专利名称：宫颈癌细胞和/或组织的鉴别染色的试剂盒和方法
宫颈癌细胞和/或组织的鉴别染色的试剂盒和方法发明领域和背景本发明在其某些实施方案中涉及宫颈癌细胞和/或组织的鉴别染色的试剂盒和方法。宫颈癌是全世界第二常见的女性癌症，是不发达国家女性癌症相关死亡的主要原因。估计世界范围内每年确诊大约473，000例宫颈癌，每年约253，500例死亡。通过宫颈阴道涂片对人群的常规宫颈癌筛查显著降低西方国家宫颈癌的发病率。 在美国，1998年约12，800名女性被诊断为宫颈癌，约4，800例死于该疾病。美国的发病率 (每年每100，000名女性有7个新病例)和死亡率约为世界其它地区的一半。2003年在中国中西部地区实施的流行病学研究表明，宫颈癌正成为农村妇女的主要健康风险，每年诊断的宫颈癌接近100，000例，2001年大约20，000例死亡。宫颈癌因宫颈细胞逐渐异常变化而在宫颈衬层(lining)中发生。变化包括低级别、中级别或高级别宫颈上皮内瘤形成(CIN)、低级别或高级别鳞状上皮内病变(SIL)及在宫颈癌、原位癌或浸润性癌之前的病况。浸润性宫颈癌包括约80%鳞状细胞癌(SCC)和约 20%腺癌。宫颈阴道涂片是来自女性生殖道的刮片，其旨在能够诊断多种异型类型、某些瘤形成性质、其它恶变前性质或其它病理学过程。必须将所有类型细胞样品转移至载玻片、处理并染色，以便能够借助光学显微镜观察。目前，诊断细胞学通常基于相当有限的一组染色方法及组合物，例如醇固定的帕帕尼科拉乌(Papanicolaou)染剂和风干的梅格吉(May-Grunwald-Giemsa)染剂(其一种版本称为罗曼诺夫斯基(Romanowsky)染剂)，而较少使用苏木精和伊红染色、用于内分泌细胞学的Siorr氏染色和Pappenheim方法。最初开发帕帕尼科拉乌染色方法用于阴道涂片分析[Papanicolaou和Traut， Am. Y. Obst. Gynecol. (1941) 42 :193-206 ；帕帕尼科拉乌“脱落细胞学图解(Atlas of Exfoliative Cytology) "Cambridge,MA :Harvard University Press (1954)],该方法使得可用正常细胞和肿瘤细胞详细的细胞核和细胞质的形态学，来区分存在于醇固定涂片中的复层和单层上皮的细胞类型。然而，帕帕尼科拉乌染色程序以及所有其它细胞学染色程序， 对恶性细胞不显示任何着色选择性，且借助细胞形态学解释来进行病理相关特征评价，而这通常需要具有资质的经验丰富的细胞病理学家。在许多情况下经典细胞学技术得到以下类别技术的补充，所述技术基于高亲和力和特异性的化合物，称为免疫组织化学、免疫细胞化学或原位杂交。这些技术用于检测具有预后价值的肿瘤标记物(例如P16INK4A和P14ARF标记物、pl6蛋白)，也用于检测其它致瘤表达特征和核酸序列。PCT公开号W02007/102146揭示了用印度榕(Ficus elastica)植物提取物或其活性成分染色或预染色细胞的方法，其用于癌症或代谢疾病的诊断。
发明概要
按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈细胞样品染色的方法，所述方法包括(i)使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触；(ii)用新品红对宫颈细胞样品染色；和(iii)用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色，藉此对宫颈细胞样品染色。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的方法，所述方法包括(a)按照本发明方法对受试者宫颈细胞样品染色，藉此获得染色的宫颈细胞样品；和(b)鉴定宫颈细胞样品的至少一种宫颈细胞具有在预定阈值之上的红色细胞质，其中存在具有在预定阈值之上的红色细胞质的至少一种宫颈细胞，表明与正常宫颈细胞相比未分化或低分化的细胞，藉此诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。按照本发明某些实施方案，本发明方法进一步包括(c)分析具有在预定阈值之上的红色细胞质的至少一种宫颈细胞的形态学，其中在具有预定阈值之上的红色细胞质的相同细胞中，存在与正常宫颈细胞的形态学相比异常的形态学，表明恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括检测宫颈细胞样品的至少一种宫颈细胞中的宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平，其中宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平在预定阈值之上，分别表明该至少一种宫颈细胞为恶性细胞或恶变前的细胞，藉此鉴定宫颈恶性或宫颈恶变前细胞。按照本发明的某些实施方案，在相同宫颈细胞样品中存在被鉴定为未分化或低分化细胞的至少一种宫颈细胞，和存在表现出在预定阈值之上的宫颈恶性或宫颈恶变前标记物的表达水平的至少一种宫颈细胞，表明受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的阳性诊断。按照本发明的某些实施方案，在相同宫颈细胞样品中存在具有异常形态学的至少一种宫颈细胞，存在被鉴定为未分化或低分化细胞的至少一种宫颈细胞，和存在表现出在预定阈值之上的宫颈恶性或宫颈恶变前标记物的表达水平的至少一种宫颈细胞，表明受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的阳性诊断。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈组织切片染色的方法，所述方法包括(i)使宫颈组织切片与印度榕植物提取物接触；(ii)用新品红对宫颈组织切片染色；和(iii)用亮绿或固绿对宫颈组织切片染色，藉此对宫颈组织切片染色。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈涂片染色的方法，所述方法包括⑴使宫颈涂片与印度榕植物提取物接触；和( )用新品红对宫颈涂片染色；和(iii) 用亮绿或固绿对宫颈涂片染色，藉此对宫颈涂片染色。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈细胞单层染色的方法，所述方法包括(i)使宫颈细胞单层与印度榕植物提取物接触；(ii)用新品红对宫颈细胞单层染色；和(iii)用亮绿或固绿对宫颈细胞单层染色，藉此对宫颈细胞单层染色。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈组织样品染色的方法，所述方法包括(a)使宫颈组织样品在二甲苯中脱蜡；和随后(b)在乙醇中洗涤宫颈组织样品；和随后(c)在水中洗涤宫颈组织样品；和随后(d)用苏木精对宫颈组织样品染色；和随后(e) 在水中洗涤宫颈组织样品；和随后(f)使宫颈组织样品与印度榕植物提取物接触；和随后 (g)在水中洗涤宫颈组织样品；和随后(h)用新品红对宫颈组织样品染色；和随后(i)在水中洗涤宫颈组织样品；和随后(j)在乙醇溶液中孵育宫颈组织样品；和随后(k)用亮绿或固绿对宫颈组织样品染色；和随后(1)用水洗涤宫颈组织样品，藉此对宫颈组织样品染色。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈涂片染色的方法，所述方法包括(a)在三氯乙酸(TCA)溶液中固定宫颈涂片；和随后(b)在水中洗涤宫颈涂片；和随后 (c)用苏木精对宫颈涂片染色；和随后(d)在水中洗涤宫颈涂片；和随后(e)使宫颈涂片与印度榕植物提取物接触；和随后(f)在水中洗涤宫颈涂片；和随后(g)用新品红溶液孵育宫颈涂片；和随后(h)在水中洗涤宫颈涂片；和随后(i)在乙醇溶液中孵育宫颈涂片；和随后(j)在水中洗涤宫颈涂片；和随后(k)用亮绿或固绿对宫颈涂片染色；和随后(1)用水洗涤宫颈涂片，藉此对宫颈涂片染色。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈细胞单层染色的方法，所述方法包括(a)在三氯乙酸(TCA)溶液中固定宫颈细胞单层；和随后(b)在水中洗涤宫颈细胞单层；和随后(c)用苏木精对宫颈细胞单层染色；和随后(d)在水中洗涤宫颈细胞单层；和随后(e)使宫颈细胞单层与印度榕植物提取物接触；和随后(f)在水中洗涤宫颈细胞单层； 和随后(g)用新品红对宫颈细胞单层染色；和随后(h)在水中洗涤宫颈细胞单层；和随后 (i)在乙醇溶液中孵育宫颈细胞单层；和随后(j)在水中洗涤宫颈细胞单层；和随后(k)用亮绿或固绿对宫颈细胞单层染色；和随后(1)用水洗涤宫颈细胞单层；和随后(m)在乙醇溶液中洗涤宫颈细胞单层；和随后(η)用水洗涤宫颈细胞单层，藉此对宫颈细胞单层染色。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括检测宫颈细胞样品、宫颈涂片、宫颈组织切片或宫颈细胞单层的至少一种宫颈细胞中的宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平，其中宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物表达水平在预定阈值之上，分别表明所述至少一种宫颈细胞为恶性细胞或恶变前细胞，藉此鉴定宫颈恶性细胞或宫颈恶变前细胞。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的方法，所述方法包括(a)按照本发明方法对受试者的宫颈细胞样品染色，藉此获得染色的宫颈细胞样品；(b)鉴定宫颈细胞样品中至少一种宫颈细胞具有在预定阈值之上的红色细胞质，其中存在具有在预定阈值之上的红色细胞质的至少一种宫颈细胞，表明与正常宫颈细胞相比未分化或低分化的细胞，藉此诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。按照本发明某些实施方案，其中在相同宫颈细胞样品中存在以下细胞表明受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的阳性诊断按照本发明某些实施方案方法鉴定为未分化或低分化细胞的至少一种宫颈细胞；和按照本发明某些实施方案方法表现出宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平在预定阈值之上的至少一种宫颈细胞。按照本发明某些实施方案，其中在相同宫颈细胞样品中存在以下细胞表明受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的阳性诊断按照本发明某些实施方案方法具有异常形态学的至少一种宫颈细胞；按照本发明某些实施方案方法被鉴定为未分化或低分化细胞的至少一种宫颈细胞；和按照本发明某些实施方案方法表现出宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平在预定阈值之上的至少一种宫颈细胞。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括在用新品红染色之前，用酶消化宫颈细胞样品、宫颈涂片、宫颈细胞单层或宫颈组织切片中的粘蛋白。
