专利名称：Y型探针及其变形型及利用该y型探针的dna微陈列、试剂盒以及基因分析方法
技术领域：
本发明涉及在基因型检测及分析时，可通过改善灵敏度、特异度及准确度来广泛用于诊断的，在ー个本体内具有两 个探针部位的Y型核苷酸探针(probe)及其变形型(d型或者b型探针)，以及利用该Y型核苷酸探针的DNA微陈列、试剂盒以及基因分析方法。
背景技术：
DNA微陈列或者DNA芯片是在载玻片等固相载体(solid support)上，以点(spot)方式，点样了数十个至数亿个基因探针的。在DNA微陈列上，放置从组织或者细胞、体液等检体中提取之后，用荧光物质(fluorescent dye)等来标记的DNA、RNA、cDNA、cRNA、微小RNA、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction; PCR)产物等核酸,并执行杂交反应或者测序(sequencing)反应,可通过突光扫描机等设备来分析在其反应中出现的标记物质的信号。据此，通过一次实验可勘察大单位基因的表达变化或者基因型(genotype)。DNA微陈列是迄今在基因相关研究或者临床诊疗当中不可缺少的工具，该DNA微陈列利用于基因的功能和基因组研究等基础科学研究，而且掌握基因疾病的机制，并树立诊断指针，查明特定药物的作用机制和副作用，并可广泛利用于设定疾病的治疗决策等临床诊疗(PetrikJ.Diagnostic applications of microarrays.Transfusion Medicine.2006;16:233—247;Wheelan SJ，Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinking world of DNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):726-732;Li X，Quigg RJ，Zhou J，Gu W,Nagesh RaoP, Reed EF.Clinical utility of microarrays:current status, existing challengesand future outlook.Current Genomics.2008;9 (7):466_74)。DNA微陈列根据置于其上或者点样(spotting)在其上的探针的种类，划分为寡核苷酸微陈列和置有cDNA或PCR产物的其他微陈列等两种DNA微陈列。作为迄今实现商业化的微陈列，大部分主要使用寡核苷酸微陈列。寡核苷酸微陈列根据其制备方法大体上可划分为两种。一个是在固相载体上直接合成寡核苷酸的，可举例光版印刷(photolithograpy)方式的昂飞(Affymetrix)公司的芯片、喷墨方式的安捷伦(Agilent)公司的芯片、电子合成方式的科恩比矩阵(Combimatrix)公司的芯片、光化学合成方式的罗氏(Nimblegen)公司的芯片等。另ー个是在固相载体上点样(spotting)或者印上另行预先制备的寡核苷酸探针的方法。目前处于后者更为广泛利用的趋势，作为代表性的例子可举例应用生物系统(Applied Biosystem Inc, ABI)公司的产品、柯德尔墨水(Codel ink)公司的产品以及光照派(Illumina)公司的产品等。这些微陈列产品上点样了长度为18个至75个碱基(bp)的单链的直线型(liner, single strand)寡核苷酸探针，点的数量多样,最少为12000个,最多为 10亿 7200 万个(Wheelan SJ, Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinkingworld of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008 ；4 (7):726_732)。DNA微陈列执行以往常 规的基因检测进行过的三种工作，但是，该DNA微陈列与以往的基因检测法的不同点在于:能够以所谓高吞吐量(high-throughput)或大单位一下子检测多个基因，由此大大减少时间和费用，还可应用于临床诊断。利用DNA微陈列的第一检测法是寻出特定碱基序列的基因是否存在于检体内的定性分析(qualitative analysis)。例如是将成为疾病的病原菌的固有基因的碱基序列用作探针来制备微陈列，在其上放置检体的核酸进行杂交反应，由此寻出靶基因来诊断病原菌的方法。利用这种所谓基因型分析(genotyping)，可准确掌握作为宫颈癌病原菌的人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)或作为流感病原菌的流行性感冒病毒(influenza virus)、性感染病原菌的种类以及菌株或亚种(strain)。而且，由于掌握是否存在各个癌症固有的基因，还可诊断特定癌症。还可预测要检测的细菌或癌症的恶性度或预后是否产生药物反应及副作用。这还可以用低密度(low density)微陈列来实现,具有制备容易，费用低廉，有用于临床诊断的优点，是在商业化最容易实现的形态的DNA芯片(I^SM, Choi TH, Lee SY,Yoo NC.Applications of DNA microarray in disease diagnostics.T Microbiol Biotechnol.2009:19 (7):635-46)。利用DNA微陈列的第二检测法是，用于确认特定碱基序列的基因在检体内存在多少的定量分析(quantitative analysis)。这将是首次登场的cDNA微陈列表现的检测法(Shena M, Shalon D, Davis Rff,Broiwn P0.Quantitative monitoring of gene expressionpattern with a amplementary DNA microarray.Science.1995; 270:467-470)。在微陈列内点样要勘察的基因的多个探针，并用分别不同的荧光染料(fluorescent dye)标记靶物质或靶疾病的对照物质或者对照组的RNA或cDNA、cRNA之后，置于微陈列上进行杂交反应，由此掌握基因表达时，两组之间究竟出现何种差异的方法。利用DNA微陈列的第三检测法是，用于确认基因的碱基序列的变化，具体是检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)、点突变(point mutation)或者缺失(deletion)的方法,进而,还可以确认特定基因的复制数(copy number)。通常,针对要分析的碱基分别采用单碱基的寡核苷酸探针分为野生型(wild type)和突变型(mutantor variant type) 2种,或者分为A、C、G、T等4个种类,然后在微陈列上点样，由此制备DNA芯片。随后，利用ー种方法:在其上放置检体DNA或cDNA，或者放置PCR产物，并在非常严格的条件(highly stringent condition)下执行杂交反应,来寻 出完全一致的探针。即，在微陈列上利用等位基因特异性寡核苷酸杂交法(allele specific oligonucleotidehybridization, ASH)或杂交测序(sequencing by hybridization, SBH)方法。好几家企业正在销售以等位基因特异性寡核苷酸杂交方式检测人体的整体SNP或者重要SNP的微陈列。例如，就昂飞(Affymetrix)公司的SNP芯片而言，将对于ー个SNP采用20个至28个多种完全一致型(perfect match type)及不一致型(mismatch type)的寡核苷酸探针利用于微陈列(Rabbee N and Speed TP.Agenotype calling algorithm for AffymetrixSNP arrays.Bioinformatics2006;22:7-12;Liu WM, X.Yang XD G, Matsuzaki H,HuangJ, Mei R, Ryder TB, Webster TA, Dong S`, Liu G, K.ff.Jones Kff, G.C.Kennedy GC and Kulp
