使用热休克蛋白72作为敏感生物标志物来检测急性肾损伤的诊断方法

专利名称：使用热休克蛋白72作为敏感生物标志物来检测急性肾损伤的诊断方法
使用热休克蛋白72作为敏感生物标志物来检测急性肾损伤的诊断方法
说明书发明领域本发明涉及临床医药领域并且涉及用于检测急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)的诊断方法，更具体地涉及证实72kDa的热休克蛋白(Hsp72)是ー种检测AKI的非侵入性的、敏感的和早期生物标志物，并且涉及检测尿样中的Hsp72的定量方法。
背景技术：
急性肾损伤是在由于不同原因住院的患者中发病率和死亡率的ー种重要的原因。据估计，AKI发病率的变化从在任何外科手术前具有正常肾功能的患者中的5%到进入重症监护病房(I⑶)的患者中的30%。尽管最近在诊断和治疗上有了发展，AKI相关的发病率和死亡率仍旧保持高度升高(在I⑶中的患者中为40% -60% )并且在过去四十年里没有 显著改善，这主要是由于可用于早期检测AKI的工具缺乏敏感性和特异性(Clin J Am SocN印hrol (美国肾脏学学会临床杂志)3 :1895-1901，2088)。因为这样，寻找早期生物标志物越来越受到重视。而且，这些新的生物标志物可能是用于早期检测AKI的潜在工具，并且也可以用于区分不同程度的肾损伤，从而确定检测由于严重的AKI发作而有风险发展慢性肾疾病的患者。因此，开发有效的生物标志物将有助于在暴露于AKI的那些患者中(如进入I⑶的患者，将进行心脏外科手术的患者，肾移植患者或已经发展AKI的患者)中对于充分治疗AKI进行适当的干预，该生物标志物将有助于对损伤进行分级，并且检测具有慢性肾疾病发展风险的那些患者。在临床实践中，AKI诊断的确定是基于血清肌酸酐的升高并且通过评估肾小球滤过率(GFR)进行。尽管血清肌酸酐用于在慢性肾疾病患者中、在AKI患者中进行肾功能评估，但是，因为以下三点原因它并不是ー个好的指示剂1)大量肾组织可能被损伤，但不伴随血清肌酸酐升高，在肾移植供体中存在明显的实例，其失去50%的肾实质，并且在血清肌酸酐水平中并不存在任何变化，2)血清肌酸酐浓度取决于许多非肾因素，如在骨骼肌中肌酸转化为肌酸酐，肌酸酐释放到血液中等，因此取决于其释放和累积，血清肌酸酐的升高以滞后形式发生，和3)血清肌酸酐可能被其它因素影响，如被体重、人种、性別、年龄、药物消耗、肌肉代谢和蛋白摄取影响。关于GFR測定，这可能关于肾和非肾损伤而被改变。例如，血容量不足(hypovolemia)或在传入小动脉中血管收缩或血管舒张程度的改变导致TGF的减少，伴随随后发生的血清肌酸酐升高，这与肾小管或肾损伤(tubular or renal injury)并不相关。所有这些因素使发展AKI的患者的早期干预难以进行，并且后果是不能达到更好的预后。(Clin Transl Sci3 ；200-208 ；2008).生物标志物是ー种生物分子，其内源性产生并且可能是用于检测异常生物学过程的客观指示物。此外，其可以有助于检测药理干预是否可用于减少由病理过程导致的损伤。具体而言，在AKI患者中，有用的生物标志物是这样的ー种生物标记物，其有助于以早期、精确和容易的方式检测AKI的主要结构并发症，其是急性肾小管坏死(acutetubular necrosis, ATN)。ATN的特征在于由于刷状缘损失和上皮的极性导致的严重的近端肾小管损伤。对于这些特征，可以找到这样的生物标志物，所述生物标志物可以在脱附细胞中被检测到，并且会在尿中出现，由此反映与该综合征相关的肾小管损伤。所述生物标志物不仅有助于区分ATN和其它类型的肾损伤，还可以潜在地鉴定肾小管损伤定位、损伤的原因和短暂干扰(temporal curse)。