按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用以可与通过用新品红、亮绿和固绿获得的颜色相区别的颜色对粘蛋白鉴别染色的物质，对宫颈细胞样品、宫颈涂片、宫颈细胞单层或宫颈组织切片染色。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用包含抗氧化剂的封固剂对染色的宫颈细胞样品、宫颈涂片、宫颈细胞单层或宫颈组织切片进行封固。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供用于对宫颈细胞样品染色和/或诊断宫颈恶变前肿瘤或恶性肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括包装印度榕植物提取物、新品红和亮绿的包装材料。按照本发明某些实施方案的一个方面，提供用于对宫颈细胞样品染色和/或诊断宫颈恶变前肿瘤或恶性肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括包装印度榕植物提取物、新品红和固绿的包装材料。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用苏木精对宫颈细胞样品染色。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用苏木精对宫颈组织切片染色。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用苏木精对宫颈涂片染色。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用苏木精对宫颈细胞单层染色。按照本发明某些实施方案，步骤(i)在步骤(iii)之前进行。按照本发明某些实施方案，步骤⑴在步骤(ii)之前进行。按照本发明某些实施方案，与印度榕植物提取物接触在用亮绿对宫颈细胞样品染色之前进行。按照本发明某些实施方案，与印度榕植物提取物接触在用新品红对宫颈细胞样品染色之前进行。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括(C)分析具有在预定阈值之上的红色细胞质的至少一种宫颈细胞的形态学，其中具有在预定阈值之上的红色细胞质的细胞中存在与正常宫颈细胞形态学相比异常的形态学，表明恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。按照本发明某些实施方案，恶变前宫颈肿瘤选自上皮内瘤形成(CIN)、鳞状上皮内病变(SIL)。按照本发明某些实施方案，恶性宫颈肿瘤选自原位癌和浸润性癌。按照本发明某些实施方案，浸润性癌选自鳞状细胞癌(SCC)和腺癌。按照本发明某些实施方案，宫颈细胞样品选自宫颈组织切片、宫颈涂片和宫颈细胞单层。按照本发明某些实施方案，用苏木精染色在与印度榕植物提取物接触之前进行。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括在与印度榕植物提取物接触之前固定宫颈样品、宫颈涂片或宫颈细胞单层。按照本发明某些实施方案，用选自三氯乙酸(TCA)、乙醇和甲醇的固定剂来进行固定。按照本发明某些实施方案，宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物选自ki67抗原 (通过单克隆抗体Ki-6鉴定的抗原)、低氧诱导因子1- α (HIF-1 α ) ,Id-I (分化/DNA结合抑制剂-1)、pl6INK4a(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A)、p21WAFl/CIPl、Tn抗原(Tn-Ag)、P53和增殖细胞核抗原(PCNA)。按照本发明某些实施方案，宫颈单层没有血细胞。按照本发明某些实施方案，宫颈单层为Thinft^p 样品。按照本发明某些实施方案，宫颈单层为液体基细胞学样品。按照本发明某些实施方案，印度榕植物提取物选自粗印度榕植物提取物、C23H44O4 和原花色素。按照本发明某些实施方案，试剂盒进一步包括用于对宫颈细胞样品染色和/或诊断受试者中的宫颈恶变前或恶性肿瘤的使用说明书。按照本发明某些实施方案，用高亲和力物质进行宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平的检测。按照本发明某些实施方案，高亲和力物质为与宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物特异性结合的抗体。按照本发明某些实施方案，高亲和力物质为多核苷酸，所述多核苷酸选自与编码宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的RNA特异性杂交的多核苷酸；和特异性扩增宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的多核苷酸。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等价的方法和材料可用于本发明实施方案的实施或测试，但以下阐述例示性的方法和/或材料。在发生矛盾的情况下，以包括定义在内的本专利说明书为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为阐明性的，并非意欲必然地限制。附图简述本文仅通过举例参照附图阐述本发明的一些实施方案。现在具体详细地提及附图，强调显示的细节通过实例显示并用于本发明实施方案的阐明性论述目的。在这点上，描述连同附图使本领域技术人员明了可如何实施本发明实施方案。在附图中图IA-B为描述通过实施例1所述的本发明某些实施方案的染色方法(
图1A)或通过H&E染色(图1B)染色的上皮细胞的正常宫颈活检组织学切片的图像。注意图IA中的蓝色/绿色细胞质，其为本发明染色方法的诊断细胞区室。图2A-B为描述通过实施例1所述的本发明染色方法(图2A)或H&E染色(图2B) 染色的宫颈上皮内瘤形成(CI^)的宫颈活检组织学切片的图像。图3A-B为描述通过实施例1所述的本发明染色方法(图3A)或通过H&E染色(图 3B)染色的宫颈鳞状细胞癌的宫颈活检组织学切片的图像。图4A-D为自宫颈癌患者获得的宫颈涂片的图像，其通过实施例2所述的本发明染色方法(图4A-B)或通过Pap染色(图4C-D)来染色。图4A和C-物镜放大倍数x20。图 4B和D-物镜放大倍数x4。应该注意本文提供的所有显微镜图像目镜放大倍数为xlO。在图4Α-Β中，各图中的箭头指向鳞状细胞癌细胞(两种不同放大倍数下的相同细胞)。图5A-D为自宫颈癌患者获得的宫颈Thinft^p 样品图像，其通过实施例3所述的本发明染色方法(图5A和C)或通过Pap染色(图5B和D)来染色。宫颈细胞单层制备物含有高级别鳞状上皮内病变的细胞(图5A、B，参见指向高级别SIL(HSIL”)的箭头)以及低级别鳞状上皮内病变的细胞(图5C、D，参见指向低级别SIL(LSIL)的箭头)。Pap制备物中细胞的细胞质颜色是可变的，并且与细胞形态学不相关。在用本发明方法染色的样品中，正常细胞的细胞质染为绿色，而畸形细胞具有淡红色的细胞质。图6A-F为自健康(正常对照)受试者获得的宫颈Thinft^p 样品的图像，其通过实施例3所述的本发明方法(图6A、B、C)或通过Pap染色(图6D、E、F)来染色。图6A和 D-物镜放大倍数x4 ；图6B和E-物镜放大倍数x20 ；图6C和F-物镜放大倍数x40。宫颈细胞单层制备物仅含有正常细胞。Pap制备物中的细胞质颜色是可变的，如不同放大倍数下所示。在按照本发明染色方法染色的样品中，正常细胞细胞质染为绿色，其中在不同放大倍数下均可见均勻图案。图6C中的箭头指向正常表层鳞状细胞。图7A-F为宫颈Thinft^p 样品的图像，其描绘通过实施例3所述的本发明某些实施方案染色方法(图7A、B、C;图7B和7C中的箭头指向低级别鳞状上皮内病变细胞)或通过Pap染色(图7D、E、F;图7E和7F中的箭头指向低级别鳞状上皮内病变细胞)来染色的低级别鳞状上皮内病变。图7A和D-物镜放大倍数x4 ；图7B和E-物镜放大倍数x20 ；图 7C和F-物镜放大倍数x40。通过Pap染色来染色的细胞中的细胞质颜色是可变的，并且与细胞形态学不相关。Pap染色的载玻片中畸形细胞的鉴定仅在高(x20)物镜放大倍数下是可能的。在按照本发明染色方法染色的样品中，正常细胞的细胞质染为绿色，而畸形细胞具有淡红色细胞质。此外，因为正常细胞通常染为绿色，因此疑似染成红色的细胞的鉴定即使在低(x4)物镜放大倍数下也是可行的，并通过较高放大倍数下的形态学分析予以证实。 注意在按照本发明某些实施方案染色方法染色的宫颈细胞单层中如何容易地观察并检测低级别鳞状上皮内病变细胞。图8A-D为正常宫颈活检组织学切片的图像，其通过实施例1所述的本发明某些实施方案的染色方法(图8A和B)或H&E染色(图8C和D)来染色。按照本发明某些实施方案染色方法染色的载玻片表现出正常宫颈上皮的均勻绿色染色，其如低物镜放大倍数 (xlO ；图8A)和高物镜放大倍数(x40 ；8B)下所见。高放大倍数显示类似于H&E染色(图 8C，xlO物镜放大倍数；图8D，x40物镜放大倍数)的清晰形态学特征。图9A-D为宫颈活检组织学切片的图像，其描绘通过实施例1所述的本发明染色方法(图9A和B ；注意图9B中用黑色箭头标记的鳞状细胞癌细胞)或通过H&E染色(图9C 和D)来染色的SCC。注意在按照本发明染色方法染色的载玻片中，含有红色染色细胞的完整浸润性上皮在低物镜放大倍数(x4，图9A)下可见，且在高物镜放大倍数(x40，图9B)下有清晰的形态学特征。平行的H&E染色的载玻片(图9C，x4物镜放大倍数；和图9D，x40物镜放大倍数)确证正确的诊断。图IOA-D为描绘通过实施例1所述的本发明染色方法(图IOA和B)或通过H&E 染色(图IOC和D)染色的高级别CIN3发育不良的宫颈活检组织学切片的图像。按照本发明方法染色的载玻片在低物镜放大倍数(xlO物镜放大倍数，图10A)下显示含有红色染色细胞的完整上皮，且在高物镜放大倍数(x40物镜放大倍数，图IOB ；注意图IOb中黑色箭头所示的CIN3发育不良细胞)下显示清晰的形态学特征。平行的H&E染色载玻片(图10C， xlO物镜放大倍数；图10D，x40物镜放大倍数)确证正确的诊断。图IlA-D为描绘通过实施例1所述的本发明染色方法(图IlA和B)或通过H&E 染色(图IlC和D)来染色的中级别CIN2发育不良区域的宫颈活检组织学切片的图像。