专利名称：凉粉草药材指纹图谱的建立及其指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药药材的质量控制方法，具体涉及凉粉草药材高效液相色谱法指纹图谱的构建方法和标准指纹图谱。
背景技术：
凉粉草(Mesonei Blume)又名仙人草、仙草、仙人冻、薪草，为唇形科仙草属一年生草本植物，目前中国有 3 种，分别为i/· chinensisBenth，Μ. paruifsota (Benth)Brea, Μ. procum-bens Hemsl，分布于我国的广东、福建、广西、江西、海南、浙江、台湾和云南等地，其他国家如印度、印度尼西亚、马来西亚也有分布。凉粉草可入药，据《本草求原》记载，凉粉草清暑热，解藏府结热毒，治酒风。可治中暑、关节炎、高血压、糖尿病、急性传染性肝炎、痢疾、腹泻、结合膜炎等症。凉粉草也可作为食品工业的原材料，如凉粉草的茎、叶加水煎汁可制成凉粉冻，以凉粉草为原料制成各种饮料，还可从凉粉草中提取凉粉草胶、绿色素等。总之，凉粉草的应用极为广泛。然而，在凉粉草药材质量控制方面，目前为止没有一种能全面表征凉粉草药材质量的方法。因此，为了使凉粉草能够进一步的得到充分利用，规范凉粉草药材的质量标准， 保证凉粉草药材的质量，解决凉粉草药材质量参差不齐的问题，对凉粉草药材的质量控制方法有待于开发建立。
发明内容
本发明的目的为凉粉草药材的质量控制和真伪鉴别提供一个新的方法，通过建立凉粉草药材指纹图谱的方法，并由此方法得到凉粉草药材共有模式的指纹图谱。为达到本发明的目的所采用的技术方案用高效液相色谱法建立凉粉草药材指纹图谱的方法，具体包括如下步骤
①、对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品，用甲醇配制成每ImL含咖啡酸0.2 0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；
②、供试品溶液的制备精密称取凉粉草药材粗粉，加入50%乙醇回流提取，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液；
③、色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液；紫外检测波长为300 360nm ；
④、测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。进一步优选的方法可以通过下述步骤实施
①、对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品，用甲醇配制成每ImL含咖啡酸0.2 0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；
②、供试品溶液的制备精密称取凉粉草药材粗粉(二号筛)1.0 5. Og,置于100 500mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 250mL，密塞，称定重量，于100°C水浴中回流1小时，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液；
③、色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为 1. 0% 3. 0%甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液；柱温20 40°C ；紫外检测波长为300 360nm ；流速0. 5 1. 2mL · mirT1 ；时间90min 120min ；
④、测定精密吸取供试品溶液10 20μ L注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明最佳的检测方法可以通过下述步骤实施
步骤②供试品溶液的制备精密称取凉粉草药材粗粉(二号筛)l.og，置于IOOmL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，称定重量，于100°C水浴中回流1小时，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液适量，以0. 22 μ m微孔滤膜滤过， 即得供试品溶液；③、色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为1甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液，柱温25°C ；检测波长为320nm ；流速为0. SmL · mirT1 ；分析时间为 95min。在步骤③中，所述的梯度洗脱，优选梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行 0分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液、流动相B为90%的21的甲酸溶液；
18分钟时，流动相A为16. 5%的乙腈溶液、流动相B为83. 5%的m的甲酸溶液； 25分钟时，流动相A为16. 5%的乙腈溶液、流动相B为83. 5%的m的甲酸溶液； 60分钟时，流动相A为24%的乙腈溶液、流动相B为76%的m的甲酸溶液； 65分钟时，流动相A为34%的乙腈溶液、流动相B为66%的m的甲酸溶液； 80分钟时，流动相A为45%的乙腈溶液、流动相B为55%的m的甲酸溶液； 90分钟时，流动相A为60%的乙腈溶液、流动相B为40%的m的甲酸溶液； 95分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液、流动相B为90%的m的甲酸溶液。具体见下表
权利要求
