引 起全身不良反应，严重影响治疗的最终效果。因此，新型肿瘤治疗手段的研发显得尤为重 要。 随着人类基因组计划(HGP)的完成及人类癌症基因组解剖计划(CGAP)的深入开 展，对肿瘤分子水平的认识得到很大的提高，肿瘤的形成主要是由于一些癌基因、抑癌基因 的突变或控制细胞生长的基因如P53、 RAS等发生了改变，如果这些发生改变的基因能够被 我们纠正，那么肿瘤可以从根本上被抑制和逆转。肿瘤的基因治疗正是在这种理论下诞生 的，并且它被认为是日后彻底治愈肿瘤疾病的有效方法。通过基因载体将目的基因或治疗 性药物导入肿瘤细胞的特定位置是基因治疗发挥作用的前提条件。但癌症基因治疗的主要 难题之一就是开发合适的载体进行全身治疗。目前临床试验中所用的载体一般有两类病 毒载体和非病毒载体，以腺病毒载体为代表的病毒类载体的表达率高于其他类型的载体， 但这种载体存在的潜在安全性问题很难得到控制，包括产生野生型病毒损伤机体以及病毒 DNA可能整合到染色体上引起遗传变异。病毒载体另一个突出的缺点是转导无靶向性，无法 实现肿瘤的个体化靶向性治疗。与病毒载体相比，非病毒类载体的优势更明显。目前肿瘤 基因治疗研究中涉及到的非病毒载体主要包括裸DNA、脂质体、脂质复合物、阳离子多聚物、
受体介导的载体等。这类载体种类较多，并具有低毒安全的特点，因此非病毒载体被认为是 比较有发展前途的，但它们同样存在着靶向性差和无靶向性的问题。可以看到，以往对于肿 瘤基因治疗载体的研究工作主要集中在体外环境下如何提高载体的转导效率和安全性，很 少注意其在体内靶向性的杀伤肿瘤的作用。而肿瘤是个体化疾病，肿瘤的产生存在组织特 异性和个体差异，肿瘤基因治疗最终的目标是进行个体化治疗，因此，临床上理想的肿瘤基 因治疗载体应当具备能靶向性运送治疗性物质进入肿瘤细胞，不影响正常细胞的生长，表 达率高，同时安全无毒等特点。迄今为止国内外尚未报道过这种肿瘤靶向特异性基因治疗 载体。尚未见受体介导的载体用于肿瘤的亲和特异性研究，用受体介导的载体进行乳腺癌 细胞的亲和特异性的检测在国内外尚未见报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种新型的具有肿瘤靶向性的多肽，它不仅具备高转导率， 无毒性，更重要的是它能携带目的基因或者抗肿瘤药物靶向性进入肿瘤细胞对其进行治疗和杀伤，同时对人体其它正常细胞无亲和性或毒性作用。本发明还提供了它的制备方法。
本发明的研究是建立在已有理论的和大量可靠的研究结果的基础上的。
1988著名的科学杂志"Ce 11"报道的缺陷病毒HIV_TAT蛋白及随后报道的单 纯疱疹病毒VP22蛋白，其转导效率高于目前所有的基因治疗载体。进一步的研究表明 HIV-TAT、 VP22蛋白等蛋白能够穿过细胞膜进入细胞是因为在这些蛋白结构中包含了由 几个或十几个氨基酸残基组成，并且富含精氨酸(Arginine)的肽链，称为蛋白转导域 (protein-transduction domain, PTD) 。 PTD是通过某种受体介导的抗原-抗体的反应机 制进入细胞内。随后对PTD的研究证实，它与各种大分子或生物活性治疗药物偶联后还可 以携带原先不能进入细胞的物质穿过细胞膜并在细胞中表达，发挥其生物学效应。PTD是一 类多肽类物质，它的发现为我们寻找特异性多肽肿瘤基因治疗靶向性载体提供了思路。另 外，正如我们所知道的，由于癌基因或抑癌基因的突变或失活等原因，不同肿瘤细胞表面会 表达特异性的受体物质，虽然对这些受体的了解尚有限，但这种现象的存在为我们寻找到 肿瘤细胞靶向性多肽载体奠定了基础。