循环生物标志物的制作方法

循环生物标志物的制作方法
【专利摘要】可评估生物标志物用于诊断、治疗相关或预后方法以鉴定表型(诸如状况或疾病)或者疾病的阶段或进程。可检测循环生物标志物并且任选地将其用于生理状态的分型或确定表型。这些生物标志物包括核酸、蛋白质以及循环结构，诸如囊泡。可出于诊断、预后或治疗诊断目的对生物标志物进行评估，例如，以选择针对疾病、状况、疾病阶段以及状况阶段的候选治疗方案，并且其还可用于确定效力。有用的循环生物标志物的实例包括多肽、核酸(例如，DNA、mRNA、微RNA)和囊泡。
【专利说明】循环生物标志物
交叉引用
[0001]本申请要求于2011年2月24日提交的N0.61/446，313、于2011年6月27日提交的N0.61/501，680、于2011年4月4日提交的N0.61/471，417、于2011年8月15日提交的N0.61/523，763以及于2011年2月22日提交的N0.61/445，273的美国临时专利申请的权益，所有这些申请均以引用方式全文并入本文。
[0002]本申请为2011年8月18日提交的国际专利申请PCT/US2011/048327的部分继续申请，该国际专利申请要求于2010年8月18日提交的N0.61/374，951、于2010年9月2日提交的N0.61/379，670、于2010年9月9日提交的N0.61/381，305、于2010年9月15日提交的 N0.61/383，305、于 2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504、于 2010 年 10 月 15 日提交的 N0.61/393，823、于 2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890、于 2010 年 11 月 17 日提交的 N0.61/414，870、于 2010 年 11 月 23 日提交的 N0.61/416，560、于 2010 年 12 月 10 日提交的61/421，851、于2010年12月15日提交的61/423，557、于2010年12月29日提交的N0.61/428，196的美国临时专利申请的权益，所有这些申请均以引用方式全文并入本文。
[0003]本申请也为2011年3月I日提交的国际专利申请PCT/US2011/026750的部分继续申请，该国际专利申请为2009年11月12日提交的序列号为12/591,226的美国专利申请的部分继续申请，该美国专利申请要求于2008年11月12日提交的N0.61/114，045、于2008 年 11 月 12 日提交的 N0.61/114，058、于 2008 年 11 月 13 日提交的 N0.61/114，065、于2009年2月9日提交的N0.61/151，183、于2009年10月2日提交的61/278，049、于2009年10月9日提交的61/250，454、于2009年10月19日提交的N0.61/253，027的美国临时申请的权益；并且该申请也要求于2010年3月I日提交的N0.61/274，124、于2010年6月22日提交的N0.61/357，517、于2010年7月15日提交的N0.61/364，785的美国临时申请的权益，所有这些申请均以引用方式全文`并入本文。
[0004]本申请也为2011年4月6日提交的国际专利申请PCT/US2011/031479的部分继续申请，该国际专利申请要求于2010年4月6日提交的N0.61/321,392、于2010年4月6日提交的N0.61/321，407、于2010年5月6日提交的N0.61/332，174、于2010年5月25日提交的N0.61/348，214、于2010年5月26日提交的N0.61/348，685、于2010年6月11日提交的N0.61/354，125、于2010年6月16日提交的N0.61/355，387、于2010年6月21日提交的N0.61/356，974、于2010年6月22日提交的N0.61/357，517、于2010年7月8日提交的N0.61/362，674、于2010年11月12日提交的N0.61/413，377、于2010年4月9日提交的N0.61/322，690、于2010年5月13日提交的N0.61/334，547、于2010年7月15日提交的N0.61/364，785、于2010年8月2日提交的N0.61/370，088、于2010年9月2日提交的N0.61/379，670、于2010年9月9日提交的N0.61/381，305、于2010年9月15日提交的N0.61/383，305、于 2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504、于 2010 年 10 月 15 日提交的N0.61/393，823、于2010年11月9日提交的N0.61/411，890以及于2010年11月23日提交的N0.61/416，560的美国临时专利申请的权益，所有这些申请以引用方式全文并入本文。
发明背景[0005]用于诸如癌症的状况和疾病的生物标志物包括生物分子，诸如蛋白质、肽、脂质、RNA、DNA和它们的变体与修饰。
[0006]特定生物标志物(例如DNA、RNA和蛋白质)的鉴定可以提供用于诊断、预后或治疗诊断(theranosis)状况或疾病的生物印记。生物标志物可在体液中检测，包括循环DNA、RNA、蛋白质和囊泡。循环生物标志物包括蛋白质(诸如PSA和CA125)以及核酸(诸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA (mRNA))。循环生物标志物还包括循环囊泡。囊泡是从细胞上脱落的膜包封的结构，并且可见于多种体液中，包括血液、血浆、血清、母乳、腹水、支气管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作为蛋白质、RNA、DNA、病毒和朊病毒的运送载体而参与细胞之间的通讯。微RNA是调控信使RNA转录和降解的短RNA。微RNA已经在体液中发现并且已经观察到其作为从肿瘤细胞上脱落的囊泡内的组分。对与疾病相关的循环生物标志物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助于检测疾病或其严重程度、确定疾病的易感性以及进行治疗决策。
[0007]生物样品中存在的囊泡提供了生物标志物的来源，例如，所述标志物存在于囊泡内(囊泡有效负载)或存在于囊泡的表面上。囊泡的特征(例如尺寸、表面抗原、细胞源的确定、有效负载)还可提供诊断、预后或治疗诊断的结果输出。仍然存在对可用于检测和治疗疾病的生物标志物进行鉴定的需求。与囊泡相关的微RNA和其它生物标志物以及囊泡的特征可提供诊断、预后或治疗诊断。
[0008]本发明提供了用于通过检测作为疾病或疾病进展的指征的生物标志物而表征表型的方法和系统。所述生物标志物可以是循环生物标志物,包括囊泡和微RNA。

【发明内容】

[0009]本文公开了用于通过分析囊泡(诸如存在于来自受试者细胞的生物样品中的囊泡)来表征表型的方法和组合物。表征受试者或个体的表型可以包括但不限于疾病或状况的诊断、疾病或状况的预后、疾病阶段或状况阶段的确定、药物效力、生理状况、器官危困或器官排斥、疾病或状况进展、与疾病或状况的治疗相关关联性或者特定的生理或生物状态。
[0010]在一个方面，本发明提供了检测生物样品中的一种或多种生物标志物的方法，包括:a)使生物样品与设计用于确定该一种或多种生物标志物的存在或水平的试剂接触，其中该一种或多种生物标志物选自图1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、
66、67、69-71、73-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合；和幻鉴定该生物样品中的该一种或多种生物标志物，从而检测该生物样品中的该一种或多种生物标志物。
[0011]所述生物样品可包括生物流体。所述生物流体可包括但不限于外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’ s fluid)或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。例如,所述生物流体可为血液、血液衍生物或血液组成部分,例如血清或血浆。
[0012]在本发明方法的实施方案中，生物样品包含细胞外微囊泡群体。微囊泡群体可包含具有IOnm至1000nm的直径的微囊泡。例如，微囊泡群体可包含具有20nm至200nm、50-100nm、100-1000nm、50-200nm、50-80nm、20-50nm 或 50_500nm 的直径的微囊泡。[0013]在本文方法的一些实施方案中，微囊泡群体在鉴定步骤之前整体地或部分地从生物样品中分离出来。适当的分离技术包括大小排除色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和选择、亲和纯化、亲和捕获、免疫测定、免疫沉淀、微流体分离、流式细胞术或其组合。可使用的其它分离技术在本文中公开或是本领域公知的。
[0014]亲和选择可包括使微囊泡群体与一种或多种结合剂(试剂)接触。所述一种或多种结合剂可为核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、凝集素、肽、树状聚体、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。可使用的其它结合剂在本文中公开或是本领域公知的。
[0015]所述一种或多种结合剂可用来捕获和/或检测微囊泡群体。所述一种或多种结合剂可为特异性结合微囊泡例如微囊泡表面标志物的试剂。该表面标志物可选自四跨膜蛋白CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、膜联蛋白 V、MFG-E8、图 1-60 或表 3-10,12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合。
[0016]在一个实施方案中，所述一种或多种结合剂结合至基底，包括但不限于孔、微珠和/或阵列。所述一种或多种结合剂也可携带诸如本文所述的或本领域公知的标记，包括但不限于磁标记、突光标记、酶标记、放射性同位素、量子点或其组合。
[0017]在本发明的方法中，所述一种或多种生物标志物可为任何可以分析的、有用的生物实体。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含多肽或其功能性片段。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含微囊泡表面抗原或其功能性片段。在其它实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含核酸或其功能性片段。核酸可以是但不限于在循环中和/或在囊泡内发现的DNA、RNA、mRNA、微RNA或其它小RNA。在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含多种类型的生物实体。例如，所述一种或多种生物标志物可包含多肽和核酸分子或其任意一种的功能性片段。
[0018]作为一个非限制的实例，本发明的一个实施方案包含使用针对一种或多种微囊泡表面抗原的一种或多种结合剂对微囊泡群体进行的亲和选择，然后对在选定的微囊泡内发现的核酸和/或多肽进行评估。
[0019]在本发明方法的一个实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含四跨膜蛋白，例如，CD9。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌或肾癌。可对CD9进行评估以表征癌症。
[0020]在本发明方法的另一实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自Gal3、BCA200及其组合。在另一实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自0PN、NCAM及其组合。所述一种或多种标志物可选自Gal3、BCA200、0PN、NCAM及其组合。所述一种或多种标志物可选自Gal3和/或BCA200、OPN和/或NCAM及其组合。所述生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。所述癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。可对所述一种或多种标志物进行评估以表征乳腺癌。
[0021]所述一种或多种生物标志物可选自四跨膜蛋白、⑶45、FasL, CTLA4、⑶31、DLL4、VEGFR2、HIF2a、Tie2、Angl、Mucl、CD147、TMPl、TMP2、MMP7、MMP9 及其组合。所述一种或多种生物标志物可选自 CD83 和 FasL、CTLA4 和 CD80、CD147 和 TMP1、TMP2 和 MMP9、HIF2a和Angl、VEGFR2和Tie2、CD45和CTL4A、DLL4和CD31及其组合。所述生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。所述癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。
[0022]所述一种或多种生物标志物可选自5T4(滋养层)、ADAM10、AGER/RAGE、APC、APP(P -淀粉样蛋白)、ASPH(A-1O)、B7H3 (CD276)、BACEl、BAI3, BRCAl、BDNF、BIRC2、C1GALT1、CA125 (MUC16)、钙调蛋白 1、CCL2 (MCP-1)、CD9、CD10、CD 127 (IL7R)、CD174、CD24、CD44、CD63、CD81、CEA、CRMP-2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYFRA2 UderlinU DLL4、DPP6、E-CAD、EpCaM, EphA2(H-77)、ER(I)ESRl a、ER(2)ESR2 3、Erb B4、Erbb2、erb3 (Erb_B3)PA2G4、FRT (FLTl)、Gal3、GPR30 (G_ 联结 ERl)、HAPU HER3、HSP-27、HSP70、IC3b、IL8、insig、连接斑珠蛋白、角蛋白 15、KRAS、乳腺珠蛋白、MART 1、MCT2、MFGE8、MMP9、MRP8、Muc 1、MUCl 7、MUC2、NCAM、NG2 (CSPG4)、Ngal、NHE-3, NT5E (CD73)、ODCU OPG, OPN、p53、PARK7、PCSA、卩6?9.5(?八胱5)、？1?(8)、？5八、？5獻、狀6￡、5丁父8?4、存活蛋白、丁卩卩3(分泌的),TIMPU TIMP2,TMEM211、TRAF4(支架)、TRAIL-R2 (死亡受体 5)、TrkB, TsglOl、UNC93a、VEGFA, VEGFR2、YB-U VEGFRU GCDPF-15 (PIP)、BigH3 (TGFbl-诱导的蛋白质)、5HT2B(5_ 羟色胺受体 2B)、BRCA2、BACE1、⑶Hl-钙黏着蛋白及其组合。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。可对所述一种或多种生物标志物进行评估以表征乳腺癌。
