专利名称：一种多波长组合的指纹图谱检测方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及一种多波长组合的指纹图谱检测方法及其用途， 具体涉及多波长组合的指纹图谱检测方法用于分析中药中复杂成分的用途。
背景技术：
指纹图谱技术是一种常用的分析中药等复杂样品的液相色谱技术，通常采用流动相梯度洗脱和单一的紫外短波长(18(T250 nm)进行液相色谱信号的监测；在实际应用中， 梯度洗脱通常会导致色谱图基线不平稳，短波长紫外检测下收集到色谱峰信号特异性差、 无关峰干扰严重等，以至于无法对特征峰/共有峰进行定性定量分析，因此改进传统的指纹图谱技术是十分必要的。板蓝根为临床常用中药，始载于《神农本草经》，味苦，性寒，具有清热解毒，凉血利咽之功效，用于温毒发斑、舌绛紫暗、痄腮、烂喉丹痧、大头瘟疫、丹毒、痈肿等症。临床上常用于治疗病毒性疾病及细菌感染性疾病，尤其在抗病毒方面疗效确切。目前所用的板蓝根分为两种一种为十字花科植物蒋蓝Isatis indigotica Fort.的根,全国多数地区， 特别北方地区广泛使用，习称“北板蓝”，是《中国药典》(2010版)规定板蓝根的主要来源； 另一种为爵科植物马蓝Strobilanthes cusia ( Nees) O. Ktze的根,华南地区及西南大部分地区习惯应用，习称“南板蓝”。目前板蓝根在临床上应用广泛，常用于流感、腮腺炎、温病发热、发斑、风热感冒、咽喉肿烂、流行性乙型脑炎、肝炎等疾病，尤其在抗病毒方面疗效确切，是公认的广谱天然抗病毒药物。迄今，尚未见全面、合理的针对中药板蓝根中脂溶性部位的分析报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种多波长组合的指纹图谱检测方法及其用途，涉及多波长组合的指纹图谱检测方法用于分析中药中复杂成分的用途。 尤其涉及分析检测中药板蓝根中的中多种成分尤其是脂溶性成分中的用途。本发明采用多波长组合的指纹图谱检测方法能最大化地反映实际检测样品中的多种成份。具体而言，本发明依据多波长检测相结合，拟合出多波长组合指纹图谱检测方法， 对于多产地中药等复杂样品，结合不同产地的多波长组合指纹图谱，进一步拟合出参照指纹图谱。本发明中，尤其建立了测定中药板蓝根中脂溶性成分多波长组合指纹图谱，进一步拟合出板蓝根中脂溶性成分多波长组合参照指纹图谱。本发明的多波长组合的指纹图谱检测方法通过下述步骤实现
(1)取待测复杂样品，进行样品预处理后，微孔滤头过滤，待测；
(2)通过二极管阵列检测器(DAD)，分别分析空白样品(甲醇)和待测复杂样品，结合两者的初级色谱图优化紫外检测波长，初步确定合适的紫外检测波长；(3)在所述的合适紫外检测波长下优化液相色谱条件，包括流动相的组成和梯度洗脱系统、色谱柱型号、柱温、流速；
(4)确定优化后的液相色谱条件，进一步分析空白样品(甲醇)和待测复杂样品，通过两者色谱图的比较，最终确定最佳紫外检测波长及其在不同色谱保留时间段的组合；
(5)采用OriginLabOrigin V8. O计算机软件,依据最佳紫外检测波长及其在不同色谱保留时间段的组合，分别将空白样品(甲醇)和待测复杂样品的原始指纹图谱划分为相应的若干段；
(6)按照色谱保留时间段，将待测复杂样品的原始指纹图谱扣除相同保留时间段的空白样品(甲醇)的指纹图谱，消除色谱条件导致的色谱基线不平稳等现象；
(7)将若干个全新的不同保留时间段的样品指纹图谱进行重新组合，最终拟合得到待测复杂样品的多波长组合的指纹图谱；