如果能够通过一定的技术方法将与这些肿瘤特异性 受体结合的多肽物质分离并分析其氨基酸结构与功能的关系，那么我们就很有可能找到并 符合要求的针对不种肿瘤细胞的靶向性基因治疗载体。 与此同时，一种可用于筛选特异性蛋白和多肽的噬菌体肽库技术(phage display librarytechnique)的迅猛发展为我们上述研究设想的实现提供了方法学基础。所谓噬菌 体肽库技术就是用分子克隆的方法将外源核酸片段以融合蛋白的形式表达于噬菌体颗粒 的外表面上。 一般来说，其实验操作可概括为两步建库和筛库。首先通过人工合成、cDNA 法或DNase随机水解法等来制备各种序列不一的核酸片段，然后将其克隆于载体(噬菌体 或噬菌粒)中，随后通过感染或超感染大肠杆菌，使其分泌出融合表达有外源片段的噬菌 体，合称为建库。之后用固定化的靶分子或靶细胞去筛选与它有亲和性的噬菌体，称之为筛 库。噬菌体展示技术具有两个明显的优点，其一是噬菌体易于扩增，其二是融合表达的外源 多肽或蛋白质的氨基酸序列可通过测噬菌体DNA的序列而推知。噬菌体展示可融合表达多 肽、蛋白质结构域和蛋白质。该技术已广泛应用于筛选受体、抗体、凝集素等具有临床价值 的外源蛋白以及新型的蛋白及多肽分子。
本发明的技术之案为 本发明的具有肿瘤靶向性的多肽的氨基酸序列是CFPVPGHDLVC (或 CASPSGALRSC，或CFSVPGHDIVC，或CTPMSLSLSEC，或CYTYPLGWHIC)。
制备方法是 1、为了找到与乳腺癌的靶向性多肽，应用表达108不同序列蛋白多肽的pC89噬菌 体肽库与人乳腺癌细胞株MDA-MB-231反复共培养多次；筛选能够穿过细胞膜进入细胞浆 和/或细胞核中的表达特异性多肽的噬菌体，体外扩增噬菌体并进行序列分析，即DNA测 序，并推导出它的氨基酸序列； 2、将上述筛选出的特异性多肽噬菌体与其它人肿瘤细胞及正常细胞进行体外共 培养，检测多肽噬菌体的细胞肿瘤特异性； 3、根据上述多肽序列和细胞特异性检测结果，人工合成该多肽(并在其末端进行 荧光标记，以便检测；同时将含有此多肽序列所有氨基酸组分但氨基酸排列顺序不同的同 源多肽进行细胞特导性检测，其目的在于研究多肽氨基酸排列位置与特异性及穿膜性的关系)； 4、上述合成多肽与不同人肿瘤细胞和正常细胞分别共培养，并检测该多肽序列在
无噬菌体外壳蛋白支持下是否仍具有穿细胞膜的功能，排除噬菌体蛋白介导的穿膜效应； 5、构建特异性多肽联合表达载体即pEGFP-多肽、pGEX-2T-多肽及pGEFP-多
肽_毒肽，探测该特异性多肽携带不同分子量目的蛋白入细胞的可应用性。 6、进行动物体内组织特导性亲和性(用同位素标记多肽方法)，探测其体内肿瘤
特异性导向表达的特性。
实验情况 经表达108多肽的pC89噬菌体肽库与人乳腺癌细胞株MDA-MB-231进行五轮共培 养筛选后收集能进入细胞的噬菌体，将这部分特异性的噬菌体扩增后，随机选择20个噬菌 体克隆进行DNA测序，由测序结果推导出这20个噬菌体克隆包含了 5条融合多肽的氨基酸 序列(见表1)，其中以I号序列的重复次数最高。将I号多肽噬菌体与MDA-MB-231细胞及 其它人乳腺癌细胞株、不同组织来源人肿瘤细胞及人正常细胞进行共培养，通过免疫荧光 技术检测出I号多肽噬菌体几乎只与MDA-MB-231细胞发生亲和特异性(图1)。为了排除 噬菌体外壳蛋白对多肽的跨膜效应的影响，单独合成了 I号多肽，并通过共聚焦荧光显微 镜检测出这条多肽只特异性进入MDA-MB-231细胞中(图2)，并证明其与正常细胞无亲和 性。为了进一步证实I号多肽具有携带能力，随后设计和构建了 GST-I号多肽融合蛋白表 达载体，利用基因工程技术对表达的GST-I号多肽融合蛋白进行分离和纯化，将这段融合 蛋白与MDA-MB-231细胞进行亲和性实验，免疫荧光检测证明I号多肽能够携带GST-I号肽 融合蛋白特异性的进入MDA-MB-231细胞中(图3)，并在细胞内表达一定的时间。