按照本发明染色方法染色的载玻片在低放大倍数(xlO物镜放大倍数，图11A)下显示红色细胞在上皮区域中占优势。用高放大倍数(x40物镜放大倍数，图IlB ；注意黑色箭头所示的 CIN2发育不良细胞)可在上皮外层观察到从红色(异常)到蓝色(正常)的细胞质细胞染色的清晰转变，这使得可正确分级。平行的H&E染色载玻片(图11C，x10物镜放大倍数； 及图11D，x40物镜放大倍数)确证正确的诊断。图12A-D为描绘通过实施例1所述的本发明某些实施方案的染色方法(图12A和 B)或通过H&E染色(图12C和D)染色的低级别Cim发育不良的宫颈活检组织学切片的图像。按照本发明染色方法染色的载玻片显示延伸到基底区域的细胞的红色染色，其在低物镜放大倍数(xlO，图12A)和高物镜放大倍数(x40，图12B ；注意相对于图12B的正常鳞状细胞的发育不良细胞)都明显。从红色(异常)到蓝色(正常)细胞的转变使得能够正确分级。平行的H&E染色载玻片(图12C，xlO物镜放大倍数；和图12D，x40物镜放大倍数) 确证正确的诊断。图13A-D为描绘通过实施例1所述的本发明染色方法(图13A和B)或通过H&E 染色(图13C和D)染色的低级别Cim发育不良的宫颈活检组织学切片的图像。按照本发明染色方法染色的载玻片显示延伸到基底区域的细胞的红色染色，其在低物镜放大倍数 (xio,图13A)和高物镜放大倍数(X40，图13B ；注意相对于图1 的正常鳞状细胞的发育不良细胞)下都明显。从红色(异常)到蓝色(正常)细胞的转变使得能够正确分级。在平行的H&E染色区域(图13C，xlO物镜放大倍数；和图13D，x40物镜放大倍数)中，这些细微变化不容易被检测到，可能经常被误诊。图14为根据以下实施例部分中的实施例4所述的方法染色的常规宫颈涂片的图像。注意正常表层宫颈细胞染为绿色。亦存在低级别发育不良细胞(LSIL)簇。LSIL细胞有红色细胞核颜色和粉红色细胞质。物镜放大倍数X20。图15为根据以下实施例部分中的实施例4所述的方法染色的常规宫颈涂片的图像。注意正常表层宫颈细胞染为绿色。亦存在高级别发育不良细胞(LSIL)簇。HSIL细胞有红色细胞核颜色和粉红色细胞质。物镜放大倍数X20。图16为根据以下实施例部分中的实施例4所述的方法染色的常规宫颈涂片的图像。注意鳞状细胞癌(SCC)细胞簇存在于涂片中。SCC细胞有红色细胞核颜色和粉红色细胞质。物镜放大倍数X20。图17为液体基宫颈单层细胞样品(Thinft^p )的图像，其根据以下实施例部分中的实施例5所述的方法染色，其中使用固绿代替亮绿。注意高级别发育不良细胞(HSIL)簇存在于样品中。HSIL细胞有红色细胞核颜色和粉红色细胞质。物镜放大倍数X40。图18为自Thinft^p 载玻片获得的宫颈内细胞的图像，其按照本发明某些实施方案的方法来染色。注意宫颈内细胞的典型形态学特征。物镜放大倍数X40。图19为示意性阐明以下实施例部分中的实施例1所述的研究的图。用H&E染色和本发明某些实施方案染色方法来进行宫颈组织切片样品的组织学评价。由两位独立的病理学专家检查(review)每张染色的载玻片，然后比较由两种方法作出的诊断。图20为示意性阐明以下实施例部分中的实施例3所述的研究的图。邀请患者到阴道镜门诊以通过疑似Pap测试随访。从每位患者重新得到组织活检用于制备组织学载玻片(H&E染色)，重新得到液体基宫颈样品用于制备Thirfrep 载玻片和用于HPV测试(在液体中)。按照本发明某些实施方案染色方法和按照帕帕尼科拉乌染色方法对Thirfrep 载玻片进行染色。然后比较所有测试结果。图21为显示用帕帕尼科拉乌染剂染色的宫颈内细胞的现有技术照片(Diane Solomon，Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions, criteria and explanatory notes (才艮告宫颈细胞学的Bethesda系统，定义、 标准和注释)；第二版，2004,第12页)。图22为显示用帕帕尼科拉乌染剂染色的ASC-US细胞[常规涂片制备物(CP)]的现有技术照片(Diane Solomon，Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions, criteria and explanatory notes (才艮告宫颈细胞学的 Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版，2004，第70页)。图M为显示用帕帕尼科拉乌染剂染色的低级别鳞状上皮内病变[LSIL，常规制备物(CP)]的现有技术照片(Diane Solomon, Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions, criteria and explanatory notes (J 艮告宫颈细胞学的Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版，2004，第92页)。图M为显示用帕帕尼科拉乌染剂染色的高级别鳞状上皮内病变(LSIL，CP，常规制备物)的现有技术照片(Diane Solomon, Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions,criteria and explanatory notes ( J艮告颈细胞学的Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版，2004，第101页)。图25为显示用帕帕尼科拉乌染剂染色的鳞状细胞癌角质化细胞[液体基制备物 (LBP)]的现有技术照片(Diane Solomon, Ritu Nayar,编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions,criteria and explanatory notes ( J艮告颈细胞学的Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版，2004，第117页)。图沈为显示用帕帕尼科拉乌染剂染色的鳞状细胞癌非角质化细胞[常规涂片制备物(CP)]的现有技术照片(Diane Solomon,Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions,criteria and explanatory notes ( J艮告颈细胞学的Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版，2004，第117页)。图27为显示用苏木精-伊红(H&E)染剂染色的CIN3细胞(组织学，组织切片)的现有技术照片(Diane Solomon, Ritu Nayar,编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions, criteria and explanatory notes (才艮告宫5页细胞学白勺 Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版，2004，第101页)。图28为通过H&E染色的组织学组织切片的照片，其显示存在CIN2发育不良细胞。图四为通过H&E染色的组织学组织切片的照片，其显示存在非角质化SCC (鳞状细胞癌)细胞。本发明特定实施方案的阐述本发明在其某些实施方案中涉及用于宫颈癌细胞鉴别染色的方法和试剂盒及其在宫颈癌诊断中的用途。在详细解释本发明至少一个实施方案之前，应该理解本发明在其应用中不必然地限制于以下阐述提出的或通过实施例列举的细节。本发明可有其它实施方案或以不同方式实施或执行。
本发明者发现对宫颈癌细胞或宫颈癌前细胞鉴别染色的新方法。如以下实施例部分中所显示，使用本发明新方法对宫颈生物学样品中的癌细胞或癌前细胞鉴别染色，所述宫颈生物学样品例如宫颈组织切片(实施例1，图1A-B、2A-B、 3A-B、8A-D、9A-D、10A-D、1 IA-D、12A-D、13A-D 和 19 及表 3、4、5 和 6)、常规宫颈涂片(实施例2，图4A-D及表7和8)或液体基细胞单层宫颈样品(例如Thinft^p 载玻片；图20、 5A-D、6A-F、7A-F 及表 9 和 10)。例如，当 1 级(CIN1 ；图 12A-B)、2 级(CIN2 ；图 11A-B)或 3 级(CIN3 ；图10A-B)恶变前宫颈上皮内瘤形成的细胞质或SCC的细胞质(图9A-B)被染为红色时，正常宫颈细胞的细胞质被染为绿色(图1A-B)。此外，因为本发明某些实施方案的新染色方法保存样品中细胞的特征形态学，所以它能够使癌细胞或癌前细胞正确分级(图 11A-D)。另外，发现本发明的方法优于宫颈涂片筛查中的常规Pap染色，因为即使在低放大倍数(例如用x4物镜放大倍数)下本发明方法也能够检测癌细胞，而在低放大倍数下在常规Pap染色的宫颈涂片中癌细胞之间不会出现任何差别(实施例2，图4A-D)，且与帕帕尼科拉乌染色方法相比，本发明方法表现出增强的灵敏性，与HPV测试相比表现出提高的特异性(表10;实施例3)。此外，如以下实施例部分的实施例3所示，本发明者用本发明某些实施方案的新方法，正确地诊断了液体基Thirfrep 样品中的低级别(图7A-F)或高级别 (图5A-B)鳞状上皮内病变，这显示本发明方法在用非侵入方法诊断宫颈癌及对宫颈癌分期方面的强大筛查能力。另外，如实施例4所述和图14-16所示，本发明者能够用本发明某些实施方案的新染色方法染色的常规宫颈涂片，来鉴定低级别发育不良细胞(LSIL)、高级别发育不良细胞(HSIL)和鳞状细胞癌(SCC)。此外，如图17所示和如实施例5所述，用榕属提取物、新品红和固绿染色的新组合，本发明者能够鉴定液体基宫颈单层样品中的高级别发育不良细胞(HSIL)。因此，按照本发明某些实施方案的一个方面，提供对宫颈细胞样品染色的方法。所述方法通过以下步骤来进行(i)使宫颈细胞样品与印度榕(Ficus elastics)植物提取物接触；(ii)用新品红对宫颈细胞样品染色；和(iii)用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色，藉此对宫颈细胞样品染色。本文使用的短语"宫颈细胞"，指从宫颈分离的单个细胞或多个细胞。可使用单个细胞或聚集物。宫颈细胞样品可为包含宫颈细胞、宫颈细胞系、宫颈细胞的原代培养物或未培养的细胞样品的任何生物学样品，未培养的细胞样品从组织活检(切开活检、切除活检或完全切除)获得，或用半侵入式或非侵入式采样方法获得，所述采样方法例如用诸如刷子、宫颈洗涤或灌洗等收集装置自宫颈、宫颈外部和/或自宫颈内管重新得到细胞。按照本发明某些实施方案，宫颈细胞样品包含宫颈上皮细胞。宫颈上皮细胞的非限制性实例包括鳞状上皮细胞、腺上皮细胞和化生上皮细胞。 鳞状细胞源自外宫颈和阴道；腺细胞源自宫颈内膜；化生细胞源自宫颈变性带。