[0023]在另一实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自AK5.2、ATP6V1B1、CRABPl及其组合。所述一种或多种生物标志物可选自DST.3、GATA3、KRT81及其组合。所述一种或多种标志物可选自 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPU DST.3、ELF5、GATA3、KRT81、LALBA, 0XTR、RASL10A、SERHL、TFAP2A.1、TFAP2A.3、TFAP2C、VTCNl及其组合。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。在一个实施方案中，可对一种或多种标志物进行评估以表征原发部位不明癌症是否源自乳腺癌。
[0024]在一些实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自表89中的生物标志物及其组合。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。在一个实施方案中，`对一种或多种标志物进行评估以表征乳腺癌。在另一实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自表90中的生物标志物及其组合。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。在一个实施方案中，对一种或多种标志物进行评价以表征乳腺癌，例如，原位导管癌(DCIS)。在又一实施方案中，所述一种或多种标志物选自表91中的生物标志物及其组合。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于乳腺癌。在一个实施方案中，对一种或多种标志物进行评估以表征乳腺癌，例如，来区分DCIS或非DCIS乳腺癌。
[0025]根据本发明方法评估的一种或多种生物标志物可选自MS4A1、PRB、DR3及其组合。所述一种或多种生物标志物也可选自PRB、MACC1及其组合。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于肺癌。在一个实施方案中，对一种或多种标志物进行评估以表征肺癌。
[0026]在本发明方法的另一实施方案中，所述一种或多种生物标志物选自表92中的生物标志物及其组合。在又一实施方案中，所述一种或多种生物标志物包含一种或多种选自 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-650、hsa-miR-194、hsa-miR-1200、hsa—miR-326、hsa_miR-30b*、hsa_miR-19a、hsa_miR-7a*、hsa—miR-708*、hsa_miR-99a、hsa-miR-199b_5p、hsa-miR-543、hsa-miR-7hsa_miR-518c*、hsa-miR-642、hsa-miR-654_3p、hsa-miR-518d_5p、hsa-miR-1266、hsa-miR-154、hsa-miR-662、hsa-miR-523、 hsa-miR-198、 hsa-miR-920、 hsa-miR-885_3p、 hsa_miR-99a*、hsa-miR-337_3p、hsa-miR-363及其组合的微RNA。所述一种或多种生物标记物也可包含miR-497微RNA。生物样品可为已知的或疑似的癌症样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于肺癌。在一个实施方案中，对一种或多种标志物进行评估以表征肺癌。
[0027]在上述方法中，所述一种或多种生物标志物可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1215、20种或更多种所列的生物标志物。所述一种或多种生物标志物可包括所有上述生物标志物。所述一种或多种生物标志物可包含任何可测量的生物实体，包括但不限于蛋白质、核酸或其组合。例如，所述一种或多种生物标志物可以是肽、多肽、蛋白质或其片段。或者，所述一种或多种生物标志物可以是核酸，如DNA或RNA，包括但不限于mRNA、微RNA或其片段。所述一种或多种生物标志物也可包含生物实体的组合，例如，至少一种蛋白质和至少一种核酸。
[0028]在本发明方法的一些实施方案中，用针对一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂捕获微囊泡群体，并用针对生物标志物的结合剂对其进行检测，该生物标志物选自四跨膜蛋白 CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG_E8、图 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合。例如，所述一种或多种生物标志物可包括一种或多种上述生物标志物。
[0029]本发明方法的实施方案进一步包括检测微囊泡群体内的有效负载(payload)的水平。所检测的有效负载可以是囊泡内任何可测量的生物实体，包括但不限于一种或多种核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所检测的有效负载可包含一种或多种选自上述生物标志物或图1-60或表3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60-64、
66、67、69-70、74-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合的生物标志物。核酸生物标志物可包含一种或多种 DNA、mRNA、微 RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA 或 shRNA。例如，核酸可包括一种或多种上述的微RNA，或选自表5-9、30-44、58-59、71和73任一个中的微RNA。核酸标志物也可包含一种或多种上述的mRNA，或选自图1_60或表3_10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合。蛋白质生物标志物可包含一种或多种上述的肽、多肽、蛋白质或其片段，或选自图 1-60 或表 3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合。
[0030]本发明的方法可进一步包括针对至少一种另外的生物标志物分析生物样品，该另外的生物标志物选自上述生物标志物，四跨膜蛋白⑶9、⑶31、⑶63、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG-E8、图 1-60 或表 3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60_64、66、
67、69-70、74-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合。所述一种或多种另外的生物标志物可用本文包含的或本领域已知的任何有用方法进行检测。
[0031]如上指出，生物样品可包含已知的或疑似的癌症样品。在一些实施方案中，生物样品包含癌细胞培养物或来自患有或疑似患有该癌症的受试者的样品。癌症可为本文公开的癌症，包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明癌；类癌瘤；原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；肺癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性赘生物；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌；胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。
[0032]上述方法可进一步包括将一种或多种生物标志物的存在或水平与参照进行比较，其中相对于参照改变的存 在或水平为癌症提供了诊断、预后或治疗诊断决定。针对癌症的诊断、预后或治疗诊断决定可包括癌症或癌症可能性的诊断，癌症的预后，癌症的治疗诊断，确定癌症是否对治疗处理正作出反应，或确定癌症是否有可能对治疗处理有反应。在实施方案中，治疗处理选自表10-13或69。参照可来自没有癌症的生物样品。参照可来自在一个或多个不同时间点测定的一系列生物样品。在实施方案中，与参照相比样品中一种或多种生物标志物的水平的提高指示样品中癌症的存在或可能性，或样品中更晚期癌症的存在或可能性。
[0033]在另一方面，本发明提供了一种试验，其包括:a)从生物样品中分离细胞外微囊泡，其中该微囊泡包含一种或多种RNA分子，其中所述一种或多种RNA分子是与上述生物标志物或图 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92任一个中的生物标志物相对应的诊断指示物；b)测定微囊泡中所述一种或多种RNA分子的量；和c)将测定的一种或多种RNA分子的量与一种或多种对照水平进行比较，其中如果细胞外微囊泡中的一种或多种RNA分子的量与一种或多种对照水平相比存在差异，则检测出癌症。分离步骤可包括本文公开的或本领域已知的方法，例如，大小排除色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和选择、亲和纯化、亲和捕获、免疫测定、免疫沉淀、微流体分离、流式细胞术或其组合。在一个实施方案中，亲和选择包括使微囊泡群体与一种或多种结合剂接触，该结合剂特异性结合选自上述生物标志物和/或图1-60或表 3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合的微囊泡表面标志物。
[0034] 上述方法可在体外进行。在一个相关方面，本发明提供了一种或多种试剂在实施所述方法中的应用。类似地，本发明提供了包含用来实施所述方法的一种或多种试剂的试剂盒。所述一种或多种试剂可包含针对所述方法中的一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂。所述一种或多种试剂也可以是针对一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂，该生物标志物选自图 1-60 或表 3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合。在一个实施方案中，所述一种或多种结合剂包含抗体或适体。所述一种或多种结合剂可系留(tethered)于基底上。所述一种或多种结合剂可以是标记的。所述一种或多种结合剂可包含各种形式的多种结合剂，例如，一种或多种结合剂可系留于基底上和单独的一种或多种标记的结合剂。所述标记可以是本文所述的或本领域已知的任何有用的标记，例如，磁标记、荧光标记、酶标记、放射性同位素或量子点。
[0035]在一个方面，本发明提供了一种分离的囊泡，其包含选自上述方法中列出的生物标志物及其组合的一种或多种生物标志物。在一个实施方案中，所述囊泡包含选自图1-60或表 3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合的一种或多种生物标志物。
援引并入
[0036]本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其引用的程度如同每一份单独的公开、专利或专利申请均特定地且单独地表明以引用的方式并入一般。
【专利附图】

【附图说明】
[0037]本发明的新特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对其中利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优势更好的理解，在附图中:
[0038]图l(a)_(g)示出了表格，其列出了按细胞/组织的谱系、组比较和特定的疾病状态的示例性癌症，以及对这些癌症、分组细胞/组织比较和特定的疾病状态具有特异性的抗原。此外，所述的抗原可以为生物标志物。所述的一种或多种生物标志物可相对于参照而改变，例如，是存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0039]图2(a)_(f)示出了表格，其列出了按细胞/组织的谱系、组比较和特定的疾病状态的示例性癌症，以及对这些癌症、组细胞/组织比较和特定的疾病状态具有特异性的结合剂。
[0040]图3(a)_(b)是列出了示例性乳腺癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自乳腺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生乳腺癌特异性的囊泡生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0041]图4(a)_(b)是列出了示例性卵巢癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自卵巢癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生卵巢癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0042]图5是列出了示例性肺癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自肺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生肺癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0043]图6 (a)-(d)是列出了示例性结肠癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自结肠癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生了结肠癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0044]图7是列出了对腺瘤对增生性息肉具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自腺瘤对增生性息肉特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0045]图8是列出了对于炎性肠病(IBD)对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对炎性肠病相对正常组织具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0046]图9(a)_(c)是列出了对于腺瘤相对结肠直肠癌(CRC)具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于腺瘤对结肠直肠癌具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0047]图10是列出了对于IBD相对CRC具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于IBD对CRC具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0048]图11 (a)-(b)是列出了对于Dukes CRC B相对Dukes CRC C-D具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于Dukes CRC B相对Dukes CRCC-D具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0049]图12(a)-(d)是列出了对于低度异型增生的腺瘤对高度异型增生的腺瘤具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于低度异型增生的腺瘤对高度异型增生的腺瘤具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0050]图13(a)_(b)是列出了对于溃疡性结肠炎(UC)相对克罗恩病(CD)具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于UC相对CD具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0051]图14是列出了对于增生性息肉相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于增生性息肉相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。 [0052]图15是列出了对于具有低度异型增生的腺瘤相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于具有低度异型增生的腺瘤相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0053]图16是列出了对于腺瘤相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于腺瘤相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0054]图17是列出了对于CRC相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自对于CRC相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0055]图18是列出了良性前列腺增生特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自良性前列腺增生特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0056]图19 (a)-(c)是列出了示例性前列腺癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自前列腺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生前列腺癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0057]图20(a)_(c)是列出了示例性黑色素瘤生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自黑色素瘤特异性的囊泡且对其进行分析以产生黑色素瘤特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0058]图21 (a)-(b)是列出了示例性胰腺癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自胰腺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生胰腺癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0059]图22是列出了脑癌特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自脑癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生脑癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0060]图23(a)_(b)是列出了示例性银屑病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自银屑病特异性的囊泡且对其进行分析以产生银屑病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0061]图24(a)_(c)是列出了示例性心血管疾病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自心血管疾病特异性的囊泡且对其进行分析以产生心血管疾病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0062]图25是列出了血液恶性肿瘤特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自血液恶性肿瘤特异性的囊泡且对其进行分析以产生血液恶性肿瘤特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0063]图26(a)_(b)是列出了 B细胞慢性淋巴细胞性白血病特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自B细胞慢性淋巴细胞性白血病特异性的囊泡且对其进行分析以产生B细胞慢性淋巴细胞性白血病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0064]图27是列出了 B细胞淋巴瘤及B细胞淋巴瘤-DLBCL特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自B细胞淋巴瘤及B细胞淋巴瘤-DLBCL特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
`[0065]图28是列出了 B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样和B细胞淋巴瘤DLBCL特异性的示例性生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样和B细胞淋巴瘤-DLBCL特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0066]图29是列出了示例性伯基特氏淋巴瘤生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自伯基特氏淋巴瘤特异性的囊泡且对其进行分析以产生伯基特氏淋巴瘤特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0067]图30(a)_(b)是列出了示例性肝细胞癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自肝细胞癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生肝细胞癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0068]图31是列出了示例性宫颈癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自宫颈癌特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0069]图32是列出了示例性子宫内膜癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自子宫内膜癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生子宫内膜癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。[0070]图33(a)_(b)是列出了示例性头颈癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自头颈癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生头颈癌的特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0071]图34是列出了示例性炎性肠病(IBD)生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自IBD特异性的囊泡且对其进行分析以产生IBD特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0072]图35是列出了示例性糖尿病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自糖尿病特异性的囊泡且对其进行分析以产生糖尿病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0073]图36是列出了示例性巴雷特食管(Barrett’s Esophagus)生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自巴雷特食管特异性的囊泡且对其进行分析以产生巴雷特食管特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0074]图37是列出了示例性纤维肌痛生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自纤维肌痛特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0075]图38是列出了示例性中风生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自中风特异性的囊泡且对其进行分析以产生中风特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0076]图39是列出了示例性多发性硬化症(MS)生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自MS特异性的囊泡且对其进行分析以产生MS特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0077]图40(a)_(b)是列出了示例性帕金森氏病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自帕金森氏病特异性的囊泡且对其进行分析以产生帕金森氏病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0078]图41是列出了示例性风湿病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自风湿病特异性的囊泡且对其进行分析以产生风湿病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0079]图42(a)_(b)是列出了示例性阿尔茨海默氏病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自阿尔茨海默氏病特异性的囊泡且对其进行分析以产生阿尔茨海默氏病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0080]图43是列出了示例性朊病毒疾病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自朊病毒疾病特异性的囊泡且对其进行分析以产生朊病毒疾病特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0081]图44是列出了示例性脓毒症生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自脓毒症特异性的囊泡且对其进行分析以产生脓毒症特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0082]图45是列出了示例性慢性神经病理性疼痛生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自慢性神经病理性疼痛特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0083]图46是列出了示例性周围神经病理性疼痛生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自周围神经病理性疼痛特异性的囊泡且对其进行分析。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。`
[0084]图47是列出了示例性精神分裂症生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自精神分裂症特异性的囊泡且对其进行分析以产生精神分裂症特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0085]图48是列出了示例性双相型障碍或疾病生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自双相型障碍特异性的囊泡且对其进行分析以产生双相型障碍特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0086]图49是列出了示例性抑郁症生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自抑郁症特异性的囊泡且对其进行分析以产生抑郁症特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0087]图50是列出了示例性胃肠道间质瘤(GIST)生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自GIST特异性的囊泡且对其进行分析以产生GIST特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。[0088]图51(a)_(b)是列出了示例性肾细胞癌(RCC)生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自RCC特异性的囊泡且对其进行分析以产生RCC特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0089]图52是列出了示例性肝硬化生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自肝硬化特异性的囊泡且对其进行分析以产生肝硬化特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0090]图53是列出了示例性食管癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自食管癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生食管癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0091]图54是列出了示例性胃癌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自胃癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生胃癌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0092]图55是列出了示例性孤独症生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自孤独症特异性的囊泡且对其进行分析以产生孤独症特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0093]图56是列出了示例性器官排斥反应生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自器官排斥反应特异性 的囊泡且对其进行分析以产生器官排斥反应特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种 生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0094]图57是列出了示例性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性的囊泡且对其进行分析以产生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0095]图58是列出了示例性易损斑块生物标志物的表格，其中所述的生物标志物可以来自易损斑块特异性的囊泡且对其进行分析以产生易损斑块特异性的生物印记。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0096]图59(a)_(i)是列出了示例性基因融合的表格，其中所述的基因融合可以来自囊泡或由囊泡进行分析。所述的基因融合可以为生物标志物，并且可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