ー些研究提出了用于ATN检测的蛋白和生物化学标志物，在它们中有=N-Zj酰基-b_D_氨基葡糖苷酶(N-acetil-b-D-glucosaminidasa, NAG),嗜中性白细胞明胶酶相关的脂笼蛋白(Neutrophil gelatinase associated lipocalin, NGAL),肾损伤分子-1 (Kim-1)，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和白细胞介素-18(IL-18) (Am J Physiol RenalPhysiol (美国生理学肾脏学杂志)290 :F517-F529) (J Am Soc Nephrol (美国肾脏学学会杂志)18 :904-912,2007) (Am J of Tranplantation(美国移植杂志)6 :1639-1645 ;2006)。 在最近关于90名进行了心脏外科手术的患者的报道中，评估了 Kim-1、NAG和NGAL的诊断应用性。通过使用评分等级1，以即时方式或在心脏外科手术后3小时分析这些分子用于AKI检测的能力，发现Kim-I的能力分别是0. 68和0. 65，NAG的能力分别是0. 61和0. 63，并且NGAL的能力分别是0. 59和0. 65。为了增加这些标志物的敏感性，有必要组合定量它们，并且以这种方式，将AKI的敏感性和早期检测分别增加到0.75和0.78 (Clin JAm SocN印hrol (美国肾脏学学会杂志)5 ;873-882，2009)。这支持了这ー观点，即必须继续寻找具有更高的用于早期诊断的潜カ并且具有对AKI损伤分级能力的新型生物标志物。据报道，在AKI现象过程中，激活了一些补偿所产生的细胞应激的机制，其中之一是热休克蛋白家族(Hsp)表达的增加(Experientia 18，571-573，1962)，其有助于恢复细胞稳态。这些蛋白属于多基因家族，其分子量从10到150kDa。根据它们的分子量，这些蛋白被分类在6个亚家族中100-1 IOkDa, 90kDa, 70kDa, 60kDa, 40kDa和分子量在18和30kDa之间的 Hsp 亚家族(Ann Med. 4 :261-71，1999)。具体而言，Hsp70家族由4个同种型组成Grp78, mHsp95, Hsc70和可诱导的同种型Hsp72。后者在细胞应激后表达并且其诱导可以高达总细胞蛋白的15% (Cell stresschaperones (细胞应激分子伴侣)4 ;309_316，2003)。这一事实，与在AKI过程中发生的肾単位的近侧肾小管的细胞脱附一起被用作本发明的基础，即使用免疫測定法在蛋白水平和使用实时-聚合酶链式反应(实时PCR)在mRNA水平检测作为AKI的敏感生物标志物的尿 Hsp72。已经将ELISA (酶联免疫吸附测定法)技术和蛋白质印迹分析广泛用于在不同类型的样品中使用抗体来检测特异性蛋白(Immunology 6thedition (免疫学,第6版),2007)。将实时PCR测试用于具体基因的mRNA水平的定量測定。本发明有助于解决临床实践中存在的问题(即不能早期检测AKI和不能对肾脏遭受的肾损伤的程度进行分级)，从而以有效疗法对患者进行适当干预。发明描述本发明涉及通过使用尿样中的生物标志物Hsp72的浓度早期检测急性肾损伤的非侵入性诊断方法。这是ー种非侵入性、可靠的和容易的方法。在本发明中，用于检测AKI的方法通过从哺乳动物(优选人)获得尿样和在蛋白和mRNA水平定量生物标志物浓度进行，所述生物标志物为热休克蛋白72 (Hsp72)。生物标志物浓度可以使用免疫測定法如ELISA和蛋白质印迹法(它们不限制本发明)在mRNA水平和/或蛋白水平进行測定。与对照值相比，来自生物标志物定量的结果在40倍和533倍之间变化，并且这种增加取决于损伤强度，在尿中的生物标志物Hsp72可以自在肾中引起损伤后的三小时起检测到。Hsp72定量能够对由局部缺血(ischemia)的时期延长而引起的损伤的强度进行分级，这对于临床实践是重要的，从而可以检测遭受严重肾损伤的那些患者，这又允许进行适当的随访并且因此这是有重大意义的，原因在于其可以避免 或減少慢性肾疾病并发症。