应该注意宫颈细胞样品也可包含宫颈内细胞。按照本发明某些实施方案，通过基于已知形态学特征的细胞的形态学评价，对存在于宫颈细胞样品中的细胞进行鉴定和/或分类(为不同细胞类型)，这将在下文进一步阐述。按照本发明某些实施方案，宫颈细胞样品为宫颈组织切片(例如石蜡组织切片、冷冻组织、从宫颈组织活检获得的冷冻切片)、宫颈涂片或宫颈细胞单层(例如液体基样品，例如ThinPi^p 样品)。本文所用短语"宫颈组织切片"，指具有约1-200微米厚度的宫颈组织切片。按照本发明某些实施方案，组织切片具有约2微米-约50微米的厚度，例如约2 微米-约20微米，例如约2微米-约10微米，例如约4-5微米，例如4微米。本文所用短语"宫颈涂片"指宫颈的粗细胞样品，其无任何纯化地涂在显微镜载玻片上。本文所用短语"宫颈细胞单层"指在显微镜载玻片上形成单层宫颈细胞的宫颈细胞样品。按照本发明特定实施方案，宫颈细胞单层不包含免疫细胞。按照本发明某些实施方案，宫颈单层没有红细胞。按照本发明某些实施方案，宫颈单层没有任何血细胞。按照本发明某些实施方案，宫颈单层包含当置于载玻片上时相互之间不重叠的宫颈细胞，因此每个细胞有清晰的细胞界限，获得每个细胞的清晰的显微图。宫颈细胞样品可包含同种或异种细胞群(例如不同分化状态的细胞)。通常宫颈细胞样品包含异种细胞群。例如，宫颈细胞样品可包含恶性细胞或恶变前细胞以及正常健康细胞。备选地，宫颈细胞样品可包含代谢正常的细胞和代谢受损的细胞。另外或作为备选，宫颈细胞样品可包含炎性细胞、恶变前细胞、恶性细胞和/或正常健康细胞。按照本发明的优选配置，将宫颈细胞样品置于显微镜载玻片上。使细胞贴壁到显微镜载玻片的方法在本领域众所周知，包括例如使细胞在显微镜载玻片上分层，使载玻片上的细胞离心(例如使用细胞离心涂片器)，在载玻片上封固组织切片(例如使用石蜡包埋切片)，或在显微镜载玻片上涂细胞。包括宫颈细胞样品的显微镜载玻片本身即可使用，或可用增加细胞与载玻片粘附性的物质(例如聚-L-赖氨酸或硅烷)预包被。可将载玻片加热、冷冻或使其经受特定波长(例如紫外线)，以便增加细胞与载玻片的粘附性。应该注意，视所用的样品而定，可在染色之前用固定剂固定宫颈细胞样品。固定细胞的方法在本领域众所周知，包括使用诸如多聚甲醛、戊二醛、乙酸、三氯乙酸等等固定剂。本文所用术语"染色"指在视觉上突出显示细胞或其亚细胞结构。按照本发明某些实施方案，用染色剂和染色条件进行宫颈细胞样品染色，所用染色剂和染色条件使得能够与正常(健康)或炎性细胞成对比地对恶变前或恶性宫颈癌细胞鉴别染色。本文所用短语"鉴别染色"，指用某些颜色对癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞的特定细胞区室(例如细胞质)染色，而样品中其它(例如正常细胞或炎性细胞)宫颈细胞的相同细胞区室不被染色。如所述，为了对宫颈细胞样品染色，使样品与印度榕植物提取物接触。本文所用短语"印度榕植物提取物"，指该植物的至少活性成分[例如黄酮类 (flavinoids)的低聚物形式(其可包含2_10聚体，例如C26H32O15)或聚合物形式(C23H44O4) 或原花色素]或粗植物提取物，只要保留其特征染色能力即可。可从植物的不同部分(例如树叶)制备印度榕植物提取物。树叶提取制备物的指南在以下实施例部分的实施例1的实验详情一节中提供。按照本发明某些实施方案，本发明的印度榕植物提取物是印度榕植物的乙醇粗提取物。印度榕植物的乙醇提取物可包含约10% (ν/ν乙醇/水)、约20%、约30%、约40%、 约50%乙醇、约60%乙醇、约70%乙醇、约80%乙醇、约90%乙醇或约100%乙醇。然而， 应该采取措施使不过度稀释提取物，因为这可影响随后的染色。可通过将印度榕植物提取物施用于宫颈细胞样品上，或通过在含有印度榕植物提取物的容器中浸入、浸泡和/或孵育宫颈细胞样品，使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触。按照本发明某些实施方案，使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触持续一段时间，这段时间使得能够预处理癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞，以便它们可通过随后用新品红染色来鉴别染色。按照本发明某些实施方案，使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触持续至少约 1分钟，例如约2分钟，例如约2-20分钟，例如约2-10分钟，例如约2-6分钟，例如约2_4分钟。如所述，本发明该方面的方法包括用碱性染料新品红对宫颈细胞样品染色。按照本发明某些实施方案，新品红将用印度榕植物提取物预处理的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞(未分化细胞)染为红色，而留下其它细胞(正常的分化细胞)不染色。按照本发明某些实施方案，新品红将用印度榕植物提取物预处理并用固绿或亮绿染色的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞(未分化细胞)染为红色，而留下其它细胞(正常的分化细胞)不染色。按照本发明某些实施方案，新品红将用印度榕植物提取物预处理的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞(未分化细胞)的细胞质染为红色，而留其它细胞(正常的分化细胞)的细胞质不染为红色。按照本发明某些实施方案，新品红将用印度榕植物提取物预处理并用固绿或亮绿染色的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞(未分化细胞)的细胞质染为红色，而留下其它细胞 (正常的分化细胞)的细胞质不染为红色。按照本发明某些实施方案，新品红将用印度榕植物提取物预处理的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞(未分化细胞)的细胞核染为红色。按照本发明某些实施方案，新品红将用印度榕植物提取物预处理的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞(未分化细胞)的细胞核染为红色，而留下其它细胞(正常的分化细胞)的细胞核不染为红色(例如染为红色以外的其它颜色)。按照本发明某些实施方案，存在红色细胞核表明细胞疑似癌细胞或恶变前细胞。 在这种情况下，随后的细胞形态学评价可确证细胞的鉴定，并帮助诊断受试者中的癌症或恶变前病变。按照本发明某些实施方案，在使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触之后，进行用新品红的染色。可自不同厂商例如Sigma(目录号Ν0638)、Fluka(目录号72200)或Merck(目录号1052260100)获得粉末形式的新品红。可在以下浓度下使用新品红至少约0. 05% [重量/体积(w/v)]、至少约0. 1%(w/v)、至少约 0. 2% (w/v)、至少约 0. 3% (w/v)、至少约 0. 4% (w/v)、例如约 0. 5% (w/v)、 例如约 0. 6% (w/v)、例如约 0. 7% (w/v)。新品红溶液可基于乙醇溶液，例如约5%乙醇、约10%乙醇、约15%乙醇、约20% 乙醇、约25%乙醇、约30%乙醇、约35%乙醇、约40%乙醇、约50%乙醇。按照本发明某些实施方案，本发明某些实施方案使用的新品红浓度为在20% [体积/体积(v/V)]乙醇水溶液中的约0.5% (w/v) 0可通过将新品红施用于宫颈细胞样品上或通过在含有新品红的容器中浸入、浸泡和/或孵育宫颈细胞样品，来进行用新品红对宫颈细胞样品的染色。按照本发明某些实施方案，用新品红对宫颈细胞样品染色持续一段时间，这段时间使得能够通过新品红对癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞鉴别染色。按照本发明某些实施方案，用新品红对宫颈细胞样品染色持续至少5秒，例如至少约10秒，例如至少约1分钟，例如约1-10分钟。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括在用新品红染色之前，用酶消化宫颈细胞样品(例如宫颈涂片、宫颈细胞单层或宫颈组织切片)中的粘蛋白。按照本发明某些实施方案，消化粘蛋白的酶选自神经氨酸酶(α O — 3,6)神经氨酸酶；Sigma 目录号Ν5521，Sigma-Aldrich Israel Ltd. REH0V0T ISRAEL)、粘蛋白酶和唾液酸酶(Howe, L.，International Journal of STD & AIDS，第 10 卷，第 7 期，第 442-447 页，以其整体通过引用并入本文中)。按照本发明某些实施方案，可在固定样品中的细胞之前消化粘蛋白。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用以下物质对宫颈细胞样品(例如宫颈涂片、宫颈细胞单层或宫颈组织切片)染色，所述物质可将粘蛋白鉴别染色为可与通过用新品红、亮绿和固绿染色获得的颜色相区别的颜色。按照本发明某些实施方案，所述物质为带正电荷的分子，其可与带负电荷的粘蛋白结合。这样的物质可为例如结合酸性粘多糖的阿尔新蓝(Alcian blue)。应该注意，在酸性pH(例如pH 2. 5)下，阿尔新蓝对硫酸粘多糖(硫酸粘蛋白)和羧化粘多糖(唾液粘蛋白)二者染色。应该注意，在宫颈细胞样品含有细胞聚集物(例如大于10个细胞的细胞团，例如约10-20个细胞团)的情况下，用于染色方法的染料洗涤效率较差。如所述，本发明该方面的方法包括用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色。亮绿是酸性染料，其将分化细胞(例如正常细胞)的细胞质染为绿色。固绿是酸性染料，其将分化细胞(例如正常细胞)的细胞质染为绿色。用固绿的优点是染料更稳定，不会褪色。按照本发明某些实施方案，在用新品红染色后，用亮绿或固绿染色。可自不同厂商例如Merck(C. I. 42095)或Sigma(目录号62110)获得粉末形式的亮绿。可自Sigma-Aldrich(F7258)获得粉末形式的固绿。可在以下浓度下使用亮绿至少约0.05% (w/v)、至少约0. (w/v)、至少约 0. 2% (w/v)、至少约 0.4% (w/v)、至少约 0.8% (w/v)、至少约 (w/v)、至少约 2% (w/ ν)、至少约3% (w/v)、至少约4% (w/v)、至少约5% (w/v)、至少约6% (w/v)、至少约7% (w/v)、至少约8% (w/v)、至少约9% (w/v)、至少约10% (w/v)、至少约11% (w/v)、至少约12% (w/v)、至少约 13% (w/v)、至少约 14% (w/v)、至少约 15% (w/v)、至少约 16% (w/v)、 至少约17% (w/v)、至少约18% (w/v)、至少约19% (w/v)、至少约20% (w/v) 0亮绿溶液可基于水或乙醇溶液，例如约0. 