专利名称：一种鸡毒支原体间接elisa诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及试剂盒的制备技术领域，具体涉及一种鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒。
背景技术：
目前抗体检测的方法主要有琼脂凝胶免疫扩散实验(AGID)，对流免疫电泳实验 (CIET)，血凝抑制实验(HI)，免疫荧光抗原实验(IFAT)，酶联免疫吸附实验(ELISA)。其中 ELISA是目前研究最多、进展最快的技术，它已广泛应用于临床医学、生物化学、分析化学、 食品分析等领域，但在畜牧业方面的应用，国内目前尚未广泛使用。ELISA的理论基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。琼脂凝胶免疫扩散实验，对流免疫电泳实验容易产生交叉反应，而且分辨率较差， 当有多种抗原抗体系统存在时，形成的沉淀线常重叠，难以分辨清楚；血凝抑制实验敏感性较低；免疫荧光实验结果判定有一定的主观性。目前国产的鸡毒支原体抗体检测试剂盒都是以灭活的鸡毒支原体菌体作为诊断抗原，来建立间接ELISA的检测方法，这种抗原在特异性和敏感性方面还有待于改进；国外目前已有商品化的鸡毒支原体抗体间接ELISA检测试剂盒，但是价格昂贵，临床使用成本相当高，不适合在国内兽医临床广泛推广使用。PvpA蛋白是近年来鉴定的鸡毒支原体有关粘附蛋白，该蛋白有以下几点特征 ①PvpA是一个完整的膜表面蛋白，有一个游离的C-末端；②PvpA拥有一个能被3个截然不同bovis的表面脂蛋白识别的抗原表位；③PvpA表达时能自发高频变异；④PvpA在不同菌株间表现出大小差异；⑤PvpA不是脂蛋白。PvpA大小在48飞5 kD之间，并且推测 PvpA表达与否或者表达的差异都会引起MG的抗原性差异。与其它粘附蛋白一样，PvpA蛋白位于细胞膜表面，很容易被抗粘附素蛋白识别，在鉴别诊断上具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的全菌体诊断抗原中存在的抗原位点杂乱、特异性不强、容易与其它支原体产生交叉反应且敏感性低、检测结果缺乏准确性等问题，提供一种鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，该试剂盒具有种特异性和免疫原性的特点，检测率高，特异性强。本发明另一目的在于提供上述鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
首先进行基因克隆用Primer premier5. 0设计一对特异的引物，引物序列如SEQ ID NO: Γ2所示，引物跨过融合蛋白基因PvpA的高频变异DR-I和DR-2区域；然后进行PCR扩增，扩增产物纯化后连接克隆载体以构建克隆重组子。其次进行重组表达载体的构建将克隆重组质粒和表达载体同时进行双酶切，然后将酶切下来的目的基因插入ΡΕΤ-41 α Τ7 启动子的下游，表达用宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)，将重组质粒PET-PvpA转化大肠杆菌 BL2KDE3)中并筛选高拷贝的重组子，从而构建重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。再次进行蛋白表达与纯化将重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌在IPTG诱导下进行蛋白表达。所表达的蛋白C端附附有His-Tag标签，His能与二价金属离子(如Ni)结合，因而利用此特性可以对重组融合蛋白进行亲和纯化，采用Ni-Agar0se His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，经 Western blot检测，该重组融合蛋白具有良好的反应原性。最后将纯化的重组融合蛋白包被酶标板，建立间接ELISA检测方法。重组抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定将重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释不同梯度后每孔 100 μ L包被于96孔酶标板，4°C过夜，鸡毒支原体标准阴、阳性血清用抗体稀释液倍比稀释组成方阵，结果判定以OD45tlIim值小于0. 20，阳性血清0D45(1nm值在1. 0左右，并且P/N值 (标准阳性血清OD45tlIim/标准阴性血清OD45tlIim)最大时为最适抗原抗体工作浓度。血清最适工作时间的确定以最适稀释度的重组抗原包被96孔酶标板，加入最适稀释度的MG标准阴、阳性血清，将作用时间分别设定为37 0C 30 min、45 min、60 min、90 min, Ρ/Ν值最大时为血清最适作用时间。