专利名称：检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，涉及一种时间分辨免疫荧光(Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF)检测方法，具体为应用时间分辨免疫荧光方法检测样品中的 Glypican-3蛋白的浓度。人外周血中Glypican-3蛋白浓度的增加与原发性肝癌的发生发展存在密切关联，运用本试剂盒能够对原发性肝癌的发生发展起到诊断作用。
背景技术：
原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位。特别是在乙型肝炎病毒感染的人群中，其发生率相当高。目前诊断上分为影像学诊断和血清学诊断。影像学诊断包括CT、MRI和B超等在内的仪器能够发现最小Icm左右的病灶。而对于影像学不能判断和不能发现的肝脏肿瘤，血清学诊断发挥了特别的优势。目前的血清学诊断包括AFP、γ-谷氨基酰转移同工酶II和异常凝血酶原等，这些检测在特异性和敏感性方面都有待于提高。Glypican-3是硫酸乙酰肝素多糖蛋白-3，它以磷脂酰肌醇糖基形式(GPI)锚定在肝脏细胞膜表面，形成一个球茎样结构，球形部分含有一个核心的CRD结构域，茎部为硫酸乙酰肝素多糖，其C末端以GPI形式锚定于细胞膜上。 Glypican-3具有促进细胞生存和增殖的作用，Glypican-3基因敲除的小鼠其细胞生长、胚胎发育都受到损害。Glypican-3在IGF，FGF, BMP和tot信号转递途径中都发挥着多种作用。Glypican-3在胚胎及胎儿期的肝脏中高度表达，而成人肝脏细胞则不表达。近年来发现，它在原发性肝癌中呈现高表达，其肝癌组织阳性率达到90%，对原发性肝癌具有重要的诊断价值。目前，临床应用的Glypican-3检测方法主要为ELISA方法，但它的灵敏性不够，而且在定量的浓度检测方面缺乏稳定性。Glypican-3在人外周血中的浓度非常低，需要一种高灵敏的方法来检测。时间分辨免疫荧光(Time Resolved Fluoroimmunoassay, TRF)检测方法是一种成熟的免疫分析方法，具有高特异、高灵敏的优点，是在临床医学和检验医学等诸多方面得到十分广泛的应用，是目前取代放射性免疫分析的一种定量检测方法。它的基本原理是利用三价稀土离子(如Eu3+)作为示踪物，延迟检测寿命较长的特异性激发荧光以排除非特异性及背景荧光的干扰，即测定复合物中的稀土离子被激发的延迟荧光强度， 从而确定待测蛋白的浓度。使用荧光增强液的TRF能够检测到皮克(pg，10 —12g/ml)水平的蛋白，因此，本试剂盒采用TRF的方法来检测Glypican-3的浓度，是考虑了多方面的优点。现在国际上还没有报道专门用于检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光方法，也没有相应的试剂盒提供，因此，该试剂盒的开发和应用，是填补了这方面的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏特异的检测样本中Glypican-3蛋白浓度的试剂盒及其制备方法。本发明的目的是通过以下方法实现的在酶标板中用包被抗体包被，封闭后加入待测样品孵育，洗板，加入检测抗体孵育，再次洗板后加入Eu3+标记的链亲和霉素孵育， 然后洗板加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的 Glypican-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。本发明检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒，其包括以下组成
(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mMNaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；
(2)封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；
(3)洗涤液为含0. 05%Tween-20 的 iTris-HCl 缓冲液(TBS)，其成分为 50mM 的 iTris-HCl 缓冲液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；
(4)加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；
(5)荧光增强液(EnhancementSolution)；
(6)检测缓冲液(AssayBuffer)为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，其中含有 1%BSA,l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；
(7)包被抗体为羊抗人Glypican-3 多抗(She 印 Anti-Human Glypican-3 polyantibody)，储存浓度为 1 μ g/μ 1 ；
(8)检测抗体为生物素化的羊抗人Glypican-3多抗(BiotinylatedSheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)，储存浓度为 50ng/μ 1 ；
(9)Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，储存浓度为0. 1 μ g/ μ 1 ；
(10)标准品，重组人Glypican-3 蛋白(Recombinant Human Glypican-3)，浓度为 100 μ g/μ 1。
本发明检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用步骤如下
(1)用PBS 稀释包被抗体一羊抗人 Glypican-3 多抗(She印 Anti-Human Glypican-3 polyantibody)至浓度为4ug/ml,以100 μ 1/孔加入96孔酶标板，4°C过夜；