表l.五条融合蛋白的氨基酸序列结构
序列编号氨基酸序列结构序列的重复次数
ICASPSGALRSC6
IICFPVPGHDLVC5
IIICFSVPGHDIVC4
IVCTPMSLSLSEC3
VCYTYPLG冊IC2 I号多肽噬菌体加入体外培养的MDA-MB-231细胞中，作用一定时间后，应用抗M13 噬菌体抗体及绿色荧光标记的小鼠IgG-488 二抗与进入细胞的噬菌体的上M13进行免疫荧 光显色，Phalloidin复染后共聚焦显微镜下观察的结果，如图1所示(图1是本发明的I号 多肽噬菌体与MDA-MB-231细胞的亲和性试验结果)。 标记绿色荧光FITC的I号多肽与MDA-MB-231细胞共培养，作用一定时间后，洗脱 多余的未进入细胞的多肽，共聚焦荧光显微镜下观察的结果，如图2所示(图2是本发明的 I号多肽与MDA-MB-231细胞的亲和性试验结果)。
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GST-I号多肽融合蛋白加入到体外培养的MDA-MB-231细胞中，作用一定时间，利 用小鼠抗血GST单克隆抗体和FITC标记的兔抗鼠HRP-IgG与GST蛋白发生的免疫反应，检 测出进入细胞的GST-I号多肽融合蛋白，为共聚焦荧光显微镜下观察到的结果。如图3所 示(图3是本发明的GST-I号多肽融合蛋白与MDA-MB-231细胞的亲和性试验结果)。
本发明以受体介导的载体为研究出发点，开发具有肿瘤细胞特异亲和性的多肽， 该段具有人乳腺癌细胞亲和特异性的多肽能够携带具有不同分子量大小的治疗性药物以 及基因进入特定的乳腺癌细胞中，它在特定乳腺癌细胞中的靶向性和转导效果均高于目前 其他基因治疗载体，具有作为乳腺癌靶向性基因治疗的特异性载体的潜在临床应用价值。 同时，它的发现还为以后其他种类的恶性肿瘤细胞株的亲和特异性多肽的筛选提供强有力 的技术支持。此外，该多肽仅含9-ll个氨基酸残基，合成容易，并且空间位置变化相对较 小，易于对多肽进行质量控制，使用方便。本发明能够大大提高肿瘤基因治疗的靶向性，这 条乳腺癌细胞特异性多肽的发现不仅能够积极推动肿瘤细胞靶向性基因治疗的发展，而且 该实验技术的建立还为其他肿瘤细胞的靶向性多肽载体、新型肿瘤相关抗原、肿瘤特异性 抗原的发现提供实验依据。将会起到积极的推动作用，能够实现真正意义上的肿瘤个体化 基因治疗。


图1是本发明的I号多肽噬菌体与MDA-MB-231细胞的亲和性试验结果1000X
图2是本发明的I号多肽与MDA-MB-231细胞的亲和性试验结果400X
图3是本发明的I号多肽与GST融合蛋白与MDA-MB-231细胞的亲和性试验结果 1000 X