实施例下面的实施例举例说明本发明，并且决不对其有限制。实施例I.为了证实Hsp72作为AKI的敏感和早期生物标志物的应用，我们使用了大鼠中的肾局部缺血/再灌注(I/R)模型。局部缺血/再灌注模型整个研究中一直使用雄性Wistar大鼠。将大鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg i.p.)进行麻酔，进行剖腹手术，切开肾蒂，其后通过夹住两条动脉历时10，20,30,45和60分钟来中断到肾中的血流，目的是评估肾损伤的不同程度，从低度肾损伤到中度肾损伤到严重肾损伤。此外，包括进行了假外科手术(false surgery)的组作为对照。每组包括6只大鼠。在局部缺血时期结束时，将大鼠縫合并且容许进行肾再灌注24小吋。为了确定定量Hsp72 mRNA水平作为生物标志物的应用性，使用36只大鼠，将其分到6个组中；使对照组和大鼠进行10，20，30，45和60分钟的双侧局部缺血，将它们都进行24小时的再灌注。用特定条件收集尿以避免mRNA降解，如下所述。以类似方式，并且为了确定蛋白Hsp72水平的定量作为早期生物标志物的应用，将另外33只大鼠分到11个组中进行假外科手术的对照组，进行了 30分钟双侧局部缺血和3，6，9，12，18，24，48，72，96和120小时再灌注时期的大鼠。收集尿，使用ELISA方法来确定Hsp72蛋白水平作为AKI的早期生物标志物的敏感性。在所有的组中，通过肌酸酐清除率并且通过测量肾血流来评估肾功能。使用光学显微镜和形态测量法来评估结构损伤。作为肾小管损伤标志物，測量尿NAG和总蛋白水平。为了研究Hsp72是否在肾中的局部缺血过程中被诱导，评估在肾组织提取物中的Hsp72的mRNA和蛋白水平。为了确定Hsp72是否是检测不同程度肾损伤的敏感和早期生物标志物，使用ELISA和蛋白质印迹法来定量尿Hsp72水平。实施例2.通过使用实时PCR进行Hsp72检测对于Hsp72 mRNA水平检测，将进行30分钟的双侧局部缺血的30只雄性Wistar大鼠分为6组进行假外科手术(对照组)的大鼠和进行10，20，30，45和60分钟的双侧局部缺血和24小时的再灌注的大鼠。外科手术后ー小时，将大鼠置于代谢笼中24小吋。代谢笼之前用RNA酶抑制剂(RNAse Zap, Ambion)处理。在历时24小时收集尿液的管中，加入300 V- IRNA later (Ambion),将样品以3000rpm离心30分钟。在磷酸盐缓冲液pH = 7. 4中重新悬浮尿的沉降物并且再次以13000 rpm离心3分钟。按照生产商(Invitrogen)提供的Trizol方法进行总RNA提取。通过260 nm处的UV吸光度确定RNA浓度，并且通过I %琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整性。在60分钟内，在37°C使用逆转录酶反应(RT)RNA
合成每种cDNA。通过实时PCR检测Hsp72 mRNA水平。包括核糖体RNA 18S作为对照基因来校正扩增效率变化。实施例3.通过使用ELISA检测Hsp72关于Hsp72蛋白水平检测，包括36只大鼠并且进行10，20，30，45和60分钟的双侧局部缺血。外科手术后ー小时，将大鼠置于代谢笼中24小时并且收集尿。尿必须立即用于ELISA或蛋白质印迹测定法，不然必须在-80°C保存以避免Hsp72降解。关于通过ELISA定量Hsp72，使用由Stressgene生产的商购试剂盒Hsp70高敏感性ELISA试剂盒，简要解释如下 I)将100 U I尿样加入ELISA板的每个孔中；2)将该板在室温温育2小吋，并且伴随轻柔摇动；3)在每个孔中必须用由该试剂盒提供的洗涤缓冲液进行三次洗涤；4)必须将100 U I ー级抗体(抗_Hsp72)加入孔中，并且将板温育60分钟。