(2)弃去包被抗体，300μ1/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(3)弃去封闭液，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)弃去样品和标准品，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(5)用加样缓冲液稀释检测抗体一生物素化的羊抗人Glypican-3多抗(Biotinylated Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)至浓度为 75ng/ml，以 100 μ 1/孑Uj口入稀释好的检测抗体，37°C孵育Ih;
(6)弃去检测抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(7)用检测缓冲液(AssayBuffer)稀释Eu3 +标记的链亲和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，终浓度为500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶标板，37°C避光孵育Ih ；
(8)弃去Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗涤液洗涤四次
(9)加入荧光增强液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室温避光缓慢水平摇动 5min ；(10)读板设定激发光波长(Excitationwavelength)为337nm，发射光波长 (Emission wavelength)为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；
(11)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；
(12)通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的Glypican-3的浓度。
本试剂盒采用时间分辨免疫荧光方法来检测样品中的Glypican-3蛋白浓度，其中应用了双抗体夹心法，利用包被抗体一羊抗人Glypican-3多抗(Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)来捕获样品中微量的Glypican-3蛋白，然后用生物素化的羊抗人Glypican-3多抗(Biotinylated Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)来与被捕获的Glypican-3蛋白结合，由于生物素与链亲和霉素能够高亲和力结合，我们用Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3 + -labeled streptavidin)来与生物素化的羊抗人Glypican-3多抗结合，形成三明治样复合结构，样品中的Glypican-3就被Eu3+标记上并固定在酶标板中， 最后应用337nm波长的激发光激发，在发射光波长(Emission wavelength)为615nm处，测定荧光值；然后根据标准曲线来计算Glypican-3的浓度。运用时间分辨免疫荧光方法来高灵敏高特异地检测外周血中的Glypican-3浓度是该试剂盒的一个最显著特色和创新。本发明还具有良好的稳定性，操作时间短，成本低。
图1为检测Glypican-3蛋白浓度的检测标准曲线。
具体实施例方式本发明中的一些术语与缩写GlypiCan-3 硫酸乙酰肝素多糖蛋白_3 ；TRF 时间分辨免疫荧光；BSA 牛血清白蛋白；Tween-20 吐温20 ；Tween-40 吐温40 ；PBS 磷酸盐缓冲液；TBS =Tris-HCl缓冲液；bovine globulin 牛球蛋白；DTPA 二乙烯三胺五乙酸。试剂配方
1.缓冲液
包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；
洗涤液为含0. 05%Tween-20的iTris-HCl缓冲液(TBS)，其成分为50mM的iTris-HCl 缓冲液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；
封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA ； 加样缓冲液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA ；
检测缓冲液为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7. 8)，其中含有1%BSA, l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；
2.标准品蛋白
商品化的重组人Glypican-3蛋白(R&D公司产品) 4.酶标板Nunc八联孔酶标条
本发明运用时间分辨免疫荧光方法来检测样品中的Glypican-3蛋白浓度，其试剂盒的使用步骤如下
(1)用PBS 稀释包被抗体一羊抗人 Glypican-3 多抗(She印 Anti-Human Glypican-3 polyantibody)至浓度为4ug/ml,以100 μ 1/孔加入96孔酶标板，4°C过夜；
(2)弃去包被抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200 μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(3)弃去封闭液，300μ1/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；
(4)弃去样品和标准品，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(5)用加样缓冲液稀释检测抗体一生物素化的羊抗人Glypican-3多抗(Biotinylated Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)至浓度为 75ng/ml，以 100 μ 1/孑Uj口入稀释好的检测抗体，37°C孵育Ih;
(6)弃去检测抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；
(7)用检测缓冲液(AssayBuffer)稀释Eu3 +标记的链亲和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，终浓度为500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶标板，37°C避光孵育Ih ；