01 %乙醇、约5 %乙醇、约10 %乙醇、约15 %乙醇、约20 %乙醇、约25%乙醇、约30%乙醇、约35%乙醇、约40%乙醇、约50%乙醇、约70%乙醇。按照本发明某些实施方案，本发明方法使用的亮绿为20%乙醇中的约4% (w/v)。可在以下浓度下使用固绿至少约0.05% (w/v)、至少约0. (w/v)、至少约 0. 2% (w/v)、至少约 0.4% (w/v)、至少约 0.8% (w/v)、至少约 (w/v)、至少约 2% (w/ ν)、至少约3% (w/v)、至少约4% (w/v)、至少约5% (w/v)、至少约6% (w/v)、至少约7% (w/v)、至少约8% (w/v)、至少约9% (w/v)、至少约10% (w/v)、至少约11% (w/v)、至少约 12% (w/v)、至少约 13% (w/v)、至少约 14% (w/v)、至少约 15% (w/v)、至少约 16% (w/v)、 至少约17% (w/v)、至少约18% (w/v)、至少约19% (w/v)、至少约20% (w/v)。固绿溶液可基于水或乙醇溶液，例如约0. 01 %乙醇、约5 %乙醇、约10 %乙醇、约15 %乙醇、约20 %乙醇、约25%乙醇、约30%乙醇、约35%乙醇、约40%乙醇、约50%乙醇、约70%乙醇。按照本发明某些实施方案，本发明方法使用的固绿为20 %乙醇中的约1 % (w/v)。可通过将亮绿或固绿施用于宫颈细胞样品上，或通过在含有亮绿或固绿的容器内浸入、浸泡和/或孵育宫颈细胞样品，来进行用亮绿或固绿对宫颈细胞样品的染色。按照本发明某些实施方案，用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色持续一段时间，该段时间使能够将正常宫颈细胞(分化细胞)鉴别染色为绿色。按照本发明某些实施方案，用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色持续至少10秒，例如至少约30秒，例如至少约1分钟，例如约30秒-10分钟。按照本发明某些实施方案，本发明某些实施方案的一个方面的方法进一步包括用苏木精对宫颈细胞样品染色。用苏木精对宫颈细胞样品染色是为了复染样品中的宫颈细胞的细胞核。应该注意，将细胞核复染为蓝色增加了细胞中与细胞质染色的对比度，因此有利于检测癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞的鉴别染色。各种苏木精染料可与本发明方法一起使用，这些包括但不限于苏木精Harris溶液和苏木精Gill III。可自不同厂商例如Merck和Sigma获得苏木精。按照本发明某些实施方案，在用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色之前，使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触。按照本发明某些实施方案，在用新品红对宫颈细胞样品染色之前，使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触。按照本发明某些实施方案，在染色之前用固定剂固定宫颈细胞样品(例如宫颈涂片或宫颈细胞单层)。可使用各种固定剂溶液来固定宫颈细胞样品。例如，固定剂可为乙醇溶液、甲醇溶液、三氯乙酸(TCA)溶液、多聚甲醛溶液、福尔马林溶液和/或其任何组合。例如，甲醇和乙醇组合；乙醇和TCA组合；甲醇和TCA组合；多聚甲醛和TCA组合；福尔马林和TCA组合；多聚甲醛和乙醇组合；多聚甲醛和甲醇组合；三种上述固定剂的任何组合；四种上述固定剂的任何组合；和所有五种固定剂。应该注意，在固定剂的每种组合中，包含至少的每种固定剂，例如至少2-5%，例如包含至少1-10%的每种固定剂。
按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括用包含抗氧化剂的封固剂封固染色的宫颈细胞样品(例如宫颈涂片、宫颈细胞单层或宫颈组织切片)。应该注意，抗氧化剂的使用改善染色稳定性，并防止染色细胞中的染料褪色。可将各种已知抗氧化剂加到封固剂中。这些包括但不限于可从苹果、小麦、石榴等的提取物获得的抗氧化剂。可使用的其它已知抗氧化剂包括尿酸、鞣酸、谷胱甘肽、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、亚硫酸氢钠、没食子酸丙酯(PG)、维生素C和维生素E。加入封固剂的抗氧化剂可呈粉末、溶液、提取物和/或液体形式。Entellan是含抗氧化剂的封固剂制剂的非限制性实例，其(例如可获自 ScienceLab. Com Inc. Houston, Texas,目录号SLM31142 ；Entellan new, Rapid mounting medium for microscopy (新Entellan，用于显微镜的快速封固剂)，Merck，产品号 1079610100)。如上所述，宫颈细胞样品可以是宫颈组织样品(例如在显微镜载玻片上的石蜡包埋或冷冻宫颈组织切片)。以下是宫颈组织样品的染色方法的非限制性实例(a)在二甲苯中使宫颈组织样品脱蜡，和随后(b)在乙醇中洗涤宫颈组织样品，和随后(c)在水中洗涤宫颈组织样品，和随后(d)用苏木精对宫颈组织样品染色，和随后(e)在水中洗涤宫颈组织样品，和随后(f)使宫颈组织样品与印度榕植物提取物接触，和随后(g)在水中洗涤宫颈组织样品，和随后(h)用新品红对宫颈组织样品染色，和随后(i)在水中洗涤宫颈组织样品，和随后(j)在乙醇溶液中孵育宫颈组织样品，和随后(k)用亮绿或固绿对宫颈组织样品染色，和随后(1)用水洗涤宫颈组织样品，藉此对宫颈组织样品染色。当使用石蜡包埋的宫颈组织切片时，染色前的第一步是从组织切片中除去石蜡， 这通常使用二甲苯。在使用冷冻切片情况下，没必要使用二甲苯。然而，如果冷冻切片未 (在冷冻之前)固定，那么优选在用本发明某些实施方案的染色方法对细胞染色之前包括固定步骤。按照本发明某些实施方案，可通过在融化石蜡但尚不损害组织切片中的细胞形态学的温度下加热宫颈组织切片，接着在适合的溶剂例如二甲苯中溶解石蜡，来使宫颈组织样品脱蜡。例如，如以下实施例部分中实施例1所述，可通过以下步骤使宫颈组织切片载玻片脱蜡在70°C加热载玻片约15分钟，接着使宫颈组织切片载玻片浸入几个含有二甲苯 (例如100%二甲苯)的容器中，在每个容器中持续几分钟(例如1-15分钟，例如约1-10 分钟，例如约1-5分钟，例如约3分钟)。按照本发明某些实施方案，在与二甲苯溶液孵育后，在乙醇溶液中洗涤宫颈组织切片载玻片，这从组织切片除去过量的二甲苯。例如，可在含有100%乙醇的容器中洗涤宫颈组织切片载玻片，例如通过将载玻片浸入乙醇溶液中几次，例如1-30次，例如约20次，例如约5-10次，每次持续短的时间(例如几秒，例如约1-5秒，例如1秒)。按照本发明某些实施方案，然后在乙醇和水溶液(例如96%乙醇水溶液)中洗涤宫颈组织切片载玻片几次，例如在96%乙醇中浸入1-30次，例如约1-20次，例如约1-10 次，例如10次，每次持续几秒(例如约1-5秒，例如1秒)。按照本发明某些实施方案，为了从宫颈组织切片载玻片除去过量的乙醇，在水中洗涤载玻片，例如在流动的蒸馏水中短时间洗涤，例如约10秒-约5分钟，例如约1-2分钟， 例如约1分钟。按照本发明某些实施方案，为了复染宫颈细胞细胞核，用苏木精(例如苏木精 Harris溶液)对宫颈组织切片载玻片染色，视组织切片质量和厚度而定染色时间约10 秒-约5分钟。按照本发明某些实施方案，用苏木精溶液染色持续约一分钟。按照本发明某些实施方案，在用苏木精染色后，在水中洗涤宫颈组织切片载玻片， 例如在流动的蒸馏水中洗涤，以便从组织切片除去未结合的苏木精染料。按照本发明某些实施方案，用流水洗涤宫颈组织切片载玻片约1秒-约5分钟，例如达约1秒-约1分钟， 例如约1秒-30秒，例如约1秒-10秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，为了预处理宫颈组织切片载玻片用于随后癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞的鉴别染色，使宫颈组织切片载玻片与印度榕植物提取物溶液接触。与印度榕植物提取物溶液接触可持续至少1分钟，例如约1分钟-约10分钟的时间，例如约2 分钟-约8分钟的时间，例如约4分钟-约6分钟的时间，例如约4分钟。按照本发明某些实施方案，在与印度榕植物提取物孵育后，在水中洗涤宫颈组织切片载玻片，例如在流动的DDW中，以便从组织切片除去过量的印度榕植物提取物。在水中洗涤可为短时间洗涤，例如约1-30秒，例如约1-20秒，例如约5-10秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，然后通过在新品红溶液中孵育载玻片来用新品红对宫颈组织切片载玻片染色，孵育时间为约1-10分钟，例如约2-8分钟，例如约2-5分钟，例如约2分钟。按照本发明某些实施方案，然后用水洗涤宫颈组织切片载玻片，例如用流动的 DDff,以便除去过量的新品红染料。这样的洗涤可持续约1-20秒，例如约2-15秒，例如约 5-10秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，在水中洗涤后，在乙醇溶液中洗涤宫颈组织切片载玻片，例如约20-80%的乙醇水溶液，例如约30-60%的乙醇水溶液，例如约40-60%的乙醇水溶液，例如约50%的乙醇水溶液，洗涤时间为约10秒-约2分钟，例如达30-90秒，例如约 75秒。按照本发明某些实施方案，然后用水例如流动的DDW洗涤宫颈组织切片载玻片， 以便从宫颈组织切片除去过量的乙醇。在水中的洗涤进行短的时间(例如约1-60秒，例如约10-30秒，例如约10秒)。按照本发明某些实施方案，然后用亮绿对宫颈组织切片载玻片染色。可通过使宫颈组织切片载玻片在亮绿溶液中孵育约30-120秒、例如约30-60秒、例如约50秒，来进行用亮绿的染色。按照本发明某些实施方案，在用亮绿染色后，在水中洗涤宫颈组织切片载玻片，以便从组织切片除去过量的亮绿染料。在水中的洗涤可在流水(例如流动的DDW)中进行短的时间，例如约1-30秒，例如约5-20秒，例如约10秒。一旦染色和洗涤，就将宫颈组织切片载玻片干燥，例如通过风干，但其它干燥方式亦是可能的(例如在培养箱中或热盘上干燥)。风干载玻片可持续约10-60分钟，例如约30分钟。按照本发明某些实施方案，在显微镜评价之前，通过加入封固剂例如Entellan来用盖玻片封闭宫颈组织切片载玻片。如上所述，宫颈细胞样品可为宫颈涂片(例如迄今用于检测宫颈癌的常规宫颈涂片)。