[0097]图60(a)_(b)为基因及其相关miRNA的表格，其中所述的基因(例如该基因的mRNA)、其相关miRNA或者它们的任意组合可以用作可由囊泡分析得到的一种或多种生物标志物。此外，所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的。
[0098]图61A描述了鉴定包含核酸的生物印记以表征表型的方法。图61B描述了鉴定囊泡或囊泡群体的生物印记以表征表型的方法。
[0099]图62详细说明了对囊泡上的蛋白质进行筛选所获得的结果，所述蛋白质可用作为所述囊泡的生物标志物。针对所述蛋白质的抗体可用作为结合剂。经鉴定为囊泡的生物标志物的蛋白质的实例包括Be 1-XL、ERCC1、角蛋白15、⑶81/TAPA-1、⑶9、上皮特异性抗原(ESA)和肥大细胞糜蛋白酶。所述生物标志物在囊泡中或囊泡上可以是存在或不存在的，表达不足或过表达的，突变的或修饰的，并且可用于表征状况。
[0100]图63详细描述了通过评估囊泡生物印记而表征表型的方法。图63A为涂敷有捕获抗体的平面基底的简图，所述的捕获抗体捕获表达所述蛋白质的囊泡。所述捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原，或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图63B为涂敷有捕获抗体的珠的简图，所述捕获抗体捕获表达所述蛋白质的囊泡。所述的捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对于源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原，或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图63C为筛选方案的实例，其可以通过使用如图63B中所示的珠以多重方式实施。图63D示出了捕获或检测囊泡以表征表型的说明性示意图。图63E示出了用于评估囊泡有效负载以表征表型的示意图。
[0101]图64为蛋白质表达模式的示意图。通常，不同的蛋白质并非平均或均一地分布于囊泡的壳上。囊泡特异性的蛋白质通常更为常见，而癌症特异性的蛋白质是较少见的。使用更常见的较低癌症特异性的蛋白质可以更容易地完成囊泡的捕获，而癌症特异性的蛋白质可以用于检测阶段中。
[0102]图65详细说明了可以在本发明的一些示例性实施方案中使用的计算机系统。
[0103]图66A-B描绘了 EpCam偶联的珠的扫描电子显微照片(SEM)，其中所述的珠已经与VcaP囊泡一起孵育。
[0104]图67详细说明了使用检测来自受试者的囊泡的基于珠的方法描述结果的方法。图67A是对于单个患者，使用在图63B中所描述的筛选方案的珠数量和信号强度的图，其中~100个捕获珠用于每个患者的各捕获/检测结合分析。对于给定的患者而言，输出结果显示了相对信号强度的所检测的珠的数量。在给定强度下捕获的珠的数量为囊泡以怎样的频率在所述强度下表达检测蛋白质的指示。对于给定的珠而言，信号的强度越强，则检测蛋白质的表达越多。图67B为通过将正常的患者组合到一条曲线中而将癌症患者组合到另一条曲线中，并使用生物统计分析区分所述曲线而得到的归一化的图。对由各个个体得到的数据归一化以考虑由检测仪器所读取的珠的数量的差异，将这些数据加和，然后再次归一化考虑各群体中不同的样品数量。
[0105]图68详细说明了图示了前列腺癌的生物印记。图68 (A)为由使用微球平台的多重试验而收集的强度值的柱状图，其中珠被CD63抗体功能化，与由患者血浆纯化的囊泡孵育，然后用藻红蛋白(PE)偶联的EpCam抗体标记。较深的阴影的柱(蓝)表示12名正常受试者的群体，而较浅的阴影的柱(绿)得自7名3期前列腺癌患者。图68(B)是根据图67所述对图68 (A)中所示出的各柱状图进行归一化的图。对于前列腺癌患者样品和正常样品两者，分布为对来自图68 (A)的微球结果的强度值的高斯拟合。图68 (C)为图68 (B)中示出的前列腺癌生物印记之一的实例，即⑶63对⑶63生物印记(上方的图)，其中⑶63用作检测剂及捕获抗体。下方的3个图示出了在3种前列腺癌细胞系(VCaP、Lncap和22RV1)上的流式细胞分析的结果。水平线上方的点表示捕获了具有CD63的囊泡(包含B7H3)的珠。垂直线右侧的珠表示捕获了具有CD63的囊泡(具有PSMA)的珠。在线上方和线右侧的这些珠具有所有的3种抗原。CD63是与囊泡相关的表面蛋白质，PSMA是与前列腺细胞相关的表面蛋白质，而B7H3是与侵袭性癌症(具体而言为前列腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌)相关的表面蛋白质。所有这3种抗原结合在一起鉴定出来自癌症前列腺细胞的囊泡。大部分表达CD63的前列腺癌囊泡还具有前列腺特异性膜抗原PSMA和B7H3 (参与调节肿瘤细胞迁移和入侵，并且为侵袭性癌症及临床结果的指示)。图68 (D)为前列腺癌囊泡的形态。上方的图示出了使用CD63、CD9和CD81以多种组合进行捕获和标记的结果。几乎所有的点都位于右上象限，表明这3种标志物是高度偶合的。下一列描述了使用B7H3捕获并使用CD63和PSMA标记细胞系囊泡的结果。VCaP和22RV1都表明，使用B7H3捕获的大多数囊泡还具有CD63，并且存在两种群体，即，具有PSMA的群体和不具有PSMA的群体。由于LNcap不具有大量的包含B7H3的囊泡(不存在大量具有CD63的点)，B7H3的存在可以是癌症侵袭性程度的指示。LnCap为早期前列腺癌类似细胞系。
[0106]图69说明了结肠癌的生物印记。(A)描述了由使用了微球平台的各种多重试验而收集的强度值的柱状图，其中使用捕获抗体对珠功能化，将其与从患者血浆纯化的囊泡一起孵育，然后用检测抗体标记。较深的阴影柱(蓝)表示来自正常的群体，而较浅的阴影柱(绿)来自结肠癌患者。(B)示出了(A)中所示各柱状图的归一化图。(C)描述了由多重试验收集的强度值的柱状图，其中被⑶66抗体(捕获抗体)功能化的珠与由患者血浆纯化的囊泡一起孵育，然后用与PE偶联的EpCam抗体(检测抗体)标记。红色的群体来自6名正常的受试者，而绿色群体来自21名结肠癌患者。将由各个体得到的数据归一化以考虑所检测的珠数目的差异，将这些数据加在一起，然后再次归一化以考虑各群体中不同的样品数目。
[0107]图70显示多重检测剂可以增大信号。(A)当囊泡标记有多种与前列腺特异性PE偶联的抗体时，中位强度值被绘制为来自VCaP细胞系的纯化浓度的函数。各图的右侧列出了以EpCam(左侧的图)或PCSA(右侧的图)捕获的囊泡以及通过检测抗体所检测的多种蛋白质。在这两种情况下，CD9与CD63的组合均得到了超出背景的最佳信号增加(底部图描绘增加百分率)。CD9与CD63的组合得到超出背景的大约200%的百分增加。(B)进一步显示前列腺癌/前列腺囊泡特异性标志物的复用改善了前列腺癌细胞源的囊泡的检测。当使用多种前列腺特异性PE偶联的抗体进行标记时，中位强度值被绘制为来自VCaP细胞系的纯化浓度的函数。描绘了以PCSA(左侧的图)和EpCam(右侧的图)捕获的囊泡。在这两种情况下，B7H3与PSMA的组合均得到了超出背景的最佳信号增加。
[0108]图71说明了使用⑶63检测剂和⑶63捕获按阶段对于结肠癌的结肠癌生物印记。强度柱状图得自使用CD63涂敷的珠捕获的并使用CD63偶联PE标记的囊泡。在对照组中有6位患者(A)，I期中有4位患者(B)，II期中有5位患者(C)，III期中有8位患者⑶，和IV期中有4位患者(E)。由各个个体得到的数据经归一化以考虑所检测的珠数量的变化，将这些数据加在一起，然后再次归一化以考虑各群体中的不同样品数(F)。
[0109]图72说明了使用EpCam检测剂和CD9捕获对于按阶段的结肠癌的结肠癌生物印记。强度柱状图得自使用CD9涂敷的珠捕获的并使用EPCam标记的囊泡。其中，在对照组(A) ,I期(B)、11期(C)、111期⑶和VI期(E)中都有患者。由各个个体得到的数据以归一化以考虑所检测的珠数量的变化，将这些数据加在一起，然后再次归一化以考虑各群体中的不同样品数(F)。
[0110]图73说明了(A)使用针对所列蛋白质的抗体(列出作为检测和捕获抗体)检测前列腺癌的灵敏度、特异性以及置信度水平。⑶63、⑶9和⑶81为一般标志物，并且EpCam为癌症标志物。单个结果描绘于(B)中，对于EpCam对CD63而言，以99%的置信度，100%(n=8)的癌症患者样品不同于广义正态分布，并且以99%的置信度，77%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布；(C)对于⑶81对⑶63而言，以99%的置信度，90%(n=5)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，77%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布；(D)对于⑶63对⑶63而言，以99%的置信度，60%(n=5)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，80%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布；(E)对于CD9对⑶63而言，以99%的置信度，90%(n=5)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，77%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布。
[0111]图74说明了(A)使用针对所列蛋白质的抗体(列出作为检测和捕获抗体)检测结肠癌的灵敏度和置信度水平。⑶63和⑶9为一般标志物，EpCam为癌症标志物，并且⑶66为结肠标志物。单个结果描绘于(B)中，对于EpCam对⑶63而言，以99%的置信度，95%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，100%(n=6)正常患者样品不同于广义正态分布；(C)对于EpCam对⑶9而言，以99%的置信度，90%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，77%(n=6)正常患者样品不同于广义正态分布；(D)对于⑶63对⑶63而言，以99%的置信度，60%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，80%(n=6)的正常患者样品不同于广义正态分布；(E)对于CD9对⑶63而言，以99%的置信度，90%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，77%(n=6)的正常患者样品不同于广义正态分布；(F)对于CD66对CD9而言，以99%的置信度，90%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布，以99%的置信度，77%(n=6)的正常患者样品不同于广义正态分布。
[0112]图75说明了通过评估TMPRSS2-ERG表达使用EpCam对来自血浆的前列腺癌细胞源囊泡的捕获。(A)将渐变量的VCAP纯化囊泡掺入正常血浆中。使用具有EPCAM抗体或其同种型对照的Dynal珠分离囊泡。分离来自囊泡的RNA，并使用qRT-PCR测量TMPRSS2:ERG融合转录物的表达。(B)将VcaP纯化的囊泡掺入到正常血浆中，然后与涂敷有EpCam或同种型对照抗体的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分离RNA。使用来自各样品的等体积RNA来进行RT-PCR以及随后的Taqman分析。(C)在使用EpCam和IgG2同种型阴性对照珠捕获的22RV1囊泡之间SPINKl和GAPDH转录物的循环阈值(CT)差异。CT值越高表明转录物的表达越低。
[0113]图76说明了在VCaP前列腺癌细胞源囊泡与正常血浆囊泡之间的前10种差异表达的微RNA。通过超速离心、接着通过RNA分离得到VCAP细胞系囊泡和来自正常血浆的囊泡。使用qRT-PCR分析得到微RNA谱。前列腺癌细胞系源囊泡具有较高水平(较低CT值)的所示微RNA，如在柱状图中所描述的。
[0114]图77描述了使用⑶9珠捕获的miR-21表达的柱状图。将得自前列腺癌患者的Iml血浆、250ng/ml的LNCaP或正常的纯化囊泡与⑶9涂敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分离RNA。此外，对一份样品(#6)不进行捕获以用于比较。使用qRT-PCR测量miR-21的表达，并比较各样品的平均CT值。⑶9捕获改善了前列腺癌样品中miR-21的检测。
[0115]图78描述了使用⑶9珠捕获的miR-141表达的柱状图。本实验按照图77实施，其中使用qRT-PCR测量miR-141的表达，而并非miR-21。
[0116]图79是示出了使用对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕获剂对从样品(#126)分离的囊泡检测生物标志物CD9、CD81和CD63 (A-D)或B7H3和EpCam(E-H)的图，所述囊泡使用具有 IOOkDa MWCO 的 500 ill 柱(Mi I lipore, Billerica, MA) (A、E)、具有 150kDa MWCO 的 7ml 柱(Pierce?, Rockford, IL) (B、F)、具有 IOOkDa MWCO 的15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (C、G)或具有 150kDa MWCO 的 20ml 柱( Pierce?,Rockford, IL) (D、H)分离。