(8)针对中药类具有多产地的复杂样品，根据已得到的若干产地的多波长组合的指纹图谱，采用“中药指纹图谱相似度评价软件”进一步地拟合得到一个具有代表性的多波长组合的参照指纹图谱，并运用相似度来评价指纹图谱。本发明的实施例中，将上述多波长组合的指纹图谱用于测定中药板蓝根成份，分析11个产地的板蓝根药材(十字花科植物蒋蓝Isatis indigotica Fort.的根)，得到11 个产地板蓝根样品脂溶性部位多波长组合指纹图谱和拟合的参照指纹图谱，得到24个共有峰，(结果如图I和图2所示)，
其中，
所述的流动相由甲醇和O. 2 %磷酸组成，所述的梯度洗脱为0-10 min A:B从(19:81， v/v)到(35:65， v/v), 10-35 min A:B (35:65， v/v), 35-55 min A:B 从(35:65， v/v) 到(50:50，v/v), 55-85 min A:B 从(50:50，v/v)到(78:22，v/v), 85-110 min A:B (78:22，v/v)；检测波长为 UV 230nm 和 310 nm。结果表明，本发明的多波长组合的指纹图谱方法能有效排除在短波长紫外检测下 (180^250 nm)，液相流动相梯度洗脱出现的基线不平稳、有效成分响应度不理想、无关峰干扰严重等问题，能最大化地反映实际样品中的多种成份；本发明分析中药板蓝根脂溶性部位的多波长组合的指纹图谱，能准确、可靠地反映中药板蓝根脂溶性部位的复杂成分，可用于中药板蓝根脂溶性成分的质量控制。本发明的多波长组合的指纹图谱检测方法还可用于动植物天然提取物、药品、保健食品、饲料以及血浆、尿液、脑脊液、生物组织等等复杂样品的质量分析。
图I为典型的11个产地板蓝根脂溶性部位多波长组合的拟合指纹图谱和拟合的参照指纹图谱(紫外波长230 nm和310 nm)。图2为典型的板蓝根脂溶性部位多波长组合的拟合参照指纹图谱和24个共有峰。
具体实施例方式实施例I :
色谱条件日本HITACHI (L-2130泵，L-2455 DAD 二极管阵列检测器)高效液相色谱仪；色谱柱=YMC C18色谱柱(5 urn, 250mmX4.6 mm);柱温30°C ;流动相甲醇(A)-
0.2% 憐酸(B),梯度洗脱:0-10 min A:B 从(19:81，v/v)到(35:65，v/v), 10-35 min A:B (35:65，v/v), 35-55 min A:B从(35:65，v/v)到(50:50，v/v), 55-85 min A:B从 (50:50，v/v)到(78:22，v/v), 85-110 min A:B (78:22，v/v).流速I. 0 ml ,/min,检测波长230和310 nm,进样量20 μ L。样品制备取3g板蓝根药材粉末(过24目筛)，加入30 mL乙酸乙酯，浸泡30 min 后，90 Hz功率超声提取60 min，三角漏斗负压抽滤，用乙酸乙酯清洗滤纸三遍，合并滤液。 在50°C水浴下，用旋转蒸发仪负压下回收乙酸乙酯，得到干膏，用6 mL甲醇分多次复溶，甲醇溶液过O. 45 μ m微孔滤头，即得待测板蓝根样品溶液。11个产地板蓝根样品脂溶性部位多波长组合指纹图谱通过二极管阵列检测器 (DAD)，分别分析空白样品(甲醇)和板蓝根样品溶液，初步选择230nm，277nm和310 nm作为紫外检测波长；在该波长下优化液相色谱条件，确定色谱条件(包括色谱柱型号、柱温、 流动相和梯度洗脱、流速)。确定以上液相色谱条件后，进一步分析空白样品(甲醇)和板蓝根样品溶液，通过两者色谱图的比较，最终确定230nm和310 nm为最佳紫外检测波长，其中230nm紫外检测波长记录保留时间O 70 min的色谱信号,310 nm紫外检测波长则记录保留时间70 min以后的色谱信号；借用计算机软件拟合，最终得到11个产地板蓝根样品脂溶性部位多波长组合指纹图谱。板蓝根脂溶性部位多波长组合的参照指纹图谱根据11个产地板蓝根的多波长组合的指纹图谱，运用“中药指纹图谱相似度评价软件”拟合得到一个具有代表性的板蓝根脂溶性部位的多波长组合的参照指纹图谱，并运用相似度来评价指纹图谱(结果如表I所示)，确定24个共有峰。表I 11个产地板蓝根脂溶性部位的多波长组合指纹图谱与拟合参照指纹图谱间相似度计算