以下为宫颈涂片染色方法的非限制性实例(a)在三氯乙酸(TCA)溶液中固定宫颈细胞单层，和随后(b)在水中洗涤宫颈涂片，和随后(c)用苏木精对宫颈涂片染色，和随后(d)在水中洗涤宫颈涂片，和随后(e)使宫颈涂片与印度榕植物提取物接触，和随后(f)在水中洗涤宫颈涂片，和随后(g)使宫颈涂片与新品红溶液孵育，和随后(h)在水中洗涤宫颈涂片，和随后(i)在乙醇溶液中孵育宫颈涂片，和随后(j)在水中洗涤宫颈涂片，和随后(k)用亮绿对宫颈涂片染色，和随后(1)用水洗涤宫颈涂片，藉此对宫颈涂片染色。按照本发明某些实施方案，通过在含有TCA的溶液中孵育载玻片来固定包含在宫颈涂片载玻片中的宫颈细胞，TCA浓度范围为约5% -约20%，例如至少约6%且不多于约 20 %，例如至少约7 %且不多于约20 %，例如至少约8 %且不多于约20 %，例如至少约9 %且不多于约20%，例如至少约10%且不多于约20%，例如至少约6%且不多于约18%，例如至少约8%且不多于约16%，例如至少约8%且不多于约12%，例如至少约10%的TCA。用TCA固定剂孵育的时间可从约10分钟-约2小时不等，例如约20分钟-约90 分钟，例如约30分钟-约90分钟，例如约45分钟-约75分钟，例如约60分钟。备选地，可在乙醇或甲醇固定剂溶液中固定宫颈涂片载玻片。乙醇固定剂溶液可包含约70 % [体积/体积(ν/ν)]乙醇-约100 %乙醇，例如约75-100 %的乙醇，例如约80-100%的乙醇，例如约90-100%的乙醇，例如100%乙醇。甲醇固定剂溶液可包含约 100%甲醇。为了固定宫颈细胞，将载玻片在甲醇或乙醇固定剂溶液中孵育一段时间，例如约1-30分钟，例如约10-25分钟，例如约15-20分钟，例如约20分钟。按照本发明某些实施方案，为从宫颈涂片载玻片除去过量的固定剂(例如TCA、甲醇或乙醇)，在水中洗涤载玻片，例如在流动的蒸馏水、流动的双蒸水(DDW)或去离子水中， 洗涤短的时间，例如约1秒-约5分钟，例如约5秒-约3分钟，例如约10秒-约5分钟， 例如约1-2分钟，例如约1分钟，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，为了复染宫颈细胞细胞核，用苏木精(例如苏木精Harris溶液，或根据用于显微镜的Gill III的改良的苏木精溶液(Merck HX945424(C. 1.75290))对宫颈涂片载玻片染色，视宫颈涂片载玻片质量而定染色时间为约10秒-约20 分钟，例如约1分钟-约15分钟，例如约9分钟。按照本发明某些实施方案，用苏木精溶液染色持续约9分钟。按照本发明某些实施方案，在用苏木精染色后，在水中洗涤宫颈涂片载玻片，例如在流动的自来水中，以便从宫颈涂片载玻片除去未结合的苏木精染料。按照本发明某些实施方案，用流动的自来水洗涤宫颈涂片载玻片约10秒-约5分钟，例如约20秒-约4分钟， 例如约1-2分钟，例如约2分钟，例如约1分钟。按照本发明某些实施方案，进一步在流动的DDW、DW或去离子水中洗涤宫颈涂片载玻片约10秒。按照本发明某些实施方案，为了预处理宫颈涂片载玻片用于随后的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞的鉴别染色，使宫颈涂片载玻片与印度榕植物提取物溶液接触。与印度榕植物提取物接触可进行至少1分钟，例如约1分钟-约10分钟时间，例如约2分钟-约8分钟时间，例如约4分钟-约6分钟时间，例如约4分钟。按照本发明某些实施方案，在与印度榕植物提取物孵育后，在水中洗涤宫颈涂片载玻片，例如在流动的DDW、Dff或去离子水中，以便从组织切片除去过量的印度榕植物提取物。在水中的洗涤可为短洗涤，例如约1-30秒，例如约1-20秒，例如约5-10秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，然后可通过在新品红溶液(在乙醇中)中孵育载玻片， 来用新品红对宫颈涂片载玻片染色，孵育时间为约1-10分钟，例如约1-8分，例如约1-6分钟，例如约4分钟，例如约1分钟。新品红在乙醇溶液中的浓度可为在约5-70%乙醇水溶液 (ν/ν)中的约0. 1-5% (重量/体积(w/v))的新品红乙醇溶液。按照本发明某些实施方案，然后用水洗涤宫颈涂片载玻片，例如用流动的DDW、Dff 或去离子水，以便除去过量的新品红染料。这样的洗涤可持续约1-20秒，例如约2-15秒， 例如约5-10秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，在水中洗涤后，在乙醇溶液中洗涤宫颈涂片载玻片，例如约5-80%的乙醇水溶液、约5-70%的乙醇水溶液，例如约20-80%的乙醇水溶液，例如约 30-60%的乙醇水溶液，例如约40-60%的乙醇水溶液，例如约50%的乙醇水溶液。可通过在乙醇溶液中孵育来进行乙醇溶液中的洗涤，所述孵育通过在乙醇溶液中短暂浸入若干次来进行，例如约5-30次，例如约10-30次，例如约5-20次，例如约20次，例如约10次，其中每次浸入持续约1-3秒，例如1秒。按照本发明某些实施方案，然后用水洗涤宫颈涂片载玻片，例如用流动的DDW、Dff 或去离子水，以便从宫颈涂片除去过量的乙醇。在水中的洗涤进行短的时间(例如约1-60 秒，例如约10-30秒，例如约10秒)。按照本发明某些实施方案，然后用亮绿对宫颈涂片载玻片染色。亮绿溶液的范围可为在约0. 1-70%乙醇在水中(ν/ν)的乙醇溶液中的约0. 1-4% (w/v)亮绿，例如乙醇中的0.2%亮绿溶液，例如20%乙醇中的4%亮绿溶液。可通过在亮绿溶液中孵育宫颈涂片载玻片来进行用亮绿的染色，孵育时间为约1-10分钟，例如约2-8分钟，约5-6分钟，例如约5. 5分钟。按照本发明某些实施方案，在亮绿染色后，在水中洗涤宫颈涂片载玻片，以便从宫颈涂片除去过量的亮绿染料。在水中洗涤可在流水(例如流动的DDW、DW或去离子水)中进行短的时间，例如约1-30秒，例如约5-20秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，在流水中洗涤后，可进一步在乙醇溶液(例如范围约 5% -约70%的溶液、例如约40%的乙醇水溶液)中洗涤载玻片，其通过浸入若干次来进行 (例如约5-20次，例如约7次)，随后在流动的DDW、Dff或去离子水中洗涤约1_20秒，例如 10秒。一旦染色和洗涤，就将宫颈涂片载玻片干燥，例如通过风干约10-60分钟，例如约30分钟，用封固剂例如Eukitt或Entellan封固，并用盖玻片盖上。应该注意，在用 Entellan封固前，任选将载玻片浸入100%二甲苯中(例如1-2次)，然后用Entellan和盖玻片盖上。如上所述，宫颈细胞样品可为宫颈细胞单层，例如液体基宫颈单层。制备液体基宫颈单层的方法包括但不限于Thinft^p 方法[Hologic]或SURE PATH [Becton Dickinson(BD) 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ, USA]方法。以下是宫颈细胞单层染色方法的非限制性实例(a)在三氯乙酸(TCA)溶液中固定宫颈细胞单层，和随后(b)在水中洗涤宫颈细胞单层，和随后(c)用苏木精对宫颈细胞单层染色，和随后(d)在水中洗涤宫颈细胞单层，和随后(e)使宫颈细胞单层与印度榕植物提取物接触，和随后(f)在水中洗涤宫颈细胞单层，和随后(g)用新品红对宫颈细胞单层染色，和随后(h)在水中洗涤宫颈细胞单层，和随后(i)任选在乙醇溶液中孵育宫颈细胞单层，和随后(j)任选在水中洗涤宫颈细胞单层，和随后(k)用亮绿或固绿对宫颈细胞单层染色，和随后(1)用水洗涤宫颈细胞单层，和随后(m)在乙醇溶液中洗涤宫颈细胞单层，和随后(η)用水洗涤宫颈细胞单层，藉此对宫颈细胞单层染色。按照本发明某些实施方案，在染色之前，用固定剂固定宫颈细胞单层载玻片，固定剂例如三氯乙酸(TCA)，例如在包含约1-20% TCA、例如约5-20% TCA、例如约5-15% TCA、 例如约10% TCA的溶液中。宫颈细胞单层载玻片的固定持续约10分钟-约2小时，例如约 20分钟-约2小时，例如约1小时。固定后在水(DDW、DW或去离子水)中洗涤宫颈细胞单层载玻片，以便从宫颈细胞单层样品除去过量的固定剂。可在流动的去离子水(从载玻片的两侧)中洗涤(例如2-6次洗涤，例如4次洗涤)，每次约2-10秒。然后可在纸巾上干燥载玻片的反面。按照本发明某些实施方案，为了复染宫颈细胞细胞核，用苏木精(例如用于显微镜的苏木精Gill III溶液，或苏木精Harris)对宫颈细胞单层载玻片染色，视宫颈细胞单层载玻片质量而定染色时间持续约1-20分钟，例如约1-15分钟。按照本发明某些实施方案，用苏木精溶液染色持续约5-15分钟，例如约5-10分钟，例如约9分钟。按照本发明某些实施方案，为了从宫颈细胞单层载玻片除去未结合的苏木精染料，在水中洗涤载玻片，例如通过在自来水中孵育载玻片约1分钟，然后通过流动DDW、DW或去离子水10秒[或通过在流动的去离子水中浸入3-6次(例如4次，每次约2秒)]。按照本发明某些实施方案，为了预处理宫颈细胞单层载玻片用于随后的癌宫颈细胞或癌前宫颈细胞的鉴别染色，使宫颈细胞单层载玻片与印度榕植物提取物溶液接触。与印度榕植物提取物溶液接触可持续至少1分钟，例如约1分钟-约10分钟的时间，例如约 2分钟-约8分钟时间，例如约2分钟的时间，例如4分钟。按照本发明某些实施方案，为了从宫颈细胞单层除去过量的印度榕植物提取物， 在流动的DDW、Dff或去离子水中洗涤载玻片10秒，或通过在DDW、Dff或去离子水中浸入4 次，每次约2秒。按照本发明某些实施方案，然后通过在新品红溶液中孵育载玻片来用新品红溶液对宫颈细胞单层载玻片染色，染色时间为约10秒-约5分钟，例如约10秒-约3分钟，例如约30秒-3分钟，例如约1分钟。新品红溶液可为在约5% -70%乙醇在水中(ν/ν)的乙醇溶液中的约0. -约5%新品红(w/v)。按照本发明某些实施方案，新品红溶液为20% 乙醇中的0.5%新品红。按照本发明某些实施方案，然后通过流动的DDW、DW或去离子水洗涤宫颈细胞单层载玻片约10秒，或用水例如用流动的去离子水、DDW或DW浸入几次(例如3-6次，例如4 次)，以便除去过量的新品红染料。每次洗涤可持续约1-20秒，例如约2-15秒，例如约5-10 秒，例如约10秒。然后可用固绿或亮绿对宫颈细胞单层载玻片染色。按照本发明某些实施方案，当使用亮绿时，载玻片进一步在乙醇溶液然后在水中洗涤。按照本发明某些实施方案，当使用固绿时，可如下所述直接对载玻片进行固绿染色。按照本发明某些实施方案，在水中洗涤后，在乙醇溶液中洗涤宫颈细胞单层载玻片，例如约20-80%的乙醇水溶液，例如约30-60%的乙醇水溶液，例如约40-60%的乙醇水溶液，例如约50%的乙醇水溶液。可通过在乙醇溶液中孵育来进行乙醇溶液中的洗涤，其通过在乙醇溶液中几次短暂浸入来进行，例如约10-50次，例如约30-40次，例如35次，其中每次浸入持续约1-3秒，例如2秒。按照本发明某些实施方案，然后用水例如流动的去离子水洗涤宫颈细胞单层载玻片几次(例如3-6次，例如4次)，以便从宫颈细胞单层除去过量的乙醇。每次在水中的洗涤进行短的时间(例如约1-60秒，例如约10-30秒，例如约10秒)。按照本发明某些实施方案，然后用亮绿对宫颈细胞单层载玻片染色。可通过在亮绿溶液(例如20%乙醇中的4%亮绿)中孵育宫颈细胞单层载玻片约0. 5-10分钟、例如约 1-5分钟、约2-3分钟、例如约2分钟，来进行亮绿染色。按照本发明某些实施方案，然后用固绿对宫颈细胞单层载玻片染色。可通过在固绿溶液中孵育宫颈细胞单层载玻片来进行固绿染色，孵育时间约5秒-约2分钟，例如约10 秒-约2分钟，例如约20秒-约1分钟，例如约40-50秒，例如45秒。固绿溶液可为乙醇溶液中的固绿溶液，例如在约5%-约70%乙醇在水中(ν/ν)的乙醇溶液中包含约0. 约 5%固绿的溶液。例如，固绿溶液可包含在20%乙醇/水溶液中的约固绿。