[0117]图80 是示出了使用对 CD9、CD63、CD81、PSMA, PCSA, B7H3 和 EpCam 的捕获剂对从样品(#342)分离的囊泡的生物标志物CD9、CD81和CD63 (A-D)或B7H3和EpCam(E-H)进行检测的图，所述囊泡使用具有IOOkDa MWCO的500 yl柱(Millipore, Billerica, MA)(A、E)、具有 150kDa MWCO 的 7ml 柱(Pierce?, Rockford, IL) (B、F)、具有 IOOkDa MWCO的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (C、G)或具有 150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce?,Rockford, IL) (D、H)分离。
[0118]图81是示出了在一种样品(#126) (A-C)相对另一种样品(#117) (D-F)的对比中使用对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕获剂对囊泡的生物标志物CD9、CD81和⑶63或B7H3和EpCam进行检测的图，其使用了具有150kDa MWCO的7ml柱(Pierce⑧，Rockford, IL) (A、D)、具有 IOOkDa MWCO 的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (B、E)或150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce?, Rockford, IL) (C、F)。
[0119]图82是显示了生物标志物⑶9、⑶63和⑶81的检测的图，其使用了捕获剂A)⑶9、B)PCSA、OPSMA和D)EpCam。囊泡分离自对照样品(健康样品)和前列腺癌样品，II期前列腺癌(PCa)样品。与囊泡的超速离心分离相比，通过使用基于柱的过滤分离方法改善了PCa和对照之间的分离。
[0120]图83描述了分离自患者样品(#126)的囊泡的各种生物标志物的检测水平在使用超速离心与基于过滤器的方法之间的比较，所述基于过滤器的方法使用了具有IOOkDa分子量截止值(MWCO)的500iil柱(Millipore, Billerica, MA)。所述图描述了 A)超速离心纯化的样品；B)Microcon样品；C)超速离心纯化样品和IOug Vcap以及D)具有IOugVcap的Microcon样品。所使用的捕获剂是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3和EpCam，并且检测到了 CD9、CD81 和 CD63。
[0121]图84描述了分离自患者样品(#342)的囊泡的各种生物标志物的检测水平在使用超速离心与基于过滤器的方法之间的比较，所述基于过滤器的方法使用了具有IOOkDaMWCO的500 ill柱(Millipore, Billerica, MA)。所述图描述了 A)超速离心纯化的样品；B)Microcon样品；C)超速离心纯化样品和IOug Vcap以及D)具有IOug Vcap的Microcon样品。所使用的捕获剂是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3和EpCam，并且检测到了 CD9、CD81 和 CD63。
[0122]图85详细说明了使用MoFlo XDP进行的囊泡分离和鉴定。
[0123]图86A-86D详细说明了血浆中囊泡的流式分选。图86A示出了对前列腺癌患者血浆中PCSA阳性囊泡的检测和分选。图86B示出了对正常和前列腺癌患者血浆中⑶45阳性囊泡的检测和分选。图86C示出了对正常和乳腺癌患者血浆中⑶45阳性囊泡的检测和分选。图86D示出了对正常和前列腺癌患者血浆中DLL4阳性囊泡的检测和分选。
[0124]图87是检测样品中囊泡的示意图，其中使用微球平台评估所希望的囊泡的存在或水平。图87A是使用基于柱的过滤方法从血浆中分离囊泡的示意图，其中所述分离的囊泡随后使用微球平台进行评估。图87B是由于诸如超速离心这样的高速离心而导致囊泡膜压缩的示意图。图87C是使用激光检测对结合于微球的囊泡进行检测的示意图。
[0125]图88A详细说明了囊泡生物印记区分正常前列腺和PCa样品的能力。癌症标志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡标志物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特异性标志物包括PCSA。据发现所述测试对于PCa对比正常样品具有96%的灵敏度和95%的特异性。图88B在Y轴上示出了正常和前列腺癌患者中图88A的囊泡标记物的平均荧光强度(MFI)。
[0126]图89A本发明的囊泡分析对比传统PCa测试的改善的灵敏度。图89B详细说明了本发明的囊泡分析对比传统PCa测试的改善的特异性。
[0127]图90详细说明了使用⑶63对对BPH样品与正常和PCa样品的区分。
[0128]图91详细说明了囊泡生物印记区分正常前列腺和PCa样品的能力。癌症标志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡标志物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特异性标志物包括PCSA。据发现所述测试对于PCa对比正常`和BPH样品具有98%的灵敏度和84%的特异性。
[0129]图92详细说明了用于PCa的本发明囊泡分析对比传统测试的改善特异性，即使在包括BPH样品的情况下。
[0130]图93详细说明了本发明的囊泡分析对比传统PCa测试的ROC曲线。
[0131]图94示出了一般囊泡(如囊泡“MV” )水平、前列腺特异性MV和具有癌症标志物的MV的水平之间的相关性。
[0132]图95详细说明了在PCa和正常样品之间显著不同的囊泡标志物。
[0133]图96是A)囊泡前列腺癌分析的示意图，其产生了决策树B)、C)、D)以用于确定样品对于前列腺癌是否为阳性。
[0134]图97A示出了根据所述决策树针对前列腺癌的囊泡检测分析相对于使用提高的PSA水平进行检测的结果。图97B示出了根据所述决策树对933例PCa和非PCa患者样品的组群进行的针对前列腺癌的囊泡检测分析的结果。图97C示出了对应于图97B中示出的数据的ROC曲线。
[0135]图98详细说明了使用聚类分析设定前列腺癌囊泡生物标志物的MFI阈值。A)149例样品的原始数据和log转换数据。所述原始数据在左栏中作图并且所述转换数据在右栏中作图。B)使用log转换数据作为输入进行PSMA vs B7H3的聚类分析。圆环(正常)和X(癌症)显示了发现的两个聚类。空心大圆环显示了用作为聚类中心的点。蓝线显示了针对各参数选择的截止值。C)使用log转换数据作为输入进行的PCSA vs B7H3的聚类分析。圆环(正常)和X(癌症)显示了发现的两个聚类。空心大圆环显示了用作聚类中心的点。蓝线显示了针对各参数选择的截止值。D)使用log转换数据作为输入进行的PSMAvsPCSA的聚类分析。圆环和X显示了发现的两个聚类。红色空心大圆环显示了用作聚类中心的点。蓝线示出了针对各参数选择的截止值。E)将在B-D)中确定的阈值应用于包含313例样品的更大数据组，并且产生了 92.8%的灵敏度和78.7%的特异性。
[0136]图99以y轴上示出了评估前列腺癌(癌症)和正常(正常)样品中的囊泡的平均荧光强度(MFI)。囊泡蛋白生物标志物在X轴上标示，其从左至右包括⑶9、PSMA, PCSA,CD63、CD81、B7H3、IL-6、OPG-13 (也称为 0PG)、IL6R、PA2G4、EZH2、RUNX2、SERPINB3 和 EpCam。
[0137]图100详细说明了使用抗体阵列进行的BPH相对III期PCa的区分。
[0138]图101详细说明了分离自对照和PCa样品的囊泡中的miR-145水平。
[0139]图102A-102B详细说明了分离自对照(非PCa)和前列腺癌样品的囊泡中的miR-107 (图102A)和miR-574_3p (图102B)水平，如在X轴上标明的。使用Taqman分析在分离的囊泡中检测miR。该图下方示出了 P值。Y轴示出了检测到的miR的拷贝数。在图102B中，将来自各样品组的两个离群值样品排除于分析之外，所述离群值样品具有远超样品偏差的拷贝数。
[0140]图103A-103D详细说明了分离自转移性(Ml)和非转移性(MO)前列腺癌样品的囊泡中的 miR-141 (图 103A)、miR-375 (图 103B)、miR_200b (图 103C)和 miR-574_3p (图103D)的水平。使用Taqman分析检测分离的囊泡中的miR。
[0141]图104A-104B详细说明了使用miR-107和miR141确认来自基于囊泡的前列腺癌诊断分析的假阴性。图104A详细说明了使用囊泡中miR的分析以将假阴性转换成真阳性的示意图，由此改善了灵敏度。图104B详细说明了使用囊泡中miR的分析以将假阳性转换成为真阴性的示意图，由此改善特异性。miR-107 (图104C)和miR-141 (图104D)的归一化水平在Y轴上针对所述囊泡诊断分析所得的真阳性(TP)、所述囊泡诊断分析所得的真阴性(TN)、所述囊泡诊断分析所得的假阳性(FP)和所述囊泡诊断分析所得的假阴性(FN)示出。
[0142]图105A-105F详细说明了在患有或未患PCa且PSA≤或〈4.0ng/ml的患者中的hsa-miR-432(图 105A)、hsa_miR-143(图 105B)、hsa_miR-424(图 105C)、hsa_miR-204(图105D)、hsa-miR-581f (图 105E)和 hsa-miR-451 (图 105F)升高的柱形图。使用 Taqman 分析检测分离的囊泡中的miR。Taqman分析所检测的miR水平在Y轴上显示。X轴示出了四个样品组。从左至右，“对照非”是PSA ^ 4.0的对照患者；“对照是”是PSA〈4.0的对照患者；“患病非”是PSA≤4.0的前列腺癌患者；以及“患病是”是PSA〈4.0的前列腺癌患者。
[0143]图106详细说明了在分离自前列腺癌(PCa)和对照的血浆样品的囊泡中的微RNAmiR-29a 和 miR-145 的水平。
[0144]图107详细说明了微珠分析的平板设计布置。
[0145]图108A-D详细说明了用于捕获区分结肠直肠癌(CRC)与正常样品的囊泡的各种不同捕获抗体的能力。图108A说明了 CRC囊泡样品相对正常样品的捕获抗体抗原(X轴)的倍数变化(Y轴)，其根据抗体阵列测定。图108B与之类似，不同之处在于根据图例所示，Y轴是CRC和正常样品中的中位荧光强度。图108C类似于图108B，其在另外的样品组上实施。图108D示出了使用CD24作为结肠标志物，TR0P2作为癌症标志物，并且四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81作为一般囊泡标志物进行的分析。[0146]图109A-H详细说明了通过使用TMEM211和/或⑶24检测囊泡从而在血浆样品中检测CRC。图109A详细说明了使用生物标志物TMEM211进行的本发明的囊泡分析的ROC曲线分析。图109B详细说明了使用生物标志物CD24进行的本发明的囊泡分析的ROC曲线分析。图109C详细说明了对于正常、患有结肠直肠癌(CRC)的受试者和混淆者的本发明囊泡分析方法的分析。图109D详细说明了在后续研究中使用生物标志物TMEM211针对正常、患有结肠直肠癌(CRC)的受试者和混淆者的囊泡样品分析。图109E详细说明了使用生物标志物TMEM211进行的本发明囊泡分析的ROC曲线分析。图109F-109H详细说明了来自具有扩大的患者组群进行的另外研究的结果。在图109F中，TMEM211的中位荧光强度(MFI)在X轴上示出，并且⑶24的MFI在Y轴上示出。TMEM211和⑶24单独地用于区分各种不同类样品的结果分别在图109G和图109H中示出。
[0147]图110详细说明了结肠直肠癌(CRC)细胞系对正常囊泡的TaqMan低密度阵列(TLDA)miRNA卡比较。CRC细胞系在图右侧标出。Y轴显示了 CRC细胞系与正常对照相比表达上的倍数变化。受监测的miRNA在X轴上标出，并且从左至右为miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a 和 miR_200b。对于各个 miR，从左至右的柱形对应于细胞系L0V0、HT29、SW260、C0L0205、HCTl 16和RK0。这些miRNA在正常或黑色素瘤细胞中未过表达。
[0148]图1llA详细说明了使用miR92和miR491对正常和CRC样品的区分。图1llB详细说明了使用miR92和miR21对正常和CRC样品的区分。图1llC详细说明了使用miR92、miR21、miR9和miR491的复用对正常和CRC样品的区分。
[0149]图112详细说明了结肠直肠癌(CRC)细胞系和患者样品中的KRAS测序。样品包含获自细胞系(B)或从来自所述患者的组织样品(D)获得的基因组DNA，或获自从所述细胞系(A)脱落的或来自所述患者(C)的血浆样品中囊泡中的RNA有效负载的cDNA。
[0150]图113详细说明了通过检测来自血浆样品的微囊泡中的TMEM211和MUCl而对CRC的辨别。X轴(MUCl)和 Y轴(TMEM211)对应于所述样品中被检测囊泡的中位荧光强度(MFI)。水平和垂直线分别是针对TMEM211和MUCl而检测CRC的MFI阈值。
[0151]图114A详细说明了描述在乳腺癌患者样品(n=10)或正常对照(即，无乳腺癌)中检测到的生物标志物的超出正常值的倍数变化。使用系留于珠上的所标示抗原的抗体捕获血浆样品中的囊泡。使用针对四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的标记抗体检测所捕获的囊泡。Y轴上的倍数变化是在所述乳腺癌样品中检测到的囊泡与正常样品相比较的中位荧光强度(MFI)的倍数变化。图114B详细说明了在源自乳腺癌细胞系MCF7、T47D和MDA的囊泡中检测到的各种不同生物标志物的水平。T47D和MDA是转移性细胞系。
[0152]图115A详细说明了来自肺癌样品的膜囊泡中的各种不同生物标志物与正常样品相比较的倍数变化，其使用针对所标出的囊泡抗原的抗体进行检测。黑色柱是肺癌样品与正常样品的比率。白色柱是非肺癌样品与正常样品的比率。下划线标出的数据在图115B中示出。图115B说明了使用针对所标示的囊泡抗原的抗体检测的膜囊泡荧光水平。荧光水平是来自以下样品的平均值:正常(白色)、非肺癌样品(灰色)以及分期肺癌样品(黑色)。图115C示出了使用EPHA2(i)、CD24(ii)、EGFR(iii)和CEA(iV)在来自肺癌患者和正常对照的样品中进行的囊泡检测的中位荧光强度(MFI)。图11?和图115E在Y轴上给出了在来自肺癌和正常(非肺癌)受试者的样品中检测到的囊泡的平均荧光强度(MFI)。捕获抗体沿X轴标出。图115F示出了由CENPH (纵轴)、PRO GRP (最左边的横轴)和MMP9 (最右边的横轴)组成的三生物标志物组的三维图。图上癌症用空心正方形指示，而正常用实心三角形指示。
[0153]图116给出了使用所标出的用于检测囊泡的捕获抗体以检测肺癌的决策树。