在该时期结束的时候，必须如第三点提及进行三次洗涤；5)必须加入100 ill与HRP偶联的ニ级抗体，并且再次在室温温育60分钟。在该时间结束的时候，必须再进行三次洗涤；6)必须将IOOiU底物溶液(来自该试剂盒)加入每个孔中，并且必须在室温温育所述板30分钟；7)必须加入100 U I终止溶液(来自该试剂盒)；8)必须如生产商指示在450nm读取所述板。实施例4.使用蛋白质印迹法来检测Hsp72使用来自在上一实施例中所述大鼠的相同的尿样。必须将每份尿I : 100稀释，并且仅使用IOyl的稀释的尿。将稀释的尿与IOiIl上样缓冲液(6% SDS，15%甘油，150mM Tris，3%溴酚蓝，2% P -巯基こ醇，pH 7. 6)混合。将蛋白在95°C变性5分钟，在
8.5% SDS-PAGE凝胶中电泳分离，并且在9V在60分钟内，在转移印迹(SD cell, BioRad)中电印迹到预先在IX迁移缓冲液(190mM甘氨酸，2mM Tris碱，SDS 0. I %, 200mL甲醇)中平衡的聚ニ氟こ烯(polivinil difluoride)膜(PVDF, Amersham Pharmacia Biotech,Psicataway,NJ,USA)上，并且在室温，用5%封闭试剂(BIORAD)在TBS-T (Tris缓冲盐水和吐温)中进行封闭。在封闭步骤后，将膜在4°C用抗-Hsp72—级抗体I : 5000 (Stressgene)温育。温育后，将膜洗涤用TBS-T三次，每次洗涤10分钟。随后，将I : 5000的与过氧化物酶缀合的IgG山羊杭-小鼠ニ级抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)与膜在室温温育90分钟，并且将膜再次洗涤6次。使用商购的试剂盒ECL plus (GE卫生保健生命科学(GEHealthcare Life Sciences))检测Hsp72的量,并且扫描获得的条带进行光密度分析。结果首先，我们评估了产生不同时期的双侧局部缺血(10-60分钟)和24小时的再灌注对肾功能的影响。五组大鼠经历了局部缺血，发展了肾功能不全，由血清肌酸酐的进行性升高和通过肌酸酐清除率测量的GFR的減少证实，如在图IA和IB中所显示。肾功能不全与10到30%的肾血流減少相关，不伴随平均动脉压的变化，如在图IC和ID中详细显示。光学显微镜研究掲示，不同的双侧局部缺血时期和24小时的再灌注诱导了与引起的局部缺血时间相应的不同程度的肾小管损伤，如在图2的(A)到(F)每组的代表性图象中所显示。损伤的特征在于刷状缘的损失、肾小管扩张、细胞脱附和管型形成。在图2G和2H中显示的每个视野内的管型数目和受影响的肾小管区域百分比分析，掲示局部缺血的时期越长，发展的肾小管损伤程度越大，这意味着存在肾小管损伤和管型数目的进行性増加，所述肾小管损伤和管型数目的进行性増加与损伤的強度成比例。通过光学显微镜评估的组织学损伤是确定由局部缺血/再灌注诱导的损伤程度的黄金标准，这是为什么在下幅图中我们将显示在Hsp72生物标志物和肾小管损伤之间的相关性的原因。评估了肾小管损伤和氧化应激的ー些经典标志物，如尿蛋白排泄、N-こ酰基-P -D-氨基葡糖苷酶(NAG)和H202。如在图3A中所显示，NAG升高仅在局部缺血30分钟后具有统计学意义，这意味着这种标志物不能鉴定由更短 时期局部缺血(10或20分钟)诱导的肾损伤。关于氧化应激标志物，H2O2尿排泄从局部缺血10分钟开始升高，但是敏感性并不足以区分不同程度的局部缺血，尤其是20分钟和60分钟之间的局部缺血，见图3B。最終，我们观察到蛋白尿是检测不同程度肾损伤的最佳标志物，如在图3C中所显示。为了评估Hsp72是否在不同时期的局部缺血过程中在肾组织中被诱导，确定肾组织中的Hsp72 mRNA和蛋白质水平，这意味着一旦收集了尿，即处死大鼠并且取ー个肾进行mRNA和蛋白提取。