D.Algorithms for large-scale genotyping microarrays, Bioinformatics.2003;19:2397-2403)。但是，利用DNA微陈列要对多个靶的单碱基的差异进行准确的识别，实际上存在很多困难。对此，最近针对DNA微陈列，強大的竞争产品也上市了。例如，作为连读嵌入式数据库引擎(giga base)的碱基的所谓高吞吐量(high-throughput)碱基序列分析设备的宜曼达(Illumania)公司的Solexa和Helicos、罗氏(Roche)公司的454设备、应用生物系统(Applied Biosystems)公司的SOLiD。实际上这些产品与DNA微陈列相比时，在碱基序列分析的量上超过了 DNA微陈列，而且，在十几天内可解读人体基因组的整体碱基序列(Wheelan SJj Murillo FM and B oeke JD.The incredible shrinking world ofDNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4 (7):726_732)。微陈列于1995年 由希娜(Sherma)首次发表之后，虽然其历史长久，但临床上实际利用的产品只在少数。对于美国来说，作为药物基因组学(pharmacogenetics)检测产品的AmpliChip CYP450、作为乳房癌诊断芯片的MammaPrint、用于检测p53突变的AmpliChipP53检测、用于勘察癌症的根源的PathwOTk Tissue of Origin检测、用于勘察染色体异常的BAC airay检测法备受美国食品与药物管理局(FDA)的认可而被使用(Li X，QuiggRJj Zhou J, Gu W，Nagesh Rao P，Reed EF.Clinical utility of microarrays: currentstatus,existing challenges and future outlook.Curr Genomics.2008;9(7):466-74;Heller T，Kirchheiner J，Armstrong VW,Luthe H, Tzvetkov M, BrockmollerJ，Oellerich M.AmpliChip CYP450 GeneChip:a new gene chip that allows rapidand accurate CYP2D6 genotyping.Ther.Drug Monit.2006;28:673-677;Mook S，Van’tVeer LJ，Rutgers EJj Piccart-Gebhart MJj Cardoso F.1ndividualization of therapyusing Mammaprint: from development to the MINDACT Trial.Cancer Genomics Proteomics.2007;4:147-155;Lawrence HJ，Truong S，Patten N，N akao A, Wu L.detection ofp53mutations in cancer by the amplichip p53test)。并且，在韩国和欧洲等国家，用于诊断人乳头瘤病毒(HPV)的基因型的芯片备受食品与药物管理局的认可而被售卖。为了将DNA微陈列广泛利用于临床诊断，需要解决的问题不少。即使是任何一种形态的DNA微陈列，在分析信号时出现的非特异性信号，所谓本底噪声(backgroundnoise)均成为共同问题。这将给分析或产品的标准化带来困难。因此，实际上目前提出了对于DNA微陈列的准确度或价值的严重非难(Allison DB，Cui XQj Page GP and SabripouM.Microarray data analysis:From disarray to consolidation and consensus,Genetics.2006;7:55-65;Draghici SP，Eklund SPK and Eklund and Szallasi Z.Reliabilityand reproducibility issues in DNA microarray measurements.Trends in Genetics 2006;22:pp.101_109;Kothapalli R，Yoder SJ，Mane S and Loughran TPj Microarrayresults:How accurate are they .BMC Bioinformatics.2002;3:22)。DNA微陈列在许多点上一下子进行多次检测，需要对其资料进行处理，出现实际上不能容易进行准确的资料分析和统计处理的问题。通常釆用对检测结果进行统计分析时，将p值(value)调到0.05，并接受小于0.05、小于5%的错误的方法。但是，如果在微陈列上，分析数千万到10亿多个的点时，其中，约5%的数百至数千万的点的资料呈假阳性或假阴性，这将成为严重的大規模错误。为了避免这种错误，试图过分析多个微陈列的方法，但是当考虑到个别微陈列的价格昂贵的问题时，在费用方面上存在很多困难。在实际操作利用微陈列的实验时，毎次做实验結果都不同，而且各个微陈列的結果上出现大差异的情况较多，甚至，即使在相同的一个微陈列内，也按不同点出现差异。这种问题当中最大的因素之一是实验的对照组(control)未被确实定立。换言之，在DNA微陈列上进行杂交实验时，按各个点尚未明确设定内部參照物质(internal reference)。
在DNA微陈列实验时可能会出现的错误分为两种，一个是基于各实验的检体或目的的特有的错误，另ー个是微陈列自身或检测过程中引起的错误。前者与检体的不均勻性(heterogeneity)和多态性、随着生理状态而发生的变化、基因与环境的相互作用等相关。后者是DNA微陈列自身引起的错误(slide effect)，例如，制备DNA微陈列时出现的错误:固相载体即载玻片的种类和表面化学、点样探针时使用的微针、在各点上点样的探针的量、探针与载玻片的相互作用，探针是否坚固地固定于载玻片等。而且，杂交反应进行的多么顺利也是关键，这取决于温度、时间以及缓冲液的条件。标记物质是否好好标记(labeling)在检体核酸也是关键(Bakay M, Chen YW, Borup R, Zhao P，Nagaraju K and
E.P.Hofiman EP.sources of variability and efiect 01 experiments丄 approach onexpression profiling data interpretation.BMC Bioinformatics.2002;3:4;Han ES, WuY,McCarter R，Nelson JF，Richardson A and Hilsenbeck S S.Reproducibility, sourcesof variability, pooling, and sample size:1mportant considerations for the designof high-density oligonucleotide array experiments.Journal of Gastroenterology.2004;59:306-315; Huber W, Heydebreck A, Sultmann H，Poustka A and VingronM,Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression,Bioinformatics.2002;18:96-104;Mol1y MPj Brzezinski EE，Hang JQj McDowell MT and VanBogelen RA.0vercoming technicalvariation and biological variation in quantitative proteomics.Proteomics.2003
;3:1912-1919;Oleksiak MFj G.A.Churchill GA and D.L.Crawford, Variation in geneexpres sion within and among natural populations,Nature Genetivs.2002;32:261—266;Sprui丄丄 SE，Hardy JLS and Weir B.Assessing sources of variability inmicroarray gene expression data.BioTechniques.2002:916-923;Whitney AR，DiehnM，Popper SJj Alizadeh AAj J.C.Boldrick JC，Reiman DA and Brown P0.1ndividualityand variation in gene expression patterns in human blood,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2003;100:1896-1901;Zakharkin SO, Kim K，Mehta T，Chen L,Barnes S, ScheirerKE，Parrish RS，Allison DB and Page G P.Sources of variation in Affymetrixmicroarray experiments.BMC Bioinformatics.2005;6:214)。在进行DNA微陈列实验时可能会出现的另一个问题与探针相关。如上所述，迄今，大部分DNA微陈列使用直线型的单螺旋寡核苷酸探针。但是，这些探针在固相载体上进行杂交反应时，与液体状态下进行的杂交不同地难以调整成`适当条件。