[0154]图117A详细说明了源自血浆的囊泡中相对于循环肿瘤细胞(CTC)的⑶81标记的囊泡水平比照肿瘤细胞(CTC)。以受到计数的⑶81和CTC测量了对于收集自患者(14例最左侧的“CTC”样品)和正常血浆(4例最右侧样品)的囊泡，对以⑶81和CTC测量的囊泡进行计数。图117B详细说明了源自EpCAM+血浆的囊泡中相对于CTC的miR-21拷贝数。示出了患者样品(15例最左侧的“CTC”样品)和正常样品(7例最右侧的“正常”样品)。通过来自RNA的miR-21qRT-PCR评估拷贝数，所述RNA提取自源于EpCAM+血浆的囊泡。CTC计数获自相同样品。
[0155]图118A-118C详细说明了来自乳腺癌患者的血浆中的囊泡水平，其在从所述样品耗尽CD31+阳性囊泡后使用针对⑶31 (图118A)、DLL4(118B)和CD9 (图118C)的抗体进行检测。
[0156]图119详细说明了对在来自正常(非癌症)血浆样品、乳腺癌(BCa)血浆样品和前列腺癌(PCa)血浆样品的囊泡内的组织因子(TF)的检测。使用系留于微球上的抗组织因子抗体捕获血浆样品中的囊泡。使用针对四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的标记抗体检测所捕获的囊泡。
[0157]图120示出了用FITC偶联的、针对所示囊泡抗原的抗体所标记的囊泡的流式分选。(A)来自结肠直肠癌(CRC)患者和无CRC的正常者的⑶9/⑶63FITC标记的囊泡针对CD31和DLL4水平进行门控(gated)。(B)来自正常者和CRC患者的CD9/CD63FITC标记的囊泡针对TMEM211和DLL4水平进行门控。(C)来自正常者和乳腺癌患者的⑶9FITC标记的囊泡针对⑶31和DLL4水平进行门控`。
[0158]图121详细说明了描述正常个体和患有各种癌症的个体的血浆中DLL4捕获的循环微囊泡(cMV)水平的图。血浆样品中的囊泡用系留于微珠上的抗DLL4抗体捕获。捕获的囊泡用针对四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的标记的抗体检测。囊泡的中位荧光强度(MFI)示于Y轴上。样品组在X轴上示出，从左到右包括:正常对照(“正常”；即，非癌症)、乳腺癌(“乳腺”)、非癌(“肺”)、前列腺癌(“前列腺”)、结肠直肠癌(“结肠直肠”)、肾癌(“肾”)、卵巢癌(“卵巢”)和胰腺癌(“胰腺”)。
[0159]图122A-C详细说明了微RNA miR-497在患者血液样品中区分肺癌和正常(非肺癌)样品的能力。Y轴示出了在0.1ml样品中miR-497的拷贝数。在图122A中，水平线代表1154份拷贝的拷贝数。在图122B中，水平线代表1356的拷贝数。图122C是通过检测循环微囊泡(cMV)中的miR-497水平用于区分非小细胞肺癌和正常血浆样品的受试者工作特征(ROC)曲线。数据对应于图122B。
[0160]图123A和123B详细说明了在一组癌症和非癌症样品中⑶9阳性(⑶9+)囊泡的检测。Y轴示出了用抗⑶9抗体捕获的且用针对⑶9、⑶63和⑶81的标记抗体检测的囊泡的平均荧光强度(MFI)。图123A示出了所有癌症作为一组与非癌症(正常)的比较。图123B不出了单独的癌症与非癌症的比较。
[0161]图124A-124E详细说明了使用囊泡表面标志物检测区分乳腺癌。图中示出了通过用所示标志物检测囊泡获得的中位荧光值(MFI)。垂直和水平线代表用以针对每种标志物分离样品组(例如分离癌症与非癌症)的MFI截止值。图124A详细说明了利用第一组截止值使用Gal3和BCA200在癌症和非癌症患者之间区分乳腺癌。图124B详细说明了利用第二组截止值使用Gal3和BCA200在癌症和非癌症患者之间区分乳腺癌。图124C详细说明了使用额外的混淆者样品，利用Gal3和BCA200对乳腺癌的检测。图124D详细说明了使用OPN和NCAM在癌症和混淆患者之间区分乳腺癌。图124E详细说明了用于区分乳腺癌的两步程序。首先，如最左边的图所不，利用Gal3和BCA200区分样品。然后如最右边的图所示，用OPN和NCAM评估在被标记为“阳性”的象限中的样品，以分离假阳性混淆患者。
[0162]图125A-125C示出了在乳腺癌和健康患者中cMV的FACS筛选的图。用于cMV染色的标志物在图中示出。图125A示出了使用免疫抑制标志物⑶45 (y轴)和CTL4A (x轴)的染色。图125B示出了使用转移标志物MMP-7(y轴)和TMP-Ux轴)的染色。图125C示出了使用血管生成标志物⑶31 (y轴)和VEGFR2 (x轴)的染色。
[0163]图126A-126B详细说明了使用DNA微阵列表达数据对乳腺癌和其它癌症的分类。样品1-30为乳腺癌样品。样品31-60为非乳腺来源的癌症。在图126A中，利用广义LASSO回归将样品分类。用于建立分类器模型的三种基因转录物包括DST.3、GATA3和KRT81。在图126B中，使用贝叶斯集成(Bayesian Ensemble)法将样品分类。用于建立该模型的十五种基因转录物包括 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPU DST.3、ELF5、GATA3、KRT81、LALBA, 0XTR、RASL10A、SERHL, TFAP2A.1、TFAP2A.3、TFAP2C 和 VTCNl。
发明详述
[0164]本文公开了用于表征生物样品(如，来自细胞培养物、生物体或受试者的样品)的表型的方法和系统。可通过评估一种或多种生物标志物表征所述表型。所述生物标志物可与囊泡或囊泡群体关联，其为存在的囊泡表面抗原或囊泡有效负载。如本文所使用的，囊泡有效负载包含封装于囊泡内的实体。囊泡相关的生物标志物可包含膜结合的和可溶的生物标志物。所述生物标志物还可以是循环生物标志物，诸如在体液中评估的微RNA或蛋白质。除非另行说明，本文中提及囊泡或生物标志物组分而使用的术语“纯化的”或“分离的”指的是这些组分从细胞或生物体中部分的或完全的纯化和分离。此外，除非另行说明，所称的使用结合剂进行的囊泡分离包括将囊泡与所述结合剂结合，无论该结合是否使得所述囊泡与起始材料中的其它生物实体的完全分离。
[0165]通过分析循环生物标志物(如核酸生物标志物)而表征表型的方法描述于图61A的方案6100A中，其为非限制性说明实例。在第一步骤6101中获得生物样品，如体液、组织样品或细胞培养物。从所述样品中分离核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。对这些核酸的评估可提供该表型的生物印记。通过对与目标表型(如疾病对比健康、治疗前和治疗后)相关的核酸取样，可测定作为表型的指示的一种或多种核酸标志物。本发明的各个方面涉及通过评估在所述样品中存在的一种或多种核酸分子(如微RNA)而确定生物印记6105，其中所述生物印记对应于预定的表型6107。图61B详细说明了使用囊泡分离所述核酸分子的方案6100B。在一个实施例中，获得了生物样品6102，并且从所述样品中分离一种或多种囊泡6104，如来自特定细胞源的囊泡和/或与特定疾病状态相关的囊泡。通过表征与所述囊泡关联的表面抗原和/或测定所述囊泡中存在的组分(“有效负载”)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行说明，本文所使用的术语“抗原”通常指的是可被结合剂(又称结合试剂)结合的生物标志物，无论所述结合剂是抗体、适体、凝集素或用于所述生物标志物的其它结合剂，并且无论这些生物标志物是否在宿主中引发免疫应答。囊泡有效负载可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效负载包括信使RNA(mRNA)和微RNA(本文中亦称为miRNA或miR)。根据所述囊泡的生物印记表征表型6108。在本发明的另一个说明性方法中，方案6100A和6100B —起实施以表征表型。在这样的方案中，评估了囊泡和核酸(如微RNA)，从而表征所述表型。
[0166]在一个相关的方面，本文提供了用于发现生物标志物的方法，其包括评估一个样品中的囊泡表面标志物或有效负载标志物以及将所述标志物与另一样品进行比较。在所述样品之间区分的标志物可用作本发明的生物标志物。这些样品可以来自受试者或受试者组。例如，所述组可以是，例如，对于给定疾病或失调的给定治疗的已知响应者和非响应者。发现区分所述已知响应者和非响应者的生物标志物提供了关于受试者是否可能对治疗(诸如治疗剂，如药物或生物制品)有反应的生物印记。
表型
[0167]本文公开了通过分析囊泡(诸如膜囊泡)来表征个体的表型的产品和方法。表型可以为受试者的任何可观察的特征或性状，例如疾病或状况、疾病阶段或状况阶段、疾病或状况的易感性、疾病阶段或状况的预后、生理状态或对治疗的反应。表型可以由受试者的基因表达及环境因素的影响以及这二者之间的相互作用引起，以及由对核酸序列的外遗传修饰引起。
[0168]受试者中的表型可以通过从受试者获得生物样品并分析所述样品中的一种或多种囊泡来表征。例如，表征受试者或个体的表型可以包括检测疾病或状况(包括症状前的早期阶段检测)，确定疾病或状况的预后、诊断或治疗诊断，或者确定疾病或状况的阶段或进程。表征表型还可以包括鉴定针对特定疾病、状况、疾病阶段或状况阶段的适当治疗或治疗效力、疾病进展的预测和可能性分析，特别是疾病复发、转移扩散或疾病恶化。表型还可以为状况或疾病(例如癌症或肿 瘤)的临床上独特的类型或亚型。表型的确定还可以为生理状况的确定、器官危境或器官排斥(例如移植后)的评估。本文所述的产品和方法可以在个体的基础上评估受试者，其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
[0169]在一个方面，本发明涉及囊泡分析以提供预测受试者是否可能对疾病或失调的治疗有反应的生物印记。表征表型包括预测所述受试者的响应者/非响应者状态，其中响应者对疾病的治疗有反应而非响应者对所述治疗无反应。可在所述受试者中分析囊泡并与已知对治疗有反应或没有反应的先前受试者的囊泡分析进行比较。如果所述受试者中的囊泡生物印记与已知对所述治疗有反应的先前受试者更为接近，则所述受试者可表征或预测为所述治疗的响应者。类似地，如果所述受试者中的囊泡生物印记与已知对所述治疗无反应的此前受试者更为接近，则所述受试者可表征或预测为所述治疗的非响应者。所述治疗可以针对任意适当的疾病、失调或其它状况。在与响应者/非响应者状态相关的囊泡生物印记已知的情况下，所述方法可用于任意疾病情况中。
[0170]本发明所使用的术语“表型”可以指贡献于囊泡生物印记的任何性状或特征，该生物印记使用本发明的方法而鉴定。例如，表型可以是受试者可能对治疗有反应的标识，或更广义地其可为治疗诊断基于针对获自受试者的样品鉴定的生物印记的诊断、预后或治疗诊断确定。[0171]本文所使用的术语“检测(detect)”(包括其变化，例如，“检测(detecting)”)可意指确定候选生物标志物(例如，核酸、多肽或其功能性片段)在一个生物样品或一系列生物样品中的存在或水平。在实施方案中，从受试者中获得一个样品或多个样品以便检测状况或疾病或检测状况或疾病的可能性。关于生物标志物的术语“功能性片段”可意指生物标志物的伸展或片段，它是可鉴定的，且可小于整个或完整的序列，但是足以检测生物标志物是否存在和/或生物标志物存在的水平。例如，功能性片段可为可鉴定的多肽片段或核酸分子序列。
[0172]在一些实施方案中，所述的表型包括疾病或状况如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括肿瘤、赘生物或癌症的存在或发生肿瘤、赘生物或癌症的可能性。通过本文所述的产品或方法检测或评估的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌、高度异型增生(high grade dysplasia)、低度异型增生(low gradedysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(例如成胶质细胞瘤)、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。所述的结肠直肠癌可以为CRC Dukes B或CRC Dukes C-D0所述的血液恶性肿瘤可以为B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤-DLBCUB细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样以及伯基特氏淋巴瘤。
[0173]所述表型可以是恶变前状况，诸如光化性角化病、萎缩性胃炎、白斑病、增殖性红斑、淋巴瘤样肉芽肿病、白血病前期、纤维症、宫颈非典型增生、子宫颈非典型增生、着色性干皮病、巴雷特食管、结肠直肠息肉或有可能发展成为恶性肿瘤的其它异常组织生长或病灶。诸如HIV和HPV的转化型病毒感染也提供了可根据本发明进行评估的表型。
[0174]通过本发明的方法表征的癌症可包括但不限于，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖细胞瘤、胚细胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限于，上皮赘生物、鳞状细胞赘生物鳞状细胞癌、基底细胞赘生物基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺体)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰岛瘤(linitis plastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊性腺样癌、阑尾类癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒细胞瘤、许特莱氏细胞腺瘤(hurthle cell a denoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤(grawitz tumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件赘生物、粘液表皮样赘生物、囊性、粘液性和浆液性赘生物、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质赘生物、腺泡细胞赘生物、复合上皮赘生物、沃辛肿瘤(warthin’ s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺赘生物、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒膜细胞瘤、卵巢含睾丸母细胞瘤、支持细胞睾丸间质细胞瘤、血管球瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣与黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端着色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限于，Askin肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤,其包括:腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于，慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴衆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)(诸如胃aldenstrdm巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、衆细胞骨髓瘤、衆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤⑶30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定、间变性大细胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽)以及结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括但不限于，生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺细胞瘤。胚细胞瘤包括但不限于，肾母细胞瘤、成神经管细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其它癌症包括但不限于，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(延髓和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、脑肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、卢页咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文氏肉瘤和浆细胞瘤。