酶标二抗最适工作浓度及作用时间的确定重组抗原以最适浓度包被与96孔酶标板，加入最适稀释度的MG标准阴、阳性血清。将酶标二抗稀释成不同浓度，每个稀释度分别作用30min、45min、60min、90min，Ρ/Ν值最大时为酶标二抗最适工作浓度及作用时间。 最适封闭液和封闭时间的确定按照上述确定的条件，分别用1% BSA/PBS-T和5%脱脂奶粉/PBS-T作为封闭液，200 μ L/孔37°C封闭2h，以确定合适的封闭液。再用选定的封闭液分别在37°C封闭lh、2h、3h、4h，对封闭时间进行确定。间接ELISA阴阳性临界值的确定， 按上述建立的ELISA方法对30份阴性血清进行检测，记录样本的OD45tlIim值并计算样品S/ P平均值()和标准差(S)。根据统计学原理样品S/P值> +3S时，可判定为阳性；样品S/P值< +2S时，可判定为阴性。S/P=(样品血清OD450 nm值一标准阴性血清OD45tl nm值)/ (标准阳性血清OD450 nm 值一标准阴性血清OD45tl nm值)。所述的包被缓冲液是0. 05M碳酸盐缓冲液，PH9. 6。所述的洗脱缓冲液是含0. 1%吐温20的IOmM PBST, PH7. 4。所述的封闭剂选定为含1%牛血清白蛋白的0. 05M碳酸盐缓冲液，PH9. 6。所述的抗体稀释液是含0. 5%牛血清白蛋白的lOmMPBST，PH7. 4。所述的酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。所述的底物显色液是0. 01%的四甲基联苯胺。所述的终止液是2M硫酸溶液。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明的关键技术点是选用种特异性强的PvpA作为诊断抗原、引物的选择，表达载体的构建，重组融合蛋白的纯化，及间接ELISA方法的优化。引物所扩增基因片段最终翻译成的蛋白要富集多个抗原位点，抗原性比较稳定； 而且扩增的片段要考虑到稀有密码子的问题，如果所扩增的基因片段推到的氨基酸序列以串联形式存在大量大肠杆菌稀有密码子，将会严重影响外源蛋白的表达。本发明选取了 PvpA基因的部分片段进行扩增，经分析，该部分片段翻译成的蛋白抗原位点较多，对其推导的氨基酸序列分析表明还存在着稀有密码子(精氨酸AGA占2. 3%，甘氨酸分别占3. 0%)，但由于这些稀有密码子所占比例很少，且不以串联形式存在，因此对外源蛋白表达产量影响大大降低。表达载体的构建，所插入目的基因的读码框要确保正确，这样才能确保表达的蛋白正确。利用重组重组融合蛋白带有His-Tag标签的特点，采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒可以得到较纯的重组融合蛋白。间接ELISA方法的优化，包括重组抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定， 血清最适工作时间的确定，酶标二抗最适工作浓度及作用时间的确定，最适封闭液和封闭时间的确定，间接ELISA阴阳性临界值的确定。免疫荧光技术是将抗原或抗体与荧光染料连接，用于检测相应特异性的抗体或抗原的方法。这种方法的结果判定需要借助于荧光显微镜，因此在判定上存在一定的主观因素，而且荧光显微镜的价格比较昂贵。本发明是利用鸡毒支原体表面粘附蛋白PvpA具有种特异性和免疫原性的特点， 对粘附蛋白进行表达并纯化，建立一种间接ELISA的检测鸡毒支原体抗体的方法。该方法特异性强，不存在交叉反应，敏感性高，诊断准确，并且生产成本相对较低。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1鸡毒支原体间接ELISA抗体检测试剂盒
组成如下重组融合蛋白包被的酶标板，抗体稀释液是含0. 5%牛血清白蛋白的 IOmMPBST, PH7. 4，洗脱缓冲液是含0. 1%吐温20的lOmMPBST，PH7. 4，酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG，底物显色液是0. 01%的四甲基联苯胺，终止液是2M硫酸溶液。实施例2鸡毒支原体间接ELISA抗体检测试剂盒的制备重组融合蛋白的表达与纯化