设计而制备适当的寡核苷酸探针是寡核苷酸微陈列的“阿基里斯腱”，也是成功的重要条件。因此，为了改善现有直线型寡核苷酸探针的问题，试图过多种变形探针的设计方法。例如，将天然的核酸在其碱基或糖环(sugar ring)或者磷酸双酯骨架(phosphodiesterbackbone)改变结构的所谓核酸衍生物(nucleic acid analog)或仿制品(mimic)。作为代表性的例子包含肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)、锁核酸(locked nucleicacid, LNA)及吗B非基(morpholino)等。PNA或LNA与常规的寡核苷酸相比时,其熔融温度(Tm)上出现明显的差异，具有尤其对单碱基的SNP或突变分析优秀的优点(Karkareb, Bhatnagar D.Promising nucleic acidanalogs and mimics:cnaracteristic featuresand applications of PNA，LNA，and morpholin0.Appl Microbiol Biotechnol.2006;71(5):575-86;TolstrupN, Nielsen PS,Kolberg TG,Frankel AM,Vissing H,KauppinenS.01igoDesign:0ptimal design of LNA (locked nucleic acid) oligonucleotidecapture probes for gene expression profiling.NucleicAcids Res.2003;31(13):3758-62;Nhakeel S, Karim S and Ali A.Peptide nucleic acid (PNA)-a review.J ournal of ChemicalTechnology and biotechnology.2006; 81:892-899)。但是，不能广泛利用于分析多个基因的表达，当前尚未开发出如同本发明的Y型探针，在内部一起结合追加的对照标准物质基因的探针的形态。作为多种变形探针的其他例子，可举例寡重生(0LIG0SPAWN)。这是由表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)的大规模单基因簇(unigene)数据库中设计横穿寡核苷酸探针(Overgo probe)的方法(Zheng.T, Svensson TT, Madishetty K, Close TI, TiangT,Lonardi S.0ligoSpawn: a software tool for the design of overgo probes from largeunigene datasets.BMC Bioinformatics.2006 Tan9: 7: 7)。这虽然有利于快速设计寡核苷酸探针，但尚未开发出如同本发明的Y型探针，在内部一起结合追加的对照标准物质基因的探针的形态。作为多种变形探针的另一个例子，还涌跃起进行基因组DNA瓦片陈列(GenomicDNA tiling array) (Bertone P, Trifonov V, Rozowsky TS, Schubert F, Emanuelsson0,Karro T.Kao MY, Snyder M, Gerstein M.Design optimization methods for genomicDNA tiling arrays.Genome Res.2006;16 (2): 271-81;Wheelan SJ, Murillo FM andBoeke JD.The incredible shrinking world of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):26-732)。这是在一个探针放入多个亚探针，接着在微陈列的一个点内嵌入多个探针来一下子检测多个基因的瓦片方式寡核苷酸微陈列`(mult1-tiling oligonucleotidemicroarray)。这是在一个探针内一下子连接位于类似位置的多个寡核苷酸而层压的形态的探针，对确认巨大基因组整体的基因表达有效。但是，这只是单纯地将多个寡核苷酸连接为纵长的直线，而无法分开识别进入到一个瓦片(tiling)探针内的各个寡核苷酸和亚探针。这虽然对检测基因数的延长有效率，但并不像本发明的Y型探针包含内部对照参照物质，因此检测的灵敏度或特异度及再现性难以被视为显著提高。如上所述，为了 DNA微陈列广泛利用于临床诊断，DNA微陈列所使用的寡核苷酸探针需要进一步改善，而且可使检测法和结果解读均为标准化是关键。首先，为了实现标准化，需要按各个点添加内部参照物质或对照物质(internal reference or control)的探针。这是为了解决各个点与微陈列、各个点与载玻片、各个点与杂交反应的差异及错误而必须要采用的。
发明内容
技术问题本发明的目的在于，提供在各点上将要检测的靶基因和对照标准物质的基因一起用作探针而嵌入的新颖Y型探针及其变形型，由此改善以往寡核苷酸探针，并解决现有寡核苷酸微陈列的问题，实际应用于临床诊断。问题的解决手段本发明者为了解决上述的现有寡核苷酸微陈列的问题，讲究了一个探针和在一个点内将要检测的靶基因和对照基因一起用作探针而嵌入的方法。一起结合靶基因的探针和对照基因的探针来制成一个探针，以可充分统计的数字(例如，20个以上)，在微陈列上对该探针进行点样之后，在其上侧放置检体核酸，即DNA或RNA、cDNA、cRNA、微小RNA等进行杂交反应时，如果分别将靶基因和对照基因标记为Cy_3及Cy-5，则在各点上除外本底信号之后的信号中测定了对照基因与靶基因的信号之比(Cy3/Cy5)，如果在各个点上检索该比之后计算其平均及标准偏差，则可实现更加正确的的统计分析。这相当于在各个点内嵌入对照组来进行实验的结果，由此使假阳性和假阴性最小化，避免点之间差异引起的错误，从而可实现顺畅的正态化(normalization)。由此,使上述的滑动效果，即DNA微陈列导致的错误最小化，仅通过少数的微陈列的实验，即可获得可统计的资料，因此还可以显著减少各实验中所需的费用和时间。据此，本发明者发明了在一个本体内以Y字形态放置两个寡核苷酸探针部位的本发明的Y型探针以及在固相载体上点样该Y型探针的方法。同时，还研制出了使Y型探针中的一侧不对称地变短的变形，即d字形或者b字形的探针。由于本发明的探针一次包含两个寡核苷酸探针或者肽核酸(PNA)探针并形成为Y字形态，因而，所包含的各探针与各自的互补性碱基序列的核酸进行反应，由此同时发生两个杂交反应，在进行该反应时，嵌入两个不同的检索用染料(dye)，从而可分析其反应。本发明者开发及制备出如此的Y字形双重寡核苷酸探针(Y-shaped duplex oligonucleotideprobe,以下被称为‘Y字形探针’或者‘Υ字探针’或者‘Υ型探针’)，还开发了通过利用该Y字形双重寡核苷酸探针来检测基因，并将该Y字形双重寡核苷酸探针应用于临床诊断的方法。`本发明的探针由左侧探针部分(left side probe)、左侧莖区部分(left sidestem)、右侧莖区部分、右侧探针部分、连接肽(linker)(或者间隔(spacer))部分等五种部位形成。本探针的左侧及右侧探针部分由最多达到150个的寡核苷酸或者PNA形成，按照目的可应用多种碱基序列。只不过，就两侧的寡核苷酸探针而言，其碱基序列的一侧为正向(5’ 一3’)，另一侧为反向(3’ 一5’)。茎区部分由最多达到40个的互补性寡核苷酸形成，并起到支撑向上方相连接的两侧探针的作用。可采用所有的茎区部分的碱基序列，若使用端粒碱基顺序则方便。连接肽起到将两侧的探针和茎区固定在载玻片等固相载体上的作用。作为DNA微陈列的载体，广泛利用经过醛处理的载玻片，在该情况下，作为连接肽适合采用内部氨基发生变形的多个碳基组(internal Amino Modifier Cn dT;iAmMCnT)。除此之外，将在末端带有生物素(biotin)的多个碳基组用作连接肽，上述探针和茎区还可以通过利用该连接肽，固定在包被链毒亲和素(streptoavidin)的载体上。如果利用阵列仪(arrayer)将本发明的Y字形探针点样在载玻片等载体，则完成DNA微陈列。其中，用突光染料(fluorescent dye)等来标记要检测的祀核酸，即DNA或RNA、cDNA、cRNA、微小RNA等之后,放置该祀核酸进行杂交反应之后,可用荧光扫描机来分析此时产生的突光信号。此时的扫描机根据检测目的和方法可选择单色、双色或者四色的扫描机。本发明的Y字形寡核苷酸探针，相比单一直线型探针具有更优秀的优点。第一，由于在一个整体的探针内包含两个探针部位，因而进行双重检索，由此可进行更准确的分析。第二，通过一起检索对照标准物质或内部参照物质，来使假阴性结果(false negativeresult)和假阳性结果(false positive result)最小化,因此可改善检测的灵敏度和特异度。第三，通过避免点间错误，可实现更准确的统计分析。第四，可实现对于对照物质的靶物质的相对性计量。第五，由于存在茎区部位，对于熔融温度(Tm)或时效处理温度来说，在热力学上可更加进行区别化，这将在以等位基因特异杂交方式对单一碱基的突变进行分析时，会更清楚地掌握变化。第六，茎区部位位于其上侧的探针部位和连接肽及载玻片载体之间，来减少空间妨碍或电磁场妨碍，并且使杂交反应顺利进行。根据本发明，第一，可提 供可分析要诊断的疾病及各基因的DNA或者RNA的特定序列有无的Y型探针及其设计和制备方法，第二，可提供点样了Y型探针的生物芯片及其制备方法，第三，可提供能够有效地与上述生物芯片进行反应的PCR方法和荧光标记方法，第四，可提供利用上述生物芯片来检测靶基因，并分析基因型、基因表达程度及基因碱基序列的突变的方法，第五，可提供能够将上述生物芯片用于临床的方法。发明的主旨本发明提供一种在一个本体具有两个探针部位的Y字形的核苷酸探针。优选地，本发明的上述探针向5’ 一3’的方向以及从左侧上方朝向右侧上方的方向，依次由(I)左侧探针部位、(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位、(4)右侧茎区部位以及(5)右侧探针部位形成。本发明提供d字形的核苷酸探针，上述Y字形探针的(I)左侧探针部位被去除，由