按照本发明某些实施方案，在亮绿或固绿染色后，在水(例如流动的DDW、DW或去离子水)中洗涤宫颈细胞单层载玻片，以便从宫颈细胞单层除去未结合的亮绿或固绿染料。在水中洗涤可通过若干次(例如3-6次，例如4次)短时间洗涤来进行，所述短时间例如约1-30秒，例如约5-20秒，例如约10秒。按照本发明某些实施方案，然后在乙醇中洗涤宫颈细胞单层载玻片，例如通过浸入(短暂浸入，每次约1-2秒)乙醇溶液中，乙醇溶液范围为约5% -约70%乙醇在水中， 例如约40 %乙醇在水中，浸入次数为若干次，例如5-15次(例如10次)，接着在水例如流动的去离子水中洗涤宫颈细胞单层约4次，每次洗涤约1-60秒(例如2秒)。在乙醇中洗涤后，可通过流动的DDW、Dff或去离子水洗涤载玻片10秒。按照本发明某些实施方案，一旦染色和洗涤，就将宫颈细胞单层载玻片干燥，例如通过风干约10-60分钟，例如约30分钟，用封固剂例如Eukitt或Entellan封固，并用盖载玻片盖上。应该注意，上述关于液体基样品的任何染色方案亦可实施用于常规宫颈涂片和/ 或组织活检(例如石蜡包埋或冷冻切片)。一旦通过本发明某些实施方案方法染色，对于样品中存在具有红色细胞质的至少一种宫颈细胞，就可进一步用显微镜和/或图像分析系统(例如自动图像分析装置)来评估宫颈细胞样品。可定量测定(例如通过像素)红色染色的强度，并与预定阈值比较。认为具有红色强度高于预定阈值的细胞质的细胞被鉴别染色。按照本发明某些实施方案，通过本发明某些实施方案的方法鉴别染色的细胞(例如具有红色细胞质)为未分化细胞，例如恶变前或恶性宫颈癌细胞。按照本发明某些实施方案，认为在用本发明某些实施方案染色方法染色后具有绿色细胞质的细胞为正常宫颈细胞。按照本发明某些实施方案，进一步通过其形态学特征来评估通过本发明某些实施方案方法鉴别染色的细胞，以便根据公认的组织学指南将其分类并确定癌分期或癌前分期。以下为可存在于本发明某些实施方案的宫颈细胞样品(细胞学样品)中的癌细胞或癌前细胞的形态学特征的非限制性阐述(阐述获自Diane Solomon, Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions，criteria禾口 explanatory notes (报告宫颈细胞学的Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版.2004 ； 通过引用以其整体并入本文中)。赘生性细胞未确定显著性的非典型鳞状细胞(ASC-US)-核面积为正常中间鳞状细胞的细胞核面积(AC-US的核面积大约35 μ m2)的约2_3倍。稍微增加细胞核与细胞质面积的比率。 最小限度的细胞核着色过度，染色质分布或细胞核的形状不规则。通常ASC-US细胞具有表层或中间鳞状细胞的大小和形状(见例如图22)。低级别鳞状上皮内病变(LSIL)-细胞单独(即作为相互之间不接触或重叠的单个细胞)或成簇出现。总的细胞大小大，有相当丰富的“成熟”的轮廓分明的细胞质。细胞核比正常中间细胞核面积增大多于三倍，导致细胞核对细胞质比率稍微增加。细胞核的着色过度的程度伴随细胞核大小、数目和形状的变化而变化。双核化和多核化常见，但单个细胞核亦存在于某些细胞中。染色质通常均勻分布，但为粗颗粒状；或染色质可出现污斑。通常没有核仁或如果存在也不明显。核膜轮廓经常稍微不规则，但仍可为平滑。细胞具有清晰的细胞质边界。LSIL细胞的非限制性实例示于图23中。高级别鳞状上皮内病变(HSIL)-细胞单独、成簇或多核体样聚集物出现。总细胞大小不定，范围从与在LSIL中观察到的那些大小相似的细胞到相当小的基底型细胞。细胞核着色过度伴随细胞核大小和形状的变化。细胞核的增大程度比在LSIL中观察到的更多变。某些HSIL细胞具有与LSIL相同程度的细胞核增大，但细胞质面积减少，导致细胞核/ 细胞质比率明显增加。其它细胞具有极高的细胞核/细胞质比率，但细胞核的实际大小可能比LSIL的小很多。染色质可为纤细的或粗颗粒状并均勻分布。核膜的轮廓相当不规则， 经常表露显著的低凹或沟槽。通常不存在核仁，但可偶尔见到，尤其当HSIL延伸进入宫颈内腺体空间时。HSIL细胞的非限制性实例示于图M中。鳞状细胞癌角质化鳞状细胞癌-可存在相对少的细胞；经常为分离的单个细胞，不太常见聚集物形式。细胞大小和形状的明显变化典型，具有尾状细胞和纺锤状细胞。细胞核大小亦显著变化，核膜结构可不规则，通常存在很多致密不透明的细胞核。当可见时，染色质型为粗颗粒状，不规则分布，副染色质透明。可见巨核仁，但相比非角质化SCC较少见。角质化 SC的非限制性实例示于图25中。非角质化鳞状细胞癌-细胞单独或以细胞边界不明确的多核体聚集物形式出现。 细胞通常比在许多HSIL中的细胞稍小些，但显示HSIL的大多数特征。细胞核显示明显不规则的粗块状染色质分布。可显示明显的巨核仁。非角质化SCC的非限制性实例示于图沈中。以下为可存在于本发明某些实施方案的宫颈细胞样品(细胞学样品)中的正常表层鳞状细胞(基底细胞、中间细胞和成熟细胞)和正常宫颈内细胞的形态学特征的非限制性阐述(阐述获自 Diane Solomon, Ritu Nayar，编辑The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology. Definitions, criteria 禾口 explanatory notes (才艮告宫颈细胞学的Bethesda系统，定义、标准和注释)；第二版.2004 ；以其整体通过引用完全并入本文中)。基底鳞状细胞-细胞核/细胞质比率增加；细胞大小不定；核膜平滑；核内容物染色质均勻分布；核数目一个；细胞形状椭圆形。中间鳞状细胞-细胞核/细胞质比率与成熟鳞状细胞相比稍微增加。细胞大小 不定；核膜平滑；核内容物染色质均勻分布；核数目一个；细胞形状多边形或椭圆形。成熟鳞状细胞-细胞核/细胞质比率小(致密)细胞核。核膜平滑；核内容物 染色质均勻分布；核仁通常不存在；核数目一个；细胞形状多边形。正常宫颈内细胞-细胞通常成簇存在。簇中清晰的细胞质边界显示"蜂窝"状外观。另外，通过其典型的偏心细胞核易于鉴定宫颈内细胞。而且，通过簇的上下聚焦显示正常的细胞间隔、清晰的细胞质边界和浅淡的核染色质。核膜平滑。相对于宫颈内细胞，发育不良/赘生性细胞簇显示更拥挤(即使在单层细胞中)、核增大、核膜不规则及异常染色质型。宫颈内细胞的非限制性实例示于图21中。以下为本发明某些实施方案的宫颈活检(组织学样品)中瘤形成的形态学特征的非限制性阐述(阐述获自Diagnostic Histopathology of Tumors (肿瘤的诊断组织病理学)第三版第1卷.2007. Christopher D. M Fletcher ；以其整体通过引用完全并入本文中)。鳞状上皮内瘤形成[鳞状上皮内病变；宫颈上皮内瘤形成(CIN)]-高级别鳞状上皮内病变特征为表面成熟度不等的所有水平的上皮的核异型。表现出表面凹细胞变化和上皮成熟的病变对应CIN2，而那些具有很少或没有成熟的病变对应CIN3。这些病变通过以下方面与低级别鳞状上皮内病变相区别(1)在下层中存在核异型；( 增加上皮上半部中有丝分裂的有丝分裂指数；C3)丧失细胞极性；(4)在某些情况下有丝分裂象异常；( 存在明显畸形的奇怪的细胞。CIN3的非限制性实例示于图27中；而CIN2的非限制性实例示于图观中。浸润性鳞状细胞癌角质化-该肿瘤类型显示明显的角质化迹象，形式为角蛋白珠、透明角质颗粒、单个的角质化细胞及中心角质化的鳞状细胞巢。这些肿瘤通常归类为完全分化，并通常有推进的浸润边界。非角质化-该肿瘤由组织学上可识别的鳞状细胞组成，所述细胞大且为多边形， 具有嗜酸性细胞质和细胞桥，但其没有角蛋白珠形成、透明角质颗粒或中心角质化的鳞状细胞巢。通常存在较大程度的细胞核多形性和相关炎症的浸润性边界，大部分肿瘤通常归类为中间分化。非角质化SCC的非限制性实例示于图四中。按照本发明某些实施方案，所述方法进一步包括检测高于预定阈值的宫颈恶性或宫颈恶变前标记物的表达水平，其中高于预定阈值的宫颈恶性或宫颈恶变前标记物的表达水平，表明宫颈细胞为恶性或恶变前细胞，藉此鉴定宫颈恶性或宫颈恶变前细胞。本文所用短语“高于预定阈值的表达水平”，指高于预定阈值的倍数增加(例如上调程度)，例如是参考表达水平的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍。本文所用短语“参考表达水平”，指例如不受疾病影响的对照健康受试者的细胞或不受影响的细胞中的基因产物(例如宫颈癌标记物或宫颈癌前标记物)的表达水平。应该注意，参考表达水平可从文献中获得，或可在对照受试者细胞(例如来自相同组织类型，宫颈细胞)中测定。按照本发明某些实施方案，参考表达数据获自至少一名对照健康受试者，例如至少2名、至少3名、至少4名、至少5名、自至少6名、至少7名、至少8名、至少9名、至少10 名、至少20名、至少30名、至少40名、至少50名、至少100名或更多名对照健康受试者获得。应该注意，当使用多于一个参考受试者时，参考表达数据可包含几个或所有受试者表达水平的平均数，本领域技术人员能够用例如归一化表达值对来自2名或更多名受试者的表达水平求平均。按照本发明某些实施方案，参考表达水平不存在癌标记物或恶变前癌标记物。在本发明某些实施方案中，与对照受试者或对照细胞中不存在标记物(例如参考表达水平为零)相比存在癌标记物或恶变前癌标记物，表明癌细胞或癌前细胞(视所检测的标记物而定)。以下为癌标记物/恶变前标记物的非限制性列表，在宫颈细胞中检测出所述标记物表明宫颈细胞为恶性或恶变前细胞。表 1
才示 己物才示 己物
标记物氨基酸序列核酸序列方法表明癌症
(SEQ ID NO) (SEQ ID NO)
digene HC2 HPV
HPVDNA Test(Qiagen)
(人乳头瘤病毒)检测多种HPV毒林
的存在情况
免疫组织化学y 低氧诱导因子_ . 宫颈癌，但可用
l-α21(Β Π16Γ P ’于许多不同类型
(HIF-la)CanM Res. 2000;的癌症
60: 4693-6)
免疫組织化学
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权利要求