具体实施例方式实施例 取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于150mm组织培养皿，37°C ， 12h，更换新鲜 培养液(含10% FBS的L15培养液)，并在培养液中加入Chloroquine使其终浓度达到 100线37。C，30min ;将3X10"TU的pC89噬菌体肽库噬菌体加入培养皿，8h-12h，冰上 5min ;4。C下40ml HBSS冲洗细胞4次、HBSS(-)冲洗l次，再用llml的Subtilisin处理细 胞lh，制备细胞悬液，离心去除Subtilisin ;再用6ml含lmM PMSF禾口 2mM EDTA的HBSS(-) 液处理细胞15min，洗涤；裂解细胞，收集裂解液为含有经过第一轮细胞筛选得到的能进入 MDA-MB-231细胞的噬菌体。 将收集得到的上述细胞裂解液转化感受态大肠杆菌E. Coli XLI-Blue， LB平板扩 增，收集转化菌液，加入M13K07辅助噬菌体，制备噬菌体颗粒；扩增后得到的噬菌体再次 加入细胞中进行下一轮筛选_扩增，直到加入的噬菌体与能进入细胞的噬菌体基本平衡为止。 本实验中噬菌体滴度按下列公式计算 噬菌体滴度(pfu)=蓝色噬斑数目X稀释倍数 按上述方法，经5轮筛选后，从转化细菌LB平板中随机挑选20个噬菌体克隆并 单独扩增，提取DNA，用M13(-40)引物测序(送生物公司测序)，并推导出插入于这些噬菌体外壳蛋白中的多肽序列。序列结果显示，20个克隆中检测到五条不同的多肽序列，其中 6个克隆为CASPSGALRSC ;5个克隆为CFPVPGHDLVC ;4个克隆为CFSVPGHDIVC ;3个克隆为 CTPMSLSLSEC ;2个克隆为CYTYPLGWHIC。将这五条多肽序列逐一编号为I V号(表1)。 多肽序列的氨基酸残基以非极性疏水性氨基酸为主。用PIR国际蛋白质数据库(http:〃 pir. georgetown. edu/)进行比对未发现与这五条序列有同源性一致的功能蛋白序列。
选取含有高重复性氨基酸序列的噬菌体进行与MDA-MB-231细胞的亲和特异 性检测。具体方法是对数生长期MDA-MB-231细胞接种于24孔板，2X 104/孔，37 °C培 养12h后，更换新鲜培养液并加入Chloroquine，30min ;实验组分别加入经筛选得到的 含有高重复性氨基酸序列的I号和II号小肽噬菌体，对照组分别滴加原始肽库噬菌体、 RGD-integrinbinding噬菌体，加入的噬菌体滴毒均为109-101QTU，每组设3个复孔；再培养 8h-12h后，PBS冲洗，用3. 7%福尔马林和10% Triton X-100分别固定细胞lOmin，加入含 1% BSA、0. 025% NaN3、0. 1% Saponin的缓冲液预作用15min，滴加1 : 500抗M13噬菌体 抗体作用lh，O. 1% S即onin冲洗，再加入1 : 800的小鼠IgG-488 二抗作用30min后，洗净 多余二抗，用Phalloidin复染，荧光显微镜观察小肽噬菌体与MDA-MB-231细胞的亲和特异 性。 为了进一步明确上述筛选出的多肽噬菌体是否具有细胞特异性，将人乳腺癌细胞 株MDA-MB-435、 MCF-7、 T47D，不同组织来源肿瘤细胞Hela、 HT_1080、 A431、 SCC_29、 Calu3、 Calul、 GLC、 U251及正常细胞KMB17、 L-02分别接种于96孔板。按照上述方法检测I号小 肽噬菌体与这些细胞株的亲和能力。 为了排除噬菌体外壳蛋白对融合蛋白特异性跨膜功能的影B向，并进一步检测融合 多肽的特殊转运能力。选择20个克隆中重复性最高的两条多肽序列(I号和II号)进行 合成(由生物公司合成)，并在末端标FITC绿色荧光，合成的荧光标记多肽分别命名为I号 肽、II号肽。