(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位、(4)右侧茎区部位及(5)右侧探针部位形成。本发明提供b字形的核苷酸探针，上述Y字形探针的(5)右侧探针部位被去除，由(I)左侧探针部位、(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位及(4)右侧茎区部位形成。优选地，就本发明的上述Y字形、d字形及b字形的探针而言，上述左侧茎区部位和右侧茎区部位呈现由具有互补的碱基序列的寡核苷酸来相结合的结构，上述左侧茎区部位或者右侧茎区部位，在分别相对于左侧茎区部位或者右侧茎区部位的整体碱基序列中，包含一半以上的G碱基。优选地，本发明的上述左侧茎区部位和右侧茎区部位呈现由具有互补的碱基序列的寡核苷酸来相结合的结构，茎区部位的碱基序列包含端粒的碱基序列。优选地，本发明的上述左侧茎区部位或者右侧茎区部位，由碱基单体反复一次以上而形成，上述碱基单体选自包含以下的碱基单体的组中。TTGGG ；TAGGG ；TTGGGG ；TTTGGG ；TTAGGG ；TTTGGGG ；TTTAGGG ；TTTTGGGG ；TTTAGGGG。优选地，本发明的上述左侧探 针部位或者右侧探针部位具有与靶基因互补的碱基序列的寡核苷酸。
优选地,本发明的上述左侧探针部位或者右侧探针部位是具有15个至150个的碱
基序列的寡核苷酸。优选地，就本发明的上述左侧探针部位而言，从上方到下方的碱基序列以5’ 一 3’的顺序排列；就上述右侧探针部位而言，从下方到上方的碱基序列以5’ 一3’的顺序排列。优选地，本发明的上述连接肽部位为了与包被醛固相载体相结合，由作为氨基改性双脱氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。优选地，本发明的上述探针由肽核酸(PNA)形成。优选地，本发明的上述探针通过合成方法来制备而得，该合成方法包括以下步骤:I)脱除三苯甲基步骤；2)偶联步骤；3)加帽步骤；以及4)氧化步骤。优选地，本发明的上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有分别与一个靶基因内的两个相互不同的部位互补的碱基序列。优选地，本发明的上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有与一个祀基因内的相同的部位互补的碱基序列。优选地，本发明的上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有分别与相互不同的靶基因互补的碱基序列。优选地，本发明的上述左侧探针部位和右侧探针部位中的一侧探针部位由具有与靶基因互补的碱基序列的寡核苷酸形成；剩余的一侧`探针部位由具有与对照基因互补的碱基序列的寡核苷酸形成。优选地，本发明的上述对照基因与靶基因没有互补性，并且在检体中不存在或者表达。优选地，本发明的上述对照基因是大肠杆菌的motD基因。优选地，本发明的上述探针是具有序列号5至序列号50中的一个以上碱基序列的
寡核苷酸。本发明提供一种DNA微陈列，该DNA微陈列是上述探针在固相载体进行点样而形成的。优选地，本发明的上述固相载体选自包含载玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龙膜的组中。优选地，本发明的上述DNA微陈列还点样了人β —珠蛋白基因。优选地，本发明的作为上述探针的点样部位的加样孔(well)划分为8个。优选地，本发明的上述探针由具有序列号5至序列号50中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的检测及基因型分析。优选地，本发明的上述探针与具有5’末端由Cy5来标记的序列号4的碱基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3来标记的序列号I的碱基序列的寡核苷酸引物互补地相结
八
口 ο优选地，本发明的上述探针由具有序列号51至序列号55中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于作为性传播疾病(STD)的病原菌的检测以及基因型分析，上述病原菌分别为淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、单纯性疱疹病毒(HSV)、梅毒螺旋体(TP)及杜克雷嗜血杆菌(HD)。优选地，本发明的上述探针由具有序列号56至序列号199中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于A型流感病毒的检测以及基因型分析。优选地，本发明的上述探针由具有序列号212至序列号213的碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于表皮生长因子受体(EGFR)基因和β -肌动蛋白的表达分析。优选地，就本发明的上述探针而言，左侧探针部位和右侧探针部位中的某一侧由与靶核酸的有义链的单核苷酸多态性(SNP)部位互补的寡核苷酸形成，剩余的一侧由与不具有靶核酸的反义链的SNP部位的部位互补的寡核苷酸形成，上述探针用于SNP分析。优选地，本发明的上述探针由序列号220至序列号239中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于 ACE、ADRB2、Apo E、CETP, CFH、ESRl、ILIA、MTHFR 或者 N0S3 基因的SNP分析。优选地，本发明的上述探针由序列号258至序列号272中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于K-ras基因的突变分析。优选地，本发明的上述d字形探针的右侧探针部位由具有与A、C、G或者T的点突变互补的碱基序列的寡核苷酸形成；此时，将与点突变互补的碱基位于右侧探针部位的中心部位；右侧探针部位的长度为15bp至30bp，上述d字形探针用于点突变分析。本发明提供一种检体的基因分析用试剂盒，该检体的基因分析用试剂盒包含:上述DNA微陈列；针对检体的靶基因的PCR反应用引物对；缓冲液；以及杂交反应用缓冲液。优选地，本发明的上述PCR反应用引物对用于A型流感病毒的基因扩增，上述PCR反应用引物对是具有选自序列号208至`序列号211中的碱基序列的寡核苷酸。优选地，本发明的上述PCR反应用引物对用于β -肌动蛋白和EGFR基因的定量型实时PCR，上述PCR反应用引物对分别是具有序列号214至序列号219的碱基序列的寡核苷酸。优选地，本发明的上述PCR反应用弓丨物对用于SNP检测，上述PCR反应用弓丨物对是具有选自序列号240至序列号257中的两个以上碱基序列的寡核苷酸。优选地，本发明的上述试剂盒用于疾病的诊断、预防、预测或者对症治疗。本发明提供一种基因分析方法，该基因分析方法包括在上述DNA微陈列上放置用标记物质来标记的检体的靶核酸，并对上述探针和靶核酸进行杂交的步骤。优选地,本发明的上述标记物质是选自包含Cy3、Cy5、Cy5.5、氟硼突(Bodipy)、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568>Alexa594>Alexa 660、罗丹明(Rhodamine)、TAMRA> FAM> FITC、Fluor X、ROX、德克萨斯红(Texas Red)、澄青(Orange green) 488X、澄青 514X、HEX、TET、JOE、牡蛎(Oyster) 556、牡蛎 645、氟硼荧 630/650、氟硼荧 650/665、Calfluor Orange 546、Calfluor red 610>Quasar 670 及生物素的组中的一个以上的标记物质。