(8)弃去Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗涤液洗涤四次
(9)加入荧光增强液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室温避光缓慢水平摇动 5min ；
(10)读板设定激发光波长(Excitationwavelength)为337nm，发射光波长 (Emission wavelength)为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；
(11)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；
(12)通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的Glypican-3的浓度。
权利要求
1.检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于包括以下组成(1)包被缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)，其成分为140mMNaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH 值为 7· 4 ；(2)封闭液为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；(3)洗涤液为含0. 05%Tween-20 的 iTris-HCl 缓冲液(TBS)，其成分为 50mM 的 iTris-HCl 缓冲液(pH 7. 8),0. 05%Tween-20 ；(4)加样缓冲液的成分为含1%BSA的PBS，其成分为PBS，1%BSA；(5)荧光增强液(EnhancementSolution)；(6)检测缓冲液(AssayBuffer)为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)，其中含有 1%BSA,l%bovine globulin,0. 05%Tween 40，DTPA ；(7)包被抗体为羊抗人Glypican-3 多抗(She 印 Anti-Human Glypican-3 polyantibody)，储存浓度为 1 μ g/μ 1 ；(8)检测抗体为生物素化的羊抗人Glypican-3多抗(BiotinylatedSheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)，储存浓度为 50ng/μ 1 ；(9)Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，储存浓度为0. 1 μ g/ μ 1 ；(10)标准品，重组人Glypican-3 蛋白(Recombinant Human Glypican-3)，浓度为 100 μ g/μ 1。
2.如权利要求1所述检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒的使用方法，其特征在于以下步骤(1)用PBS 稀释包被抗体一羊抗人 Glypican-3 多抗(She印 Anti-Human Glypican-3 polyantibody)至浓度为4ug/ml,以100 μ 1/孔加入96孔酶标板，4°C过夜；(2)弃去包被抗体，300μ1/孔洗涤液洗涤三次，加入封闭液200μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(3)弃去封闭液，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次，加入待测培养上清样品和倍比稀释的标准品100μ 1/孔，37°C孵育Ih ；(4)弃去样品和标准品，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；(5)用加样缓冲液稀释检测抗体一生物素化的羊抗人Glypican-3多抗(Biotinylated Sheep Anti-Human Glypican-3 polyantibody)至浓度为 75ng/ml,以 100 μ 1/孑Uj口入稀释好的检测抗体，37°C孵育Ih;(6)弃去检测抗体，300μ 1/孔洗涤液洗涤三次；(7)用检测缓冲液(AssayBuffer)稀释Eu3 +标记的链亲和霉素(Eu3 +-labeled str印tavidin)，终浓度为500ng/ml，以100 μ 1/孔加入酶标板，37°C避光孵育Ih ；(8)弃去Eu3+标记的链亲和霉素(Eu3+-labeled str印tavidin)，300 μ 1/孔洗涤液洗涤四次(9)加入荧光增强液(EnhancementSolution) 200 μ 1/孔，室温避光缓慢水平摇动 5min ；(10)读板设定激发光波长(Excitationwavelength)为337nm，发射光波长 (Emission wavelength)为615nm，延时200微秒测定615nm处的荧光值；(11)利用统计学绘图软件根据测定的值绘制标准曲线；(12)通过标准曲线和未知浓度样品的荧光值计算待测样品中的Glypican-3的浓度。
全文摘要
检测Glypican-3的时间分辨免疫荧光试剂盒。试剂盒包括包被缓冲液；封闭液；洗涤液；加样缓冲液；荧光增强液；检测缓冲液；包被抗体(羊抗人Glypican-3多抗)；检测抗体(生物素化的羊抗人Glypican-3多抗)；Eu3＋标记的链亲和霉素；标准品(重组人Glypican-3蛋白)。其使用包括该试剂盒采用双抗体夹心法和时间分辨免疫荧光原理来检测样品中的Glypican-3蛋白的浓度。在酶标板中包被抗体包被，封闭后加入待测样品孵育，洗板，加入检测抗体孵育，再次洗板后加入Eu3＋标记的链亲和霉素孵育，然后洗板加入荧光增强液，振荡5分钟后用337nm波长光激发，延时200微秒在615nm波长处检测发射荧光值；通过标准品的浓度和相应的荧光值绘制标准曲线，待检样品中的Glypican-3浓度就可以通过它的荧光值并对应标准曲线得到。
文档编号G01N33/68GK102183660SQ20111005624
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者倪润洲, 倪温慨, 肖明兵 申请人:倪润洲, 倪温慨, 肖明兵