融合蛋白基因PvpA插入质粒ΡΕΤ-41 α Τ7启动子的下游，表达用宿主菌为大肠杆菌 BL21 (DE3)，将重组质粒PET-PvpA转化大肠杆菌BL21 (DE3)中并筛选高拷贝的重组子，从而构建重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。对上述重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌进行诱导表达，所用培养基为含25μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基。诱导表达条件是28°C，IPTG 终浓度为1. Ommo 1/L,诱导时间5h。所得菌液于4°C，9000r/min离心15min，弃上清，用结合缓冲液重选上述菌体沉淀，加入终浓度为lmg/ml的溶菌酶，冰浴30min。冰浴超声破碎菌体，超声破碎方式400W功率，超声破碎时间4s，间隔时间6s，超声20min。超声裂解后， 40C 9000r/min离心25min，分别收集上清液和沉淀，沉淀用含8mol/L尿素的结合缓冲液溶解，然后4°C 9000r/min离心25min，收集上清。将两次收集的上清液过0. 45 μ m滤膜，上 Ni-Agarose His柱子进行纯化，将纯化后的重组融合蛋白进行浓缩于_80°C保存备用。重组融合蛋白最适包被浓度和血清最适稀释度的确定。最适封闭液和最适封闭时间的确定。血清最适工作时间的确定。酶标二抗最适工作浓度及最适作用时间的确定。间接ELISA阴阳性临界值的确定。重组融合蛋白包被的酶标板，抗体稀释液，洗脱缓冲液，酶标二抗，底物显色液，终止液共同构成试剂盒。实施例3鸡毒支原体间接ELISA抗体检测试剂盒的使用方法
1.将试剂盒中已包被抗原的酶标板和各种溶液置于常温下回温
2.加样用抗体稀释液按一定倍数稀释待检血清后每孔加入 οομ1，标准阴、阳性血清作为对照，将酶标板置于常温或37°C作用lh，然后甩干，每孔加300 μ 1洗脱缓冲液洗 3 5次。3.加酶标二抗每孔加稀释好的酶标二抗100μ 1，将酶标板置于常温或37°C作用 lh，然后甩干，每孔加300 μ 1洗脱缓冲液洗3 5次。4.加显色液每孔加入TMB显色液100 μ 1，将酶标板室温避光IOmn。5.加终止液每孔加入硫酸终止液100 μ 1。6.测OD值将酶标板放入酶联检测仪测定各孔0D450nm值。
权利要求
1.一种鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括如下组分种特异性蛋白PvpA包被的酶标板、包被缓冲液、洗脱缓冲液、封闭剂、抗体稀释液、酶标二抗、 底物显色液和终止液；其中，所述种特异性蛋白PVPA是由如下方法制备得到设计引物序列如SEQ ID NO:广2所示，提取鸡毒支原体基因组进行DNA扩增，将PCR产物纯化后连接克隆载体以构建克隆重组质粒，再与表达载体同时进行双酶切，酶切得到的目的基因插入 ΡΕΤ-41 α Τ7启动子的下游，表达用宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)，将重组质粒PET-PvpA转化大肠杆菌BL21(DE3)中并筛选高拷贝的重组子，从而构建重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌，将重组大肠杆菌BL21(DE3)工程菌在IPTG诱导下进行蛋白表达，经纯化，得到种特异性蛋白PvpA。
2.根据权利要求1所述的鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述抗体稀释液是含0. 5%牛血清白蛋白的lOmMPBST、PH7. 4。
3.根据权利要求1所述的鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述洗脱缓冲液是含0. 1%吐温20的lOmMPBST，PH7. 4。
4.根据权利要求1所述的鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述酶标二抗是辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG。
5.根据权利要求1所述的鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述底物显色液是0.01%的四甲基联苯胺。
6.根据权利要求1所述的鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于所述终止液是2M硫酸溶液。
全文摘要
本发明公开了一种鸡毒支原体间接ELISA诊断试剂盒，该试剂盒包括种特异性蛋白PvpA包被的酶标板、洗脱缓冲液、抗体稀释液、酶标二抗、底物显色液和终止液。本发明试剂盒选用种特异性蛋白PvpA，涵盖PvpA蛋白高频变异区DR-1和DR-2区域，具有高特异性和免疫原性，提高了检测结果的特异性和敏感性，降低了生产成本，适合在基层兽医机构推广使用。
文档编号G01N33/535GK102221616SQ201110094758
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者刘雅红, 周云雷, 曾振灵, 沈祥广, 蒋红霞, 陈杖榴 申请人:华南农业大学