优选地，本发明的上述祀核酸通过PCR、RT-PCR或者试管内转录(in vitrotranscription)方法,用标记物质来标记。优选地，本发明的基因分析方法，还包括如下步骤:经过上述杂交反应之后，利用荧光扫描机来分析标记物质的信号，来勘察靶核酸的表达程度。优选地,本发明的上述信号分析是通过正态化过程(normalization)来进行的。优选地，本发明的上述正态化过程是在各点上除外本底的噪声信号，来勘察Cy5和Cy3的信号，重新与作为持家基因的β -肌动蛋白基因的Cy3信号进行比较的三重正态化过程。优选地，本发明的上述靶核酸选自包含DNA、RNA、cDNA及cRNA的组中。优选地，本发明的上述cDNA通过RT-PCT，并用Cy3来标记；上述cRNA通过试管内转录，并用Cy3来标记。优选地，在用本发明的上述Cy3来标记的cDNA或者cRNA上杂交了混合物，该混合物由用Cy5来标记的作为外部对照物质(external control)的大肠杆菌的motD基因混合。并且，本发明涉及一种利用Y型探针的临床诊断方法，该临床诊断方法包括如下步骤:第一步骤:设计Y型探针的步骤；第二步骤:合成Y型探针的步骤；第三步骤:利用Y型 探针来制备DNA微陈列的步骤；第四步骤:准备要置于微陈列上的核酸检体，通过PCR或者试管内转录等方法，将标记物质(labeling dye)粘在上述核酸检体的步骤；第五步骤:将检体置于DNA微陈列，并进行杂交反应的步骤；第六步骤:在DNA微陈列上进行杂交反应之后，对其信号进行解读及分析的步骤；第七步骤:利用Y型探针来掌握靶基因及对照基因的存在与否及存在量的步骤；第八步骤:利用Y型探针来进行多种基因型分析，并将该Y型探针应用于临床诊疗的步骤，具体而言，是诊断HPV或流行性感冒及性传播的病原菌，并且表明其类型，由此决定疾病诊断和治疗方针的步骤；第九步骤:利用Y型探针来分析多个基因的表达程度的步骤；第十步骤:利用Y型探针来分析特定碱基序列的突变，即SNP或点突变等的步骤；第十一步骤:将Y型探针应用于临床诊断的步骤，具体而言，是通过SNP分析预测发病的危险，来预先预防发病，或者通过SNP分析预测药物效果及副作用来对症选药，或者通过突变分析及基因表达分析，筛选(screening)或者诊断疾病，或者预测药物效果，对症选药的步骤。发明的效果根据利用本发明的Y型探针及其变形型的基因分析用DNA微陈列(芯片)及试剂盒，都能准确地分析特定基因的存在及其类型，以及表达程度和碱基序列的变化，进而不仅能够快速而准确地诊断感染和癌症等各种疾病，还能分类病症，预测严重度和预后，决定治疗方针，对症下药等，由此十分有用于临床诊疗。
图1是表示本发明的Y型探针的一例的示意图。图2是用于将本发明的Y型探针与芯片表面相结合的反应物质iAmMC6T( internalAmino Modifier C6 dT)的化学结构。图3是通过PCR使作为宫颈癌诱因病毒(HPV)的人β珠蛋白(human betaglobin;HBB)基因扩增来对其进行电泳的照片(实施例5)。图3是用Cy5来标记HPV-16L1基因，用Cy3来标记HBB基因，在人工晶癌细胞(0&^)的细胞株(即￥_16型标准物质)中通过公知的方法提取DNA，利用表I的LI基因和HBB基因各自的引物来执行PCR，在0.8%琼脂糖凝胶执行电泳的结果。道(Lane)M:100bp尺寸标记，道1:阴性对照组，道2:HPV_16L1基因的PCR产物(185bp)，道3:HBB基因的PCR产物(102bp)。图4是可诊断宫颈 癌诱因病毒(HPV)的DNA生物芯片的各加样孔(well)内所出现的方格(grid)(实施例4)。红色部分是在HPV中间点样高危型的部分，绿色部分是在HPV中间点样低危型的部分，黄色部分是点样HBB基因的部分，蓝色部分是在本发明的Y型探针中间点样一个YP16S和YP16AS的部分。图5是在利用图4的方格来制备的22种的HPV芯片上同时点样本发明的Y型探针，并利用HPV-16 (Cy5标记)和HBB (Cy3标记)来杂交之后的扫描图片(实施例5)。孔板(Well) l&2:HPV16-Cy5&HBB-Cy5 标记的检体、孔板(Well) 3&4:HBB_Cy5 标记的检体、孔板(Well) 5&6:HPV16-Cy5&HBB的正向引物上用Cy3来标记的检体、孔板(Well)7&8:HPV16-Cy5&HBB的反向引物上用Cy3来标记的检体。图6是在利用HBB正向_Cy3PCR产物来杂交的芯片中，在532nm下仅对一个加样孔进行扫描的图片(实施例6)。图7是在3%琼脂糖凝，对利用STD芯片用标准物质来执行PCR的产物进行电泳的图片。M:100bp DNA尺寸标记，道(Lanel)至6经过单一PCR，并分别表示为杜克雷嗜血杆菌的PCR产物(440bp )、疱疹病毒I型的PCR产物(384bp )、疱疹病毒2型的PCR产物(400bp )、沙眼衣原体的PCR产物(32Ibp)、淋球菌的PCR产物(284bp)以及梅毒的PCR产物(260bp)，道7是使用上述5个标准物质，并通过实施例9的方法执行多重PCR的产物，可确认5个基因均实现PCR。图8是在利用Y型探针的STD芯片上，对用阳性物质来使淋球菌杂交的结果进行扫描的图片(实施例9)。图9是在利用Y型探针的STD芯片上，对用阳性物质来使沙眼衣原体杂交的结果进行扫描的图片(实施例9)。图10是在利用Y型探针的STD芯片上，对用阳性物质使梅毒螺旋体杂交的结果进行扫描的图片(实施例9)。图11是在利用Y型探针的STD芯片上，对用阳性物质使杜克雷嗜血杆菌杂交的结果进行扫描的图片(实施例9)。图12是在利用Y型探针的STD芯片上，对用阳性物质使单纯性疱疹病毒杂交的结果进行扫描的图片(实施例9)。图13表示利用Y型探针的A型流感病毒芯片的方格(实施例10)。图14是对用标准物质使A型流感病毒芯片杂交的结果进行扫描的图片(实施例10)。H基因由Cy5来标记，N基因由Cy3来标记，RPP、SWH1、SW infA及infA均由Cy5来标记。第一图片是利用本发明的Y型探针，在532nm和635nm下扫描的图片,猪(swine)流行性感冒(HlNl)的病毒仅在本发明芯片的HlNl、HlONl、infA、RPP、swHl及swinfA的点上表示信号，在第二波长635nm下仅表示NI基因的信号，在第三波长532nm下，仅在HlNl、infA、RPP、swHl及swinfA的点上表示信号。因此，证明了本发明的芯片中所使用的Y型探针分别与猪流行性感冒病毒基因进行杂交。图15a是利用拖慢(TaqMan)探针，均对各个RnaseP、SffHU Sff infA及infA基因进行一步法实时反转录-聚合酶链式反应(One step Real time RT-PCR)之后,使用转子基因(rotor gene) 6.0软件来分析的结果。使用从阴性对照组(nc, negative control)、阳性对照组(pc, positive control ;新型流行性感冒阳性病毒的RNA)及患者的检体提取的RNA，来执行实时RT-PCR，由此确认，患者的三个检体仅在RnaseP中被检测而呈阴性，阳性对照组中的SWHl、Sff infA、infA和RNaseP基因均得到扩增。图15b是利用拖慢(TaqMan)探针，并通过7个临床检体仅分析各个RNaseP和SWHl基因的结果。7个检体当中，只有两个检体从SWHl和RNaseP中被检测且呈阳性，剩余的4个检体的基因当中，只有RNaseP基因均得到扩增，因此呈阴性，一个检体连RNaseP基因也得不到扩增，因此进行复检。图16是在2%琼脂糖凝胶,对通过执行实时反转录聚合酶链式反应(Real timeRT-PCR)而获得的结果中的RNase P基因和SWHl基因的PCR产物进行电泳的图片。由本图片所确认，对于实际检体来说，由于仅靠PCR产物的大小，在电泳难以区分阳性和阴性，因而HlNl需要执行通过使用本发明的DNA芯片或实时反转录聚合酶链式反应(RealtimeRT-PCR)方法来确认的检测。M:100bp DNA尺寸标记、N:阴性对照组(Negative control)、道(Lane) I至6:利用患者的检体来获得的PCR产物、cDNA:新型流行性感冒阳性物质的cDNA。图17是表示本发明的基因表达检测用Y型探针的基本结构和在点样该基本结构的微陈列上，对检体和对照物质的cRNA进行杂交的示意图。图18是表示利用Y型探针来分析基因表达时的外部对照物质的示意图。具体地表示，实施例11所使用的T7启动子和包含多聚A尾巴、大肠杆菌motD基因的合成寡核苷酸(A)及质粒(B)序列。将这些用作模板(templ`ate),加入Cy_5,进行试管内转录,制作用荧光标记的靶之后，与从检体中获得的cRNA混合而用于在DNA微陈列上执行的杂交反应。图19是从正常人和患者的检体中提取RNA之后合成cDNA，通过Y型探针微陈列来分析EGFR基因和β-肌动蛋白基因的表达的图片(实施例11)。图20是从正常人和患者的检体中提取RNA之后合成cDNA，通过qRT_PCR来分析EGFR基因和β-肌动蛋白基因的表达的结果(实施例11)。由此可知，肌动蛋白基因的Ct值在两个检体之间未出现差异，EGFR基因在患者身上可以表达，但在正常人身上无法表达。