[0175]在进一步的实施方案中，进行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞混合癌以及复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
[0176]在实施方案中，所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明癌；类癌瘤；原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；颉外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性赘生物；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌?’胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；Waldenstr6m臣球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的方法可用于表征这些及其它癌症。因此，对表型的表征可提供本文公开的癌症之一的诊断、预后和治疗诊断。
[0177]所述的表型还可以为炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以为炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(⑶)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
[0178]所述的表型还可以包括心血管疾病，例如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、中风或局部缺血。所述的心血管疾病或状况可以为高血压、狭窄症、血管阻塞或血栓形成事件。
[0179]所述的表型还可以包括神经疾病，例如多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管 疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。所述的表型还可以为诸如纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛的状况。
[0180]所述的表型还可以包括感染性疾病，例如细菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或状况可以为惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒。可以评估囊泡中的病毒蛋白质(例如HIV或HCV样颗粒)从而表征病毒状况。
[0181]所述的表型还可以包括围产期或妊娠相关的状况(例如先兆性子痫或早产)、代谢疾病或状况(例如与铁代谢有关的代谢疾病或状况)。例如，可以测定在囊泡中的铁调素(hepcidin)从而表征铁缺乏。所述的代谢疾病或状况还可以为糖尿病、炎症或围产期状况。
[0182]本发明的方法可用于表征这些疾病或失调以及可通过生物标志物评估的其它疾病或失调。因此，对表型的表征可提供对本文公开的疾病或失调之一的诊断、预后和治疗诊断。
受试者[0183]可通过分析从受试者获得的生物样品中的一种或多种囊泡(如多种囊泡)来确定受试者的一种或多种表型。受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物，例如牛、鸟、犬、马、猫、绵羊、猪或灵长动物(包括人及非人灵长动物)。受试者还可以包括:由于濒危而变得重要的哺乳动物，例如西伯利亚虎；或者具有经济意义的动物(例如用于人消费的农场饲养动物)，或对人类而言具有社会意义的动物(例如作为宠物或在动物园中饲养的动物)。此类动物的实例包括但不限于:食肉动物，例如猫和狗；猪，包括畜养猪、食用猪和野猪；反刍动物或有蹄类动物，例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。此外，还包括濒危的或在动物园中饲养的鸟；以及禽类，更特别的是家养的禽类，即，家禽，例如火鸡和鸡、鸭、鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马(包括赛马)。此外，与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内，例如与农业、水产业和其它活动有关的动物，所述行业中为了经济生产率和/或食物链的安全，疾病监测、诊断和疗法的选择是常规措施。
[0184]所述的受试者可以患有此前存在的疾病或状况，例如癌症。或者，所述的受试者可以并未患任何已知的此前存在的状况。所述的受试者还可以对现有或过去的治疗是非反应性的，例如对癌症的治疗是非反应性的。
样品
[0185]得自所述受试者的生物样品可以为任何体液。例如，所述的生物样品可以为外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐带血或母体循环血(其可以为胎儿来源或母体来源的)。所述的生物样品还可以为组织样品或活体组织，从中可获得囊泡和其它循环生物标志物。例如，可以培养得自样品的细胞，并且从所述培养物中分离囊泡(例如参见实施例1)。在各个实施方案中，可由这些生物样品直接评估本发明公开的生物标志物或更特别地生物印记(如，对核酸或多肽生物标志物或其功能性片段的存在或水平的鉴定)，其使用各种方法，诸如，从血液、血浆、血清或任意前述生物样品中提取核酸分子，使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能性片段)生物标志物，以及本领域中已知用于鉴定与评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组技术。
[0186]表1列出了疾病、状况或生物学状态的说明性实例，以及可以对其中的囊泡进行分析的生物样品的相应列表。
表1:用于分析与各种疾病、状况或生物学状态相关的循环生物标志物的生物样品的
实例
【权利要求】
1.一种检测生物样品中的一种或多种生物标志物的方法，其包括: (a)使生物样品与设计用于确定所述一种或多种生物标志物的存在或水平的试剂接触，其中所述一种或多种生物标志物选自图1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合；及 (b)鉴定所述生物样品中的所述一种或多种生物标志物，从而检测所述生物样品中的所述一种或多种生物标志物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包括生物流体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述生物流体包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、经血、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述生物流体包含血液或血液衍生物。
5.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述生物样品包含细胞外微囊泡群体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述微囊泡群体包含具有IOnm至1000nm的直径的微囊泡。
7.如权利要求5所述 的方法，其中所述微囊泡群体包含具有20nm至200nm的直径的微囊泡。
8.如权利要求5所述的方法，其中在所述鉴定步骤之前将所述微囊泡群体从所述生物样品中分离出来。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述分离包括大小排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和选择、亲和纯化、亲和捕获、免疫测定、免疫沉淀、微流体分离、流式细胞术或其组合。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述亲和选择包括使所述微囊泡群体与一种或多种结合剂接触。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种结合剂包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗体、抗体片段、适体、类肽、zDNA、肽核酸(PM)、锁定核酸(LNA)、凝集素、肽、树状聚体、膜蛋白标记剂、化学化合物或其组合。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种结合剂用于捕获和/或检测所述微囊泡群体。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种结合剂特异性地结合选自四跨膜蛋白、CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、膜联蛋白 V、MFG_E8、图 1-60 或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合的微囊泡表面标志物。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种结合剂结合至基底。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述基底包括孔、微珠和/或阵列。
16.如权利要求12所述的方法，其中一种或多种结合剂具有标记。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述标记选自磁标记、荧光标记、酶标记、放射性同位素、量子点或其组合。
18.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含多肽或其功能性片段。
19.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含微囊泡表面抗原或其功能性片段。
20.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含核酸或其功能性片段。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述核酸包含mRNA。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述核酸包含微RNA。
23.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含多肽和核酸分子，或其功能性片段。
24.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含 CD9。
25.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自Gal3、BCA200及其组合。
26.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自OPN、NCAM及其组合。
27. 如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自 Gal3、BCA200、OPN, NCAM 及其组合。
28.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自Gal3和/或BCA200、OPN和/或NCAM及其组合。
29.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自四跨膜蛋白、CD45、FasL, CTLA4、CD31、DLL4、VEGFR2、HIF2a、Tie2、Angl、Mucl、CD147、TMP1、TMP2、MMP7、MMP9 及其组合。
30.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自 CD83 和 FasL, CTLA4 和 CD80、CD 147 和 TIMPU TIMP2 和 MMP9、HIF2a 和 AngU VEGFR2 和Tie2、CD45 和 CTL4A、DLL4 和 CD31 及其组合。
31.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自 5T4 (滋养层)、ADAMlO, AGER/RAGE、APC、APP ( P -淀粉样蛋白)、ASPH (A-10)、B7H3(CD276)、BACEl、BAI3, BRCAl、BDNF、BIRC2、C1GALT1、CA125(MUC16)、钙调蛋白 1、CCL2 (MCP-1)、CD9、CD 10、CD 127 (IL7R)、CD 174、CD24、CD44、CD63、CD81、CEA、CRMP-2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYFRA21、derlinl、DLL4、DPP6、E-CAD, EpCaM、EphA2 (H-77)、ER⑴ ESRl a、ER(2)ESR2 3、Erb B4、Erbb2、erb3 (Erb_B3) PA2G4、FRT (FLTl)、Gal3、GPR30 (G 偶联 ERl)、HAPU HER3、HSP-27、HSP70、IC3b、IL8、insig、连接斑珠蛋白、角蛋白 15、KRAS、乳腺珠蛋白、MART1、MCT2、MFGE8、MMP9、MRP8、Mucl、MUC17、MUC2、NCAM、NG2 (CSPG4)、Ngal、NHE-3、NT5E(CD73)、ODCl、OPG, OPN、p53、PARK7、PCSA, PGP9.5 (PARK5)、PR ⑶、PSA、PSMA, RAGE、STXBP4、存活蛋白、TFF3(分泌的)、TMP1、TMP2、TMEM211、TRAF4 (支架)、TRAIL-R2 (死亡受体 5)、TrkB、Tsgl01、UNC93a、VEGF A、VEGFR2、YB-1、VEGFR1、GCDPF-15 (PIP)、BigH3(TGFbl诱导的蛋白质)、5HT2B (5-羟色胺受体2B)、BRCA2、BACE1、⑶Hl-钙黏着蛋白及其组合。