将合成的多肽分别与MDA-MB-231细胞进行体外实验，具体操作如下对数生 长期MDA-MB-231细胞接种于96孔板，5X 103个/孔，37。C培养12h。根据加入多肽序列的 不同分成4个组。按照浓度200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml分别加入I号、II号肽，同时 设RGD-integrin蛋白阳性对照组和不加多肽的空白对照组。每种浓度设6个复孔。分别 在作用12h、48h后，用PBS洗去未进入细胞的多肽，荧光显微镜下观察多肽与细胞的亲和特 异性及多肽的最佳作用时间和作用浓度。 为了排除合成的多肽与其他细胞可能发生的交叉反应，又将人乳腺癌细胞株 MDA-MB-435、 MCF-7、 T47D，不同组织来源肿瘤细胞Hela、 HT_1080、 A431、 SCC_29、 Calu3、 Calul 、GLC、U251及正常细胞KMB17、L_02分别接种于96孔板，按照前述方法检测多肽与这 些细胞株的亲和能力。 结果表明，I号肽和II号肽均能与MDA-MB-231细胞发生特异性结合并进入 细胞内，其中以I号肽的亲和性更强，且亲和性高于目前公认的具有较高细胞转导率的 RGD-integrin蛋白；同时，这两条多肽与其他组织来源的肿瘤细胞几乎不发生特异性结 合，更重要的是，这两条多肽均不与正常细胞发生结合。证明所筛选出的多肽确实是具有乳 腺癌细胞MDA-MB-231特异性的。 为了了解筛选出的特异性多肽是否具有携带外源性分子进入细胞，送公司合成编 码I号肽的cDNA并在目的片段的3'和5'端分别设计了 EcoR I与BamH I的酶切位点。将
7合成的DNA序列通过T4连接酶体系定向插入质粒pGEX-2T中，构建原核表达载体。重组质 粒经测序得到鉴定。将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)。挑选单菌落接种于含氨 苄青霉素的LB培养液中，37t:培养到A600nm = 0. 6左右时，加入异丙基_ P _D_硫代半乳 糖苷(isopropyl-P-D-thiogalactoside)至终浓度0. 6mmol/L，继续以37°C ， 250r/min振 荡培养4h，诱导蛋白的表达。将诱导后的菌液于4t:下5000r/min离心，收集的菌体PBS洗 涤2次后制备成细菌悬液，超声破菌。离心取上清液，经GST琼脂糖亲和层析柱纯化，收集纯 化后的产物，经10% SDS-PAGE电泳鉴定。将纯化的融合蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电 泳，然后将蛋白转到硝酸纤维素膜上，加入5%脱脂奶粉置37t:封闭30min，再加入小鼠抗 血吸GST单克隆抗体(l : 800)，4t:过夜。洗涤3次后，加入兔抗鼠HRP-IgG(1 : 1000)， 置37t:反应30min。经硫酸萄聚糖处理后用四甲基联苯胺显色5min，终止反应，该检测结果 显示所获得的蛋白为GST蛋白和I号多肽的融合蛋白。另外，取对数生长期MDA-MB-231细 胞接种于24孔板，5X 104/孔，37t:培养12h后，更换新鲜培养液。按照工作浓度10 P mo1/ L将融合蛋白加入细胞培养液中，并设只加GST蛋白的实验对照组和不加任何蛋白的空白 对照组。继续培养，12h后将反应物用PBS洗未经结合进入细胞的融合蛋白，在细胞中再加 入小鼠抗血GST单克隆抗体(1 : 800)，4t:过夜。洗涤3次后，加入FITC标记的兔抗鼠 HRP-IgG(l : 1000)，置37t:反应30min，经PBS洗脱未结合的多余抗体，荧光显微镜观察结 果。结果表明这条多肽能携带GST蛋白进入MDA-MB-231细胞中。按照上述实验方法还将 融合蛋白与其他不同种类的人乳腺癌细胞株进行共培养，结果发现，多肽不能携带GST蛋 白进入这些细胞内。