图21表示利用包含Y型探针的SNP基因型芯片来检测基因的结果，图21是利用双色(dual color)荧光扫描机的图片。在各点上去除本底信号之后，勘察Cy_5对比Cy_3的经过正态化处理的信号(normalized signal),据此寻出完全一致的点的探针,其结果，呈现对CFH、CETP及MTHFR基因不利的(unfavorable, high risk) SNP。即，与用各基因的Cy3来标记的PCR反应物质进行杂交而产生的报道基因有SNP的情况下，扫描时用绿色来表示，与用Cy5来标记的PCR反应物质杂交而产生的参比基因是没有SNP的部分，因此扫描时经常用红色来表示。因此，对于在一个基因中的Y型探针来说，当各基因没有SNP部分时，均用Cy5来表示，当具有SNP部分时，用互补色来表示。因此，本检体中，在补体因子(CFH, Complement factor H)基因的第 402 密码子出现了 SNP (Y402H, rsl061170)，在胆固醇酯转运蛋白(CETP,Cholesterol ester transporter protein)基因的第 1553 喊基出现了 SNP (G1533A)。并且,在亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR, Methylene tetrahydrofolatereductase)的第 677 次碱基分别表示 SNP (C677T, Ala222Val)。图22是表示对于K-ras基因的第12密码子的GTT (Gly)和AGT (Ser)的d型探针的结构的示意图。图23是K-ras DNA微陈列的扫描图片。分析肺癌患者的血液检体的结果表明，K-ras基因的第12密码子由GTT突变为AGT (Glyl2Ser)。
具体实施例方式以下，通过实施例更详细地说明本发明。然而，以下实施例只是用于证明本发明的结构及效果的一例，而不表示本发 明局限于以下实施例。实施例1:Y型探针的设计对DNA芯片开发起到最重要作用的过程是研制本发明的Y字形态的双重寡核苷酸探针的结构。其中，包括如下工序:粘贴用于将该探针置于固相载体(solidsupport, features)的连接肽的工序；粘贴间隔(spacer),为了察看信号，粘贴标记物质(labeling dye)的工序。本发明的Y型探针是连续的一个寡核苷酸，并呈以Y字形树枝形态，将两个不同的寡核苷酸探针置于茎区上的类似于树的结构。如同将该树种在地上的根部，即为将上述探针置于载玻片等固定载体的部分叫做连接肽或者间隔。检体像雪一样掉落在该树上，对于该检体来说，如果具有与树的两支的探针互补的序列的DNA或者RNA选择性地相结合，则发生杂交反应，剩余的雪(检体)将被洗去。在该杂交反应粘贴标记物质(labeling dye)来解读其信号。本发明的Y型探针与文献中揭示的所谓分子信标(molecular beacon)或者发卡探针(hairpin probe)不同，即在结构上没有所谓环(loop)部分，而且也不使用粹灭探针(quencher probe)。(Wang K, Tang Z, Yang CJ, Kim Y, Fang X, Li ff, Wu Y, MedleyCD，Cao Z and Li J.Molecular engineering of DNA:Molecular beacon.Angew ChemInt Ed Engl.2009;48 (45):856-870;Li Y，Zhou X and Ye D.Molecular beacons:anoptimal multifunctional biological role.Biochemical and Biophysical ResearchCommunincation.2008;373:457—461;Yao GY and Tan W.Molecular-beacon-basedarray for sensitive DNA analysis.Anakytical Biichemistry.2004;331:216-223;Broude NE.Stem-1oop oligonucleotides:a robust tool for molecular biology andbiotechnology.Trends in Biotechnology.2002; 20 (6): 249-256)。因此，是个与信标完全不同的探针。而且，在结构或者作用方法上，与其他文献中揭示的信标变形的探针完全不同(Tsourkas A，Behlke MA and Bao G.Structure-function relationship ofshared stem and conventional molecular beacons.Nucleic Acids Research.2002;30( 19): 4208-4215;Misra A，Kumar P and Gupta KC.Design and Synthesis ofhairpin probe for specific mis—match discrimination.Nucleic Acids SymposiumSeries.2007;51:311-312;Riccelli RVjMerante F，Leung KTjBortolin S，ZastawnyRLj Janeczko R and Benight AS.Nucleic Acid Research.2001;29 (4):996-1004)。如图1所示，本发明的Y型探针从5’ 一3’方向来看，并且从左侧上方开始向右侧上方时，由(I)左侧探针部位(left side probe, A部位)、(2)左侧莖区部位(left sidestem, B部位)、(3)连接肽至间隔部位(C部位)、(4)右侧莖区部位(right side stem, D部位)以及(5)右侧探针部位(right side probe, E部位)构成。以下，更详细的说明各部位的结构如下。(I)莖区部位(stem part)为了适当定位本发明的Y型探针，优先适当地制备用于支撑该Y型探针的茎部分。茎成为由具有互补性的序列的寡核苷酸结合的结构，优选地，为了坚固地结合，C-G碱基需占一半以上，在C-G碱基之间插入T或者A碱基。例如，GnTGmTGo的形态。虽然可以采用多种碱基序列的结构，但优选的是生体内自然存在。在有核生物的染色体的末端存在由反复的碱基序列构成的端粒(telomere)，就人等哺乳类而言，其序列呈现反复了 TTAGGG或TTTAGGG或T1-3 (T/A) G3-的结构，就其他生物而言，其序列呈现反复了TTGGGG或TTTTGGGG的结构。在免疫球蛋白的开关部位(switch portion)上也出现类似的结构(Balagurumoothy P, Brahmachari SK, Mohnaty D, Bansal M and SasisekharanV.Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences.Nucleic AcidsResearch.1992;20 (15):4061-4067;Balagurumoothy P and Brahmachari SK.Structureand stability of human telomeric sequence.Journal of Biochemistry.1994;269
(34):21858-21869)0优选地，发明的茎部位成为在其一侧的链上反复以下的碱基一次或两次以上的结构。例)1.TTGGG`2.TAGGG3.TTGGGG4.TTTGGG5.TTAGGG6.TTTGGGG7.TTTAGGG8.TTTTGGGG9.TTTAGGGGS卩，最短为5个至9个的寡核苷酸互补结合，并可以延长其长短。当考虑到经济费用和效率时，如果利用由TTAGGG-AATCCC的碱基序列形成的人体的端粒的最小单位就很简便。但是，其长度可以不受限制地变形。通常，只要是C6、C12或者C18就无妨。(2)左侧及右侧探针部分其中，寡核苷酸探针设计成与要检测的靶基因互补，并且可以采用任何碱基序列。但是，必须适当设计左侧及右侧探针的寡核苷酸的碱基序列和长度。需要注意的是，选择探针的优选的基本原则在于，左侧和右侧的寡核苷酸相互具有互补性，而防止左侧和右侧的寡核苷酸相结合，并且，防止各自构成二次结构。在Y型探针的设计中，另一个重要的是方向。左侧探针(A部位)包含反向的3’ 一5’顺序的序列，右侧探针(E部位)需要构成正向的5’ 一3’顺序的序列。左侧探针部位和右侧探针部位的长度，通常是优选为15bp至75bp左右，根据用途，可以是延长到150bp左右，或者相反地还可缩短为小于15bp。各探针的准确的长度随着如何决定实验目的、靶基因的结构及碱基序列上的特征、检测的灵敏度和特异度、再现性、噪声、偏压(bias)而不同。当要提高特异度时,通常使用最短为15bp至25bp的寡核苷酸。当着重于灵敏度时，通常 使用最长为40bp至70bp的寡核苷酸。当为了 SNP或突变而要进行等位基因特意杂交分析时，探针长度为15个至22个左右，研制能够识别其中心部的I个碱基或者两三个碱基之差。