如在图4A和4B中显示，在来自具有I/R的组的每只大鼠的肾组织中，Hsp72 mRNA和蛋白水平都显著增加。此外，要理解其进行性増加明显限制了由不同时期的局部缺血/再灌注诱导的肾损伤的不同程度。这些结果显示在I/R现象中，Hsp72表达的増加与诱导的损伤的程度成比例，这是令人感兴趣的并且有利于本发明。利用这些数据，我们决定研究该蛋白质是否能够在遭受肾局部缺血/再灌注损伤的大鼠的尿中被检测到用以开发敏感的和非侵入性的方法。为此目的，我们通过使用两种免疫測定法确定Hsp72水平。第一种方法通过ELISA进行，第二个方法通过蛋白质印迹分析进行。通过ELISA定量尿的Hsp72掲示这种蛋白是ー种优越的用于AKI的生物标志物，因为其能够白10分钟的局部缺血起在尿中被检测到，并且显示与对照相比，与由局部缺血诱导的肾损伤的程度相应的进行性増加在经历60分钟的局部缺血的大鼠中达到25倍的诱导，如在图4C中显示。这些生物标志物的进行性升高明显与关于局部缺血损伤的黄金标准，即组织病理学分析相关。图5A显示在尿中的Hsp72的量与管型形成之间的正相关性，其相关性为0. 83,p < 0. 0001，并且图5B显示在尿Hsp72与受影响的区域的百分比之间的相关性，其为0. 79并且p < 0. 0001。我们用来检测hsp72蛋白水平的其它策略是对来自不同组的尿样进行蛋白质印迹分析。图6A中的上图描述了来自蛋白质印迹分析的放射自显影，而下图显示了扫描的条带的光密度分析。如可以观察到的，I/R在经历了不同时期的局部缺血的大鼠中诱导了尿Hsp72水平的显著增加。类似于ELISA分析，自10分钟局部缺血起，Hsp72的检测具有统计学显著性，并且其与诱导的肾损伤的程度成比例升高。与ELISA相比，使用蛋白质印迹法检测不同程度的肾损伤的敏感性更高，因为在10分钟组中Hsp72增加是40倍，逐渐增加，在具有60分钟的严重肾损伤的组中达到535倍。在尿中的Hsp72的量与管型形成之间的相关性显示在图6B中，其是0.9476，p < 0.0001。这些结果证实，尿Hsp72检测的敏感性足以检测不同程度的肾损伤，然而通过蛋白质印迹分析检测这种蛋白优于ELISA分析(见相关性)。此外，重要的是强调使用蛋白质印迹分析，其仅需要0. IiU的尿，而使用ELISA，其则需要100 ill的尿。为了研究Hsp72检测是否不仅仅限于蛋白水平的定量，我们决定研究在经历局部缺血的大鼠尿中的Hsp72 mRNA丰度。提取的RNA的完整性显示在图7A中。与对照组相比，在经历了局部缺血的大鼠中，尿的Hsp72mRNA水平増加，如在图7B中显示。如在蛋白质水平上发生的那样，在尿中的mRNA水平与诱导的损伤的程度成比例増加。这用黄金标准进行了证实，并且如在图7C中显示，在Hsp72 mRNA水平和每视野的管型数目之间的显著相关性为 0.8509。最后，为了评估Hsp72作为AKI的早期生物标志物的应用性，在经历了 30分钟局部缺血和3-120小时再灌注时期的大鼠中确定尿的Hsp72浓度。图8显示与肾小管损伤的其它标志物相比的Hsp72检测。如在图SC中显示，自早期时期(3小时的再灌注)观察到Hsp72的显著升高，在18小时的再灌注达到峰值，随后这种蛋白在尿中的排泄減少，这与72小时后肾小管的再生作用相关。这些结果显示Hsp72作为AKI检测的早期生物标志物的应用性。 此外，与对照组相比，来自生物标志物定量的结果更大，并且观察到的増加取决于损伤强度，该结果是使用三种不同方法观察到的。重要的是强调能够自肾损伤被诱导后的前三个小时起检测到尿的Hsp72。实施例5.在健康活肾供体和在AKI患者中的尿Hsp72水平。收集来自5名健康肾供体(对照)和9名来自在Instituto Nacional de CienciasMedicas y Nutricion, Salvador Zubirdn 的 IQJ 的败血症性 AKI 患者的样品。