1.一种对宫颈细胞样品染色的方法，所述方法包括(i)使所述宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触，( )用新品红对所述宫颈细胞样品染色，和(iii)用亮绿或固绿对所述宫颈细胞样品染色，藉此对所述宫颈细胞样品染色。
2.—种诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的方法，所述方法包括(a)按照权利要求1的方法对所述受试者的宫颈细胞样品染色，藉此获得染色的宫颈细胞样品，(b)鉴定所述宫颈细胞样品中的至少一种宫颈细胞具有在预定阈值之上的红色细胞质，其中存在具有在所述预定阈值之上的所述红色细胞质的所述至少一种宫颈细胞，表明与正常宫颈细胞相比未分化或低分化的细胞，藉此诊断所述受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。
3.权利要求2的方法，所述方法进一步包括(c)分析具有在所述预定阈值之上的所述红色细胞质的所述至少一种宫颈细胞的形态学，其中在具有在所述预定阈值之上的所述红色细胞质的所述相同细胞中存在与正常宫颈细胞的形态学相比异常的形态学，表明恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。
4.权利要求1-3中任一项的方法，所述方法进一步包括检测所述宫颈细胞样品的至少一种宫颈细胞中的宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的表达水平，其中所述宫颈恶性标记物或所述宫颈恶变前标记物的表达水平在预定阈值之上，分别表明所述至少一种宫颈细胞为恶性细胞或恶变前细胞，藉此鉴定所述宫颈恶性细胞或宫颈恶变前细胞。
5.权利要求4的方法，其中在所述相同宫颈细胞样品中存在被鉴定为未分化或低分化细胞的至少一种宫颈细胞，和存在表现出在所述预定阈值之上的所述宫颈恶性标记物或所述宫颈恶变前标记物的所述表达水平的至少一种宫颈细胞，表明所述受试者中恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的阳性诊断。
6.权利要求4的方法，其中在所述相同宫颈细胞样品中存在具有所述异常形态学的至少一种宫颈细胞，存在被鉴定为未分化或低分化细胞的至少一种宫颈细胞，和存在表现出在所述预定阈值之上的所述宫颈恶性标记物或所述宫颈恶变前标记物的所述表达水平的至少一种宫颈细胞，表明所述受试者中恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的阳性诊断。
7.权利要求1-6中任一项的方法，所述方法进一步包括用苏木精对所述宫颈细胞样品染色。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品包含宫颈组织切片。
9.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品包含宫颈涂片。
10.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品包含宫颈细胞单层。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤(i)在步骤(iii)之前进行。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤(i)在步骤(ii)之前进行。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品包含宫颈组织样品，且其中所述方法包括(a)使所述宫颈组织样品在二甲苯中脱蜡，和随后(b)在乙醇中洗涤所述宫颈组织样品，和随后(C)在水中洗涤所述宫颈组织样品，和随后(d)用苏木精对所述宫颈组织样品染色，和随后(e)在水中洗涤所述宫颈组织样品，和随后(f)使所述宫颈组织样品与印度榕植物提取物接触，和随后(g)在水中洗涤所述宫颈组织样品，和随后(h)用新品红对所述宫颈组织样品染色，和随后(i)在水中洗涤所述宫颈组织样品，和随后(j)在乙醇溶液中孵育所述宫颈组织样品，和随后 (k)用亮绿或固绿对所述宫颈组织样品染色，和随后 (1)用水洗涤所述宫颈组织样品， 藉此对所述宫颈组织样品染色。
14.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品包含宫颈涂片，且其中所述方法包括(a)在三氯乙酸(TCA)溶液中固定所述宫颈涂片，和随后(b)在水中洗涤所述宫颈涂片，和随后(c)用苏木精对所述宫颈涂片染色，和随后(d)在水中洗涤所述宫颈涂片，和随后(e)使所述宫颈涂片与印度榕植物提取物接触，和随后(f)在水中洗涤所述宫颈涂片，和随后(g)用新品红溶液孵育所述宫颈涂片，和随后(h)在水中洗涤所述宫颈涂片，和随后(i)在乙醇溶液中孵育所述宫颈涂片，和随后 (j)在水中洗涤所述宫颈涂片，和随后(k)用亮绿或固绿对所述宫颈涂片染色，和随后 (1)用水洗涤所述宫颈涂片， 藉此对所述宫颈涂片染色。
15.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品包含宫颈细胞单层，且其中所述方法包括(a)在三氯乙酸(TCA)溶液中固定所述宫颈细胞单层，和随后(b)在水中洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(c)用苏木精对所述宫颈细胞单层染色，和随后(d)在水中洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(e)使所述宫颈细胞单层与印度榕植物提取物接触，和随后(f)在水中洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(g)用新品红对所述宫颈细胞单层染色，和随后(h)在水中洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(i)在乙醇溶液中孵育所述宫颈细胞单层，和随后 (j)在水中洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(k)用亮绿或固绿对所述宫颈细胞单层染色，和随后(1)用水洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(m)在乙醇溶液中洗涤所述宫颈细胞单层，和随后(η)用水洗涤所述宫颈细胞单层，藉此对所述宫颈细胞单层染色。
16.权利要求1-15中任一项的方法，所述方法进一步包括在用所述新品红进行所述染色之前，用酶消化所述宫颈细胞样品中的粘蛋白。
17.权利要求1-15中任一项的方法，所述方法进一步包括使用以可与通过用新品红、 亮绿和固绿染色获得的颜色相区别的颜色对粘蛋白鉴别染色的物质对所述宫颈细胞样品染色。
18.权力要1-17中任一项的方法，所述方法进一步包括用包含抗氧化剂的封固剂将所述染色的宫颈细胞样品封固。
19.权利要求2-18中任一项的方法，其中所述恶变前宫颈肿瘤选自上皮内瘤形成 (CIN)、鳞状上皮内病变(SIL)。
20.权利要求2-18中任一项的方法，其中所述恶性宫颈肿瘤选自原位癌和浸润性癌。
21.权利要求20的方法，其中所述浸润性癌选自鳞状细胞癌(SCC)和腺癌。
22.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述宫颈细胞样品选自宫颈组织切片、宫颈涂片和宫颈细胞单层。
23.权利要求7-22中任一项的方法，其中在所述与所述印度榕植物提取物接触之前进行所述用所述苏木精的染色。
24.权利要求1-23中任一项的方法，所述方法进一步包括在所述与所述印度榕植物提取物接触之前固定所述宫颈细胞样品。
25.权利要求对的方法，其中用选自三氯乙酸(TCA)、乙醇和甲醇的固定剂来进行所述固定。
26.权利要求10、15、16、17或18的方法，其中所述宫颈单层没有血液细胞。
27.权利要求10、15、16、17或18的方法，其中所述宫颈单层为Thinft^p 样品。
28.权利要求1-27中任一项的方法，其中所述印度榕植物提取物选自粗印度榕植物提取物、C23H44O4和原花色素。
29.一种用于对宫颈细胞样品染色和/或诊断宫颈恶变前或恶性肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括包装印度榕植物提取物、新品红和亮绿的包装材料。
30.一种用于对宫颈细胞样品染色和/或诊断宫颈恶变前或恶性肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括包装印度榕植物提取物、新品红和固绿的包装材料。
31.权利要求四或30的试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于对宫颈细胞样品染色和/ 或诊断受试者中宫颈恶变前或恶性肿瘤的使用说明。
32.权利要求4、5或6的方法，其中所述宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物选自 ki67抗原(通过单克隆抗体Ki-67鉴定的抗原)、Mtn2、低氧诱导因子l-α (HIF-1 α )、 Id-I (分化 /DNA 结合抑制剂-1)、pl6INK4a、p21WAFl/CIPlJn 抗原(Tn-Ag)、P53 和增殖细胞核抗原(PCNA)。
33.权利要求4、5、6或32的方法，其中所述检测所述宫颈恶性标记物或所述宫颈恶变前标记物的所述表达水平用高亲和力物质进行。
34.权利要求33的方法，其中所述高亲和力物质为特异性结合所述宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的抗体。
35.权利要求33的方法，其中所述高亲和力物质为选自以下的多核苷酸与编码所述宫颈恶性或宫颈恶变前标记物的RNA特异性杂交的多核苷酸和特异性扩增所述宫颈恶性标记物或宫颈恶变前标记物的多核苷酸。
全文摘要
本发明提供用于对宫颈细胞样品染色的方法和试剂盒，所述染色是通过使宫颈细胞样品与印度榕植物提取物接触、用新品红对宫颈细胞样品染色和用亮绿或固绿对宫颈细胞样品染色。本发明还提供诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤的方法，所述方法通过是对宫颈细胞样品染色并鉴定至少一种宫颈细胞具有在预定阈值之上的红色细胞质，其中存在具有在预定阈值之上的红色细胞质的至少一种宫颈细胞，表明与正常宫颈细胞相比未分化或低分化细胞，藉此诊断受试者中的恶变前宫颈肿瘤或恶性宫颈肿瘤。
文档编号G01N33/574GK102576024SQ201080033724
公开日2012年7月11日 申请日期2010年5月17日 优先权日2009年5月19日
发明者A·埃亚尔, A·埃尔克莱斯, D·特基尔陶布, P·伊德莱维克 申请人:泽蒂克科技有限公司