权利要求
1.一种多波长组合的指纹图谱检测方法，其特征在于，其包括步骤(1)取待测复杂样品，进行样品预处理后，微孔滤头过滤，待测；(2)通过二极管阵列检测器，分别分析空白样品和待测复杂样品，结合初级色谱图，初步确定紫外检测波长；(3)在上述初步确定的紫外检测波长下优化液相色谱条件流动相的组成和梯度洗脱系统、色谱柱型号、柱温、流速；(4)优化后的液相色谱条件进一步分析空白样品和待测复杂样品，通过两者色谱图的比较，再确定紫外检测波长及其在不同色谱保留时间段的组合；(5)采用OriginLabOrigin V8. O计算机软件,依据(4)的紫外检测波长及其在不同色谱保留时间段的组合，分别将空白样品和待测复杂样品的原始指纹图谱划分为相应的若干段;(6)按照(4)的色谱保留时间段，将待测复杂样品的原始指纹图谱扣除相同保留时间段的空白样品的指纹图谱，消除不平稳的色谱基线；(7)将上述制得的不同保留时间段的样品指纹图谱重新组合，拟合得到待测复杂样品的多波长组合的指纹图谱；(8)针对中药类具有多产地的复杂样品，根据已得到的多波长组合的指纹图谱，采用指纹图谱相似度评价软件进一步拟合得到代表性的多波长组合的参照指纹图谱，并评价该指纹图谱的相似度。
2.按权利要求I所述的多波长组合的指纹图谱检测方法，其特征是，所述的流动相由甲醇和O. 2 %磷酸组成，所述的梯度洗脱为0-10 min A:B从(19:81，v/v)到(35:65， v/v), 10-35 min A: B (35:65，v/v), 35-55 min A: B 从(35:65，v/v)到(50:50，v/v), 55-85 min A:B从(50:50，v/v)到(78:22，v/v), 85-110 min A:B (78:22，v/v)；检测波长为 UV 230nm 和 310 nm。
3.按权利要求I所述的多波长组合的指纹图谱检测方法，其特征是，所述步骤(2)、 ⑷、(5)或(6)中的空白样品为甲醇。
4.按权利要求I所述的多波长组合的指纹图谱检测方法，其特征是，所述步骤(6)中的不平稳的色谱基线由色谱条件导致。
5.按权利要求I所述的多波长组合的指纹图谱检测方法，其特征是，所述步骤(8)中的指纹图谱相似度评价软件为中药指纹图谱相似度评价软件。
6.权利要求I所述的多波长组合的指纹图谱检测方法在测定中药板蓝根多种成分中的用途。
7.按权利要求6的用途，其特征是，所述的板蓝根为多个产地的十字花科植物菘蓝的根。
8.权利要求I所述的多波长组合的指纹图谱检测方法在中药板蓝根脂溶性成分的质量控制中的用途。
全文摘要
本发明属分析化学领域，涉及多波长组合的指纹图谱检测方法及用途。本发明采用多波长组合的指纹图谱技术分析中药等复杂样品中的多种成分，能有效排除在短波长紫外检测下，液相流动相梯度洗脱出现的基线不平稳、有效成分响应度不理想、无关峰干扰严重等问题，最大化地反映实际样品中的多种成分；本发明方法用于分析中药板蓝根脂溶性部位的多波长组合的指纹图谱，能准确、可靠地反映中药板蓝根脂溶性部位的复杂成分，可用于中药板蓝根脂溶性成分的质量控制；还可用于动植物天然提取物、药品、保健食品、饲料以及血浆、尿液、脑脊液、生物组织等等复杂样品的质量分析。
文档编号G01N30/86GK102608240SQ20111002432
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月23日 优先权日2011年1月23日
发明者周威, 段更利 申请人:复旦大学