当检体为相对于特定基因的PCR产物，在其产物寻出特定碱基序列的存在而要分析基因型时，例如，当要分析病毒或细菌感染的准确的种和亚种的基因型时，将探针长度为20个左右，尤其选择3碱基以上在中心部出现差异。根据序列存在不能使用的喊基。左侧和右侧的探针长度无需相互对称，根据目的和用途，左侧探针的长度极端的变短，如图22所示，也可成为d字形。并且，右侧的探针极端的变短，还可成为b字形。寡核苷酸探针的碱基序列及长度的决定参照公知的方法即可。即，在要检测的靶基因的部位中，需要选择与非祀向(non-targeting)基因互补性最小的特异部位。接着，探针应设计成，通过调整杂交温度，使探针的熔解温度(Tm)的范围在适当范围内。此时，当然要加入C+G的百分比和探针长度来计算。防止构成二次结构，优选地分析自我折叠能源(self folding energy)。通常使用的方法是，以滑动窗口(sliding window)方式提取候补探针集合之后，基于该候补组，除了与对象基因进行互补结合以外，考虑多个条件等来最终选择最顺利发生杂交的可能性高的探针。还可以通过虚拟杂交模块(virtualhybridization module)可选定最佳的探针。探针集合设计可被视为，寻出发生杂交的可能性高的序列的最优化问题，在这种观点上，还使用进化计算方法。并且，还使用人工神经网络等的学习方法(David P.Kreil, Roslin R.Russell and Steven Russell.Microarray Oligonucleotide Probes.Methods in Enzymology2006;410:73-98;Lemoline S, Combes F and Le Crom S.An evaluation of custom microarray application:theoligonucleotide design challenge.Nucleic Acids Research.2009;37(6):1726-1739)。简便的方法使用被商业化而在市场售卖的寡核苷酸探针设计程序。例如，ArrayOligoSeIector、CommOligo、HPD、Mprime、01iD、01igoArray、OLigodb、OLigoFaktory、OLigoPicker、POligoWiz、Oliz、Ospery、PICKY、PROBEmer> Probesel> ProbeSelect、R0S0、SEPON及YODA等。这些大部分提供交叉杂交(cross hybridization)分析、适当探针的数分析、避免所谓的低复杂度区(low complexity zone)、方向设定等必要的基本信息。(Bozdech Z, Zhu J, Joachimiak MP, Cohen FE, Pulliam B, DeRisi JL.Expression profiling of the schizont and trophozoite stages of Plasmodiumfalciparum with a 1ng-oligonucleotide microarray.Genome Biol.2003;4:R9;LiX, He Z,Zhou J.Selection of optimal oligonucleotide probes for microarraysusing multiple criteria, global alignment and parameter estimation.NucleicAcids Res.2005;33:6114-6123;Rimour S, Hill D, Militon C, Peyret P.GoArrays:highlydynamic and efficient microarray probe design.Bioinformatics.2005;21:1094-1103;Chung WH, Rhee SK, Wan XF, Bae JW, Quan ZX, Park YH.Design of long oligonucleotideprobes for functional gene detection in a microbial community.Bioinformatics.2005;21:4092-4100;Rouchka EC, Khalyfa A, Cooper NG.MPrime: efficient
权利要求
1.一种Y字形的核苷酸探针，其特征在于，在一个本体具有两个探针部位。
2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，上述探针向5’一3’的方向以及从左侧上方朝向右侧上方的方向，依次由(I)左侧探针部位、(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位、(4)右侧茎区部位以及(5)右侧探针部位形成。
3.一种d字形的核苷酸探针，其特征在于，根据权利要求2所述的探针的(I)左侧探针部位被去除，由(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位、(4)右侧茎区部位及(5)右侧探针部位形成。
4.一种b字形的核苷酸探针，其特征在于，根据权利要求2所述的探针的(5)右侧探针部位被去除，由(I)左侧探针部位、(2)左侧茎区部位、(3)连接肽部位及(4)右侧茎区部位形成。
5.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 上述左侧茎区部位和右侧茎区部位呈现由具有互补的碱基序列的寡核苷酸来相结合的结构； 上述左侧茎区部位或者右侧茎区部位，在分别相对于左侧茎区部位或者右侧茎区部位的整体喊基序列中，包含一半以上的G喊基。
6.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 上述左侧茎区部位和右侧茎区部位呈现由具有互补的碱基序列的寡核苷酸来相结合的结构； 莖区部位的喊基序列包含端 粒的喊基序列。
7.根据权利要求5所述的探针，其特征在于，上述左侧茎区部位或者右侧茎区部位，由碱基单体反复一次以上而形成，上述碱基单体选自包含以下的碱基单体的组中:TTGGG、TAGGG、TTGGGG、TTTGGG、TTAGGG、TTTGGGG、TTTAGGG、TTTTGGGG、TTTAGGGG。
8.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位或者右侧探针部位是具有与靶基因互补的碱基序列的寡核苷酸。
9.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位或者右侧探针部位是具有15个至150个的碱基序列的寡核苷酸。
10.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 就上述左侧探针部位而言，从上方到下方的碱基序列以5’ 一3’的顺序排列； 就上述右侧探针部位而言，从下方到上方的碱基序列以5’ 一3’的顺序排列。
11.根据权利要求2至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述连接肽部位为了与包被醛固相载体相结合，由作为氨基改性双脱氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。
12.根据权利要求1至4中的任一项所述的探针，其特征在于，上述探针由肽核酸(PNA)形成。
13.根据权利要求1至4中的任一项所述的探针，其特征在于， 上述探针通过合成方法来制备而得，该合成方法包括以下步骤: 1)脱除三苯甲基步骤； 2)偶联步骤； 3)加帽步骤；以及 4)氧化步骤。
14. 根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有分别与一个靶基因内的两个相互不同的部位互补的碱基序列。
15.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有与一个靶基因内的相同的部位互补的碱基序列。
16.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述左侧探针部位和右侧探针部位分别由寡核苷酸形成，该寡核苷酸具有分别与相互不同的靶基因互补的碱基序列。
17.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于， 上述左侧探针部位和右侧探针部位中的一侧探针部位由具有与祀基因互补的喊基序列的寡核苷酸形成； 剩余的一侧探针部位由具有与对照基因互补的碱基序列的寡核苷酸形成。
18.根据权利要求17所述的探针，其特征在于，上述对照基因不与靶基因具有互补性，并且在检体中不存在或者表达。
19.根据权利要求17所述的探针，其特征在于，上述对照基因是大肠杆菌的motD基因。