附加说明 7.本发明中的试验中涉及的试剂均可在市场购买，或按说明书中的配方自行配 制。 8.本发明的试验过程中用到的细胞均为已经构建的细胞株，并可购买。 9.本发明的试验中涉及的细菌菌株及质粒均可在国内外的生物制剂公司购买到。
以下提供试验中的某些较为重要的生物制剂的相关文献出处或来源 pC89噬菌体肽库 相关文献Vasily V， Ivanenkov， Franco Felici et al. Targeted delivery of multivalent phagedisplay vectors into mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta, 1999(1448) :463-472.来源本发明中的pC89噬菌体肽库由意大利Dr. Alessandra Uizzago惠贝曾。RGD_integrin binding噬菌体、RGD_integrin蛋白 来源本发明中的RGD-integrin binding噬菌体及RGD-integrin蛋白由美国辛 辛那提大学肿瘤研究中心的Dr. Stambrook惠赠。
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权利要求
一种具有肿瘤靶向性的多肽，其特征在于它的氨基酸序列结构为CFPVPGHDLVC。
2. 权利要求1所述的具有肿瘤靶向性的多肽的检测方法，其特征在于按以下步骤进行1) 上述具有肿瘤靶向性的多肽与不同人肿瘤细胞和正常细胞分别共培养，并检测该多 肽序列在无噬菌体外壳蛋白支持下是否仍具有穿细胞膜的功能；2) 构建特异性多肽联合表达载体即pEGFP-多肽、pGEX-2T-多肽及pGEFP-多肽-毒 肽，探测该特异性多肽携带不同分子量目的蛋白入细胞的可应用性；3) 用同位素标记多肽方法进行动物体内组织特导性亲和性实验，探测其体内肿瘤特异 性导向表达的特性。
全文摘要
本发明是具有肿瘤靶向性的多肽及其制备方法。其特征在于它的氨基酸序列结构为CFPVPGHDLVC。应用表达108不同序列蛋白多肽的pC89噬菌体肽库与人乳腺癌细胞株MDA-MB-231反复共培养多次；筛选能够穿过细胞膜进入细胞浆和/或细胞核中的表达特异性多肽的噬菌体，体外扩增噬菌体进行DNA测序，并推导出这些噬菌体上插入的外源氨基酸序列；将筛选出的特异性多肽噬菌体与其它人肿瘤细胞及正常细胞进行体外共培养，检测多肽噬菌体的细胞肿瘤特异性；根据多肽序列和细胞特异性检测结果，人工合成具有肿瘤靶向性的多肽。本发明具有作为乳腺癌靶向性基因治疗的特异性载体的潜在临床应用价值。还为以后其他种类的恶性肿瘤细胞株的亲和特异性多肽的筛选提供强有力的技术支持。此外，该多肽仅含9-11个氨基酸残基，合成容易，并且空间位置变化相对较小，易于对多肽进行质量控制，使用方便。
文档编号G01N33/68GK101768210SQ20101013150
公开日2010年7月7日 申请日期2007年10月29日 优先权日2007年10月29日
发明者刘为青, 刘流, 张克健, 董坚, 陈明清 申请人:昆明医学院第一附属医院