根据AKIN (Acute Kidney Injury Network(急性肾损伤网络))指南,通过与基础相比,血清肌酸酐0.3mg/dl以上的増加来确定AKI的诊断。在健康供体中，收集肾切除术(知情同意)之前一天当天的第一次尿液。每天监测所有的败血症患者，并且当确诊AKI时，通过排空尿收集袋来收集新鲜尿液。冷冻所有的样品，并且在分析Hsp72水平之前将其保存在_80°C。在健康供体和AKI患者中的Hsp72尿水平。(结果)为了确定Hsp72是否是检测人中的AKI的敏感生物标志物，通过蛋白质印迹法分析该蛋白在健康供体中的尿水平，并且与在重症监护病房中已发展AKI的那些患者进行比较。AKI的定义为血清肌酸酐增加至少0. 3mg/dL,或6小时的尿体积少于0. 5ml/kg/h。表I显示了来自5名健康肾供体和9名患有败血症性AKI的患者的一般特征和肾功能。在AKI患者的组中，5名为女性，4名为男性，年龄范围在24到84岁。进入ICU时，所有的患者显示正常的血清肌酸酐值，然而他们在I⑶期间，肌酸酐从0. 55+-0. 05增加到2. 30+-0. 52mg/dL，显示了 AKI的发展。在图9中显示了尿的Hsp72水平。在健康肾供体的尿中，Hsp72几乎检测不到(33. 7+-7. I任意单位)，而在AKI患者中Hsp72水平增加(583+-85. I)。注意，两名诊断患有AKI的患者在住院期间死亡，并且是显示较高Hsp72水平的患者。表I.在健康肾供体和患有败血症性急性肾损伤的患者中的一般特征和肾功能
受试者编性引年龄诊断基线SCr 在AKI的取样后的随结果/最后的SCr号 (岁) S('r 访(天) t_(m /dL) (ny dL)_W(IL)_健康肾的活体供体
权利要求
1.已经充分描述了本发明，并且认为其是有新颖性的，我们要求下列各项作为独有权利，所述各项包含在下述权利要求中ー种早期检测急性肾损伤的诊断方法，所述方法包括 a.从哺乳动物获得尿样；和 b.定量生物标志物热休克蛋白72(Hsp72)的浓度。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
3.根据权利要求I所述的方法，其中自在肾中引起损伤后三小时起能够检测到尿样品中的Hsp72。
4.根据权利要求I所述的方法，其中Hsp72能够对由增加的急性肾损伤时期引起的损 伤的强度进行分级。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物标志物的浓度能够在mRNA水平确定。
6.根据权利要求I所述的方法，其中所述生物标志物的浓度能够使用免疫測定法进行測定。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫測定法是ELISA。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫測定法是蛋白质印迹法。
9.根据权利要求I所述的方法，其中与对照值比较，来自所述生物标志物定量的结果是40-533倍，并且这种增加取决于损伤强度。
全文摘要
本发明涉及一种通过测量尿样中的生物标志物浓度来检测早期急性肾衰竭的可靠的、容易进行的非侵入性诊断方法，所述生物标志物选自70KDa家族的热休克蛋白。更具体地，本发明涉及热休克蛋白72的鉴定，其中所述生物标志物通过ELISA和蛋白质印迹法或通过使用实时RT-PCR在mRNA水平进行鉴定。本发明有助于解决现存于医药领域中的问题，即不能在早期阶段检测急性肾衰竭或检测肾损伤的严重性，从而及时以有效疗法来治疗患者。
文档编号G01N33/68GK102762985SQ201080062143
公开日2012年10月31日 申请日期2010年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者乔纳森·巴雷拉凯莫尔, 诺玛·阿拉塞利·博瓦迪利亚桑多瓦尔 申请人:墨西哥国立自治大学