20.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，上述探针是具有序列号5至序列号50中的一个以上碱基序列的寡核苷酸。
21.一种DNA微陈列，其特征在于，根据权利要求1至4中的任一项所述的探针在固相载体进行点样而形成。
22.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述固相载体选自包含载玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龙膜的组中。
23.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述DNA微陈列还点样了人β—珠蛋白基因。
24.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，作为上述探针的点样部位的加样孔划分为8个。
25.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由具有序列号5至序列号50中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的检测及基因型分析。
26.根据权利要求25所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针与具有5’末端由Cy5来标记的序列号4的碱基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3来标记的序列号I的碱基序列的寡核苷酸引物互补地相结合。
27.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由具有序列号51至序列号55中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于作为性传播疾病(STD)的病原菌的检测以及基因型分析，上述病原菌分别为淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、单纯性疱疹病毒(HSV)、梅毒螺旋体(TP )及杜克雷嗜血杆菌(HD )。
28.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由具有序列号56至序列号199中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于A型流感病毒的检测以及基因型分析。
29.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由具有序列号212至序列号213的碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于β_肌动蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达分析。
30.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，就上述探针而言，左侧探针部位和右侧探针部位中的某一侧由与靶核酸的有义链的单核苷酸多态性(SNP)部位互补的寡核苷酸形成，剩余的一侧由与不具有靶核酸的反义链的SNP部位的部位互补的寡核苷酸形成，上述探针用于SNP分析。
31.根据权利要求30所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由序列号220至序列号239中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于ACE、ADRB2、Apo E、CETP、CFH、ESR1、ILIA、MTHFR或者NOS3基因的SNP分析。
32.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于，上述探针由序列号258至序列号272中的一个以上碱基序列的寡核苷酸形成，并且用于K-ras基因的突变分析。
33.根据权利要求21所述的DNA微陈列，其特征在于， 上述d字形探针的右侧探针部位由具有与A、C、G或者T的点突变互补的碱基序列的寡核苷酸形成； 此时，将与点突变互补的碱基位于右侧探针部位的中心部位； 右侧探针部位的长度为15bp至30bp，上述d字形探针用于点突变分析。
34.一种检体的基因分析用试剂盒，其特征在于， 包含: 根据权利要求21所述的DNA微陈列； 针对检体的靶基因的PCR反应用引物对； 缓冲液；以及 杂交反应用缓冲液。
35.根据权利要求34所述的试剂 盒，其特征在于，上述PCR反应用引物对用于A型流感病毒的基因扩增，上述PCR反应用引物对是具有选自序列号208至序列号211中的碱基序列的寡核苷酸。
36.根据权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，上述PCR反应用引物对用于β-肌动蛋白和EGFR基因的定量型实时PCR，上述PCR反应用引物对分别是具有序列号214及序列号215、序列号217及序列号218的碱基序列的寡核苷酸。
37.根据权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，上述PCR反应用引物对用于SNP检测，上述PCR反应用引物对是具有选自序列号240至序列号257中的两个以上喊基序列的寡核苷酸。
38.根据权利要求34所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒用于疾病的诊断、预防、预测或者对症治疗。
39.一种基因分析方法，其特征在于，包括在权利要求21的DNA微陈列上放置用标记物质来标记的检体的靶核酸，并对上述探针和靶核酸进行杂交的步骤。
40.根据权利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述标记物质是选自包含Cy3、Cy5、Cy5.5、氣砸突、Alexa 488> Alexa 532> Alexa 546> Alexa 568> Alexa 594> Alexa660、罗丹明、TAMRA, FAM、FITC、Fluor X、R0X、德克萨斯红、橙青 488X、橙青 514X、HEX、TET、JOE、牡蛎 556、牡蛎 645、氟硼荧 630/650、氟硼荧 650/665、Calf Iuor Orange 546、Calfluorred 610, Quasar 670及生物素的组中的一个以上的标记物质。
41.根据权利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述靶核酸通过PCR、RT-PCR或者试管内转录方法，用标记物质来标记。
42.根据权利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，还包括如下步骤: 经过上述杂交反应之后，利用荧光扫描机来分析标记物质的信号，来勘察靶核酸的表达程度。
43.根据权利要求42所述的基因分析方法，其特征在于，上述信号分析是通过正态化过程来进行的。
44.根据权利要求43所述的基因分析方法，其特征在于，上述正态化过程是在各点上除外本底的噪声信号，来勘察Cy5和Cy3的信号，重新与作为持家基因的β_肌动蛋白基因的Cy3信号进行比较的三重正态化过程。
45.根据权利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述靶核酸选自包含DNA、RNA、cDNA 及 cRNA 的组中。
46.根据权利要求45所述的基因分析方法，其特征在于， 上述cDNA通过RT-PCT，并用Cy3来标记； 上述cRNA通过试管内转录,并用Cy3来标记。
47.根据权利要求46所述的基因分析方法，其特征在于，在用上述Cy3来标记的cDNA或者cRNA上杂交了混合物，该混合物由用Cy5来标记的作为外部对照物质的大肠杆菌的motD基因混合而成。
全文摘要
本发明涉及在基因型检测及分析时，可通过改善灵敏度、特异度及准确度来广泛用于诊断的，在一个本体内具有两个探针部位的Y型核苷酸探针(probe)及利用该Y型核苷酸探针(probe)的DNA微陈列、试剂盒以及基因分析方法。本Y型探针的结构由左侧探针部分、左侧茎区部分、连接肽(linker)、右侧茎区部分以及右侧探针部分等五种部位形成。本发明的DNA微陈列同时重复检索相同的基因，或者同时检索不同的两个靶基因，由此能够提高检测的准确度。尤其是，在一个点(spot)同时检索靶基因和对照基因，由此在分析时减少错误，并可实现定量分析，还能容易实现标准化。本发明的Y型探针均可利用于基因型分析、基因表达分析、突变或者SNP分析，并且可广泛利用于疾病诊断和预测、治疗决策等基因诊断。
文档编号G01N33/52GK103097533SQ201080066318
公开日2013年5月8日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年2月26日
发明者文宇哲, 吴明烈 申请人:固德基因公司