32.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPl 及其组合。
33.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自 DST.3、GATA3、KRT81 及其组合。
34.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPl、DST.3、ELF5、GATA3、KRT81、LALBA, OXTR、RASL10A、SERHL,TFAP2A.1、TFAP2A.3、TFAP2C、VTCNl 及其组合。
35.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表89中的生物标志物及其组合。
36.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表90中的生物标志物及其组合。
37.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表91中的生物标志物及其组合。
38.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自MS4A1、PRB、DR3及其组合。
39.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自PRB、MACCl及其组合。
40.如权利要求18-21或23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物选自表92中的生物标志物及其组合。
41.如权利要求20或22-`23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含选自 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-650、hsa-miR-194、hsa-miR-1200、hsa—miR-326、hsa_miR-30b*、hsa_miR-19a、hsa_miR-7a*、hsa—miR-708*、hsa_miR-99a、hsa-miR-199b_5p、 hsa-miR-543、 hsa_miR-7i*、 hsa_miR-518c*、 hsa-miR-642、hsa-miR-654_3p、 hsa-miR-518d_5p、 hsa-miR-1266、 hsa-miR-154、 hsa-miR-662、hsa-miR-523、 hsa-miR-198、 hsa-miR-920、 hsa-miR-885_3p、 hsa_miR-99a*、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-363 及其组合的一种或多种微 RNA。
42.如权利要求20或22-23中任一项所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物包含 miR-497 微 RNA。
43.如权利要求19所述的方法，其中所述微囊泡群体用针对所述一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂捕获并用针对选自下组的生物标志物的结合剂进行检测:四跨膜蛋白、CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、膜联蛋白 V、MFG_E8、图 1-60 或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合。
44.如权利要求5所述的方法，进一步包括检测所述微囊泡群体内的有效负载的水平。
45.如权利要44所述的方法，其中所述检测的有效负载包含一种或多种核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
46.如权利要求44所述的方法，其中所述检测的有效负载包含选自权利要求24-42中任一项中的生物标志物及其组合的一种或多种生物标志物。
47.如权利要求44所述的方法，其中所述检测的有效负载包含选自图1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合的一种或多种生物标志物。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述核酸包含一种或多种DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
49.如权利要求45所述的方法，其中所述核酸包含选自表5-9、30-44、58-59、71和73任一个中的微RNA的一种或多种微RNA。
50.如权利要求45所述的方法，其中所述蛋白质包含选自图1-60或表3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合的一种或多种肽、多肽、蛋白质或其片段。
51.如权利要求45所述的方法，其中所述核酸包含选自图1-60或表3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合的一种或多种mRNA。
52.如任一前述权利要求所述的方法，进一步包括针对至少一种另外的生物标志物分析所述生物样品，该生物标志物选自四跨膜蛋白、⑶9、⑶31、⑶63、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53、Rab-5b、膜联蛋白 V、MFG-E8、图 1-60 或表 3-10、12-17、19_20、22、26、28-50、52、54_64、66、67、69-71、73-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合。
53.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述生物样品包含已知的或疑似的癌症样品。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述生物样品包含癌细胞培养物或来自患有或疑似患有所述癌症的受试者的样品。
55.如权利要求53所述的方法，进一步包括将所检测的微囊泡群体的存在或水平与参照进行比较，其中相对于所述参照改变的存在或水平为所述癌症提供了诊断、预后或治疗诊断决定。
56.如权利要求54所述的方法，其中针对所述癌症的诊断、预后或治疗诊断决定包括癌症或癌症可能性的诊断，癌症的预后，癌症的治疗诊断，确定所述癌症是否对治疗处理正作出反应，或确定所述癌症是否有可能对治疗处理有反应。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述治疗处理选自表10、11-13或69。
58.如权利要求55所述的方法，其中所述参照来自没有所述癌症的生物样品。
59.如权利要求58所述的方法，其中与所述参照相比所述样品中一种或多种生物标志物水平的提高指示所述样品中癌症的存在或可能性，或所述样品中更晚期癌症的存在或可能性。
60.如权利要求55所述的方法，其中所述参照来自在一个或多个不同时间点测定的一系列生物样品。
61.如权利要求53所述的方法，其中所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病；急性骨髓性白血病；肾上腺皮质癌；AIDS相关癌症；AIDS相关淋巴瘤；肛门癌；阑尾癌；星形细胞瘤；非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；基底细胞癌；膀胱癌；脑干胶质瘤；脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤)；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特氏淋巴瘤；原发部位不明癌；类癌瘤；原发部位不明肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎性肿瘤；宫颈癌；儿童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊乱；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；内分泌胰岛细胞瘤；子宫内膜癌；成室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感觉神经细胞瘤；尤文氏肉瘤；颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆管癌；胆囊癌；胃的(胃)癌；胃肠道类癌肿瘤；胃肠道间质细胞瘤；胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞肿瘤；神经胶质瘤；毛细胞白血病；头颈癌；心脏癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼内黑色素瘤；胰岛细胞瘤；卡波济氏肉瘤；肾癌；朗格汉斯细胞组织细胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；肺癌；恶性纤维组织细胞瘤骨癌；髓母细胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel细胞癌；Merkel细胞皮肤癌；间皮瘤；隐匿原发性的转移性鳞状颈癌；口腔癌；多发性内分泌肿瘤综合征；多发性骨髓瘤；多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物；蕈样肉芽肿；骨髓发育异常综合征；骨髓增生性赘生物；鼻腔癌；鼻咽癌；神经母细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮肤癌；非小细胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它脑和脊髓肿瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜在肿瘤；胰腺癌；乳头状瘤病；副鼻窦癌；甲状旁腺癌；盆腔癌；阴茎癌；咽癌；中度分化的松果体实质肿瘤；成松果体细胞瘤；垂体瘤；浆细胞赘生物/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性肝细胞肝癌；前列腺癌；直肠癌；肾癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌；呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary综合征；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌；鳞状颈癌?’胃(胃的)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤；睾丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲状腺癌；移行细胞癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养细胞肿瘤；输尿管癌；尿道癌；子宫癌；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。
62.如从属于权利要求24-37中任意一项的权利要求53所述的方法,其中所述癌症包括乳腺癌。
63.如从属于权利要求36-37中任意一项的权利要求53所述的方法,其中所述癌症包括原位导管癌(DCIS)。
64.如从属于权利要求 24和38-42中任意一项的权利要求53所述的方法，其中所述癌症包括肺癌。
65.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述方法在体外进行。
66.—种或多种试剂在实施任一前述权利要求的方法中的用途。
67.—种试验,其包括: (a)从生物样品中分离细胞外微囊泡，其中所述微囊泡包含一种或多种RNA分子，其中所述一种或多种 RNA 分子是与图 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92任一个中的生物标志物相对应的诊断指示物； (b)测定所述微囊泡中的一种或多种RNA分子的量；和 (c)将所述测定的一种或多种RNA分子的量与一种或多种对照水平进行比较，其中如果所述细胞外微囊泡中的所述一种或多种RNA分子的量与所述一种或多种对照水平相比存在差异，则检测出癌症。
68.如权利要求67所述的试验，其中所述分离包括大小排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和选择、亲和纯化、亲和捕获、免疫测定、免疫沉淀、微流体分离、流式细胞术或其组合。
69.如权利要求68所述的试验，其中所述亲和选择包括使所述微囊泡群体与一种或多种结合剂接触，该结合剂特异性结合选自图1-60或表3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合的微囊泡表面标志物。
70.一种试剂盒，其包含一种或多种用于实施权利要求1-65中任一项的方法的试剂。
71.如权利要求70所述的试剂盒或如权利要求66所述的用途，其中所述一种或多种试剂包含针对所述一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂。
72.如权利要求70所述的试剂盒或如权利要求66所述的用途，其中所述一种或多种试剂包含针对一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂，该生物标志物选自图1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一个中的生物标志物及其组合。
73.如权利要求71或72所述的试剂盒或用途，其中所述一种或多种结合剂包含抗体或适体。
74.如权利要求71或72所述的试剂盒或用途，其中所述一种或多种结合剂系留于基底上。
75.如权利要求71或72所述的试剂盒或用途，其中所述一种或多种结合剂是标记的。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述标记包含磁标记、荧光标记、酶标记、放射性同位素或量子点。
77.一种分离的囊泡 ，其包含选自权利要求24-42任一项中所列的生物标志物及其组合的一种或多种生物标志物。
78.如权利要求77所述的分离的囊泡，其中所述囊泡包含一种或多种另外的生物标志物，该另外的生物标志物选自图 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、，67、69-71、73-85、89-92任一个中的生物标志物及其组合。
【文档编号】C12Q1/68GK103492590SQ201280019718
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月17日 优先权日:2011年2月22日
【发明者】大卫·斯佩兹勒, 丹尼尔·A·霍尔特曼, 特蕾西·波洛斯基, 安德里亚·塔斯纳托 申请人:卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司