1.一种凉粉草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于采用高效液相色谱法，具体包括如下步骤①、对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品，用甲醇配制成每ImL含咖啡酸0.2 0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；②、供试品溶液的制备精密称取凉粉草药材粗粉，加入50%乙醇回流提取，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液；③、色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为300 360nm ；④、测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种凉粉草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述步骤②供试品溶液的制备，采用精密称取凉粉草药材粗粉1. 0 5. Og,置于100 500mL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 250mL，密塞，称定重量，于100°C水浴中回流1小时，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液；所述步骤③色谱条件，采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为1. 0% 3. 0%甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液；柱温20 40°C ；紫外检测波长为 300 360nm ；流速0. 5 1. 2mL · mirT1 ；时间90min 120min ；所述步骤④测定，采用精密吸取供试品溶液10 20 μ L注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
3.根据权利要求1所述的一种凉粉草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述步骤②供试品溶液的制备，采用精密称取凉粉草药材粗粉1. 0g，置于IOOmL具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50mL，密塞，称定重量，于100°C水浴中回流1小时，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液适量，以0. 22 μ m微孔滤膜滤过， 即得供试品溶液；所述步骤③色谱条件中流动相为2、甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液，柱温25°C ；检测波长为320nm ；流速为0. 8mL · mirT1 ；分析时间为95min。
4.根据权利要求2或3所述的一种凉粉草药材指纹图谱的建立方法，其特征在于 所述步骤③色谱条件中所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如下体积浓度配置进行 0分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液、流动相B为90%的21的甲酸溶液；18分钟时，流动相A为16. 5%的乙腈溶液、流动相B为83. 5%的m的甲酸溶液； 25分钟时，流动相A为16. 5%的乙腈溶液、流动相B为83. 5%的m的甲酸溶液； 60分钟时，流动相A为24%的乙腈溶液、流动相B为76%的m的甲酸溶液； 65分钟时，流动相A为34%的乙腈溶液、流动相B为66%的m的甲酸溶液； 80分钟时，流动相A为45%的乙腈溶液、流动相B为55%的m的甲酸溶液； 90分钟时，流动相A为60%的乙腈溶液、流动相B为40%的m的甲酸溶液； 95分钟时，流动相A为10%的乙腈溶液、流动相B为90%的m的甲酸溶液。
5.一种凉粉草药材的指纹图谱，其特征在于凉粉草药材指的纹图谱的建立，具体包括如下步骤①、对照品溶液的制备精密称取咖啡酸对照品，用甲醇配制成每ImL含咖啡酸0.2 0. 5mg的溶液，作为对照品溶液；②、供试品溶液的制备精密称取凉粉草药材粗粉，加入50%乙醇回流提取，滤过，取续滤液适量滤膜滤过，即得供试品溶液；③、色谱条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相为甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液，紫外检测波长为300 360nm ；④、测定精密吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；所述指纹图谱中有10个特征共有峰，其中1号色谱峰为咖啡酸参照峰，最强峰为7号色谱峰，图谱总长度为90min，具体如下1号峰，平均保留时间RT为15. 58min，RSD为0. 03%,峰面积为448. 251，RSD为57. 12% ； 2号峰，平均保留时间RT为27. 63min, RSD为0. 03%,峰面积为968. 365，RSD为41. 74% ； 3号峰，平均保留时间RT为29. 27min, RSD为0. 03%,峰面积为209. 201，RSD为44. 44% ； 4号峰，平均保留时间RT为34. 67min，RSD为0. 03%,峰面积为831. 631，RSD为67. 58% ； 5号峰，平均保留时间RT为38. 77min，RSD为0. 02%,峰面积为551. 551，RSD为40. 45% ； 6号峰，平均保留时间RT为43. 75min, RSD为0. 03%,峰面积为1946. 438，RSD为 40. 97% ；7号峰，平均保留时间RT为48. 02min, RSD为0. 02%,峰面积为2观3. 524，RSD为 57. 81% ；8号峰，平均保留时间RT为51. 03min,RSD为0. 02%,峰面积为637. 764，RSD为41. 03% ； 9号峰，平均保留时间RT为58. 26min，RSD为0. 02%,峰面积为815. 393，RSD为41. 34% ； 10号峰，平均保留时间RT为69. 94min，RSD为0. 00%，峰面积为307. 076，RSD为46. 52%。
全文摘要
本发明公开了一种凉粉草药材指纹图谱的建立及其指纹图谱，涉及中药药材的质量控制方法，具体是建立HPLC指纹图谱以检测凉粉草药材提取液的方法。本发明步骤为，先对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相为1.0%～3.0%甲酸与乙腈组成的梯度洗脱液，柱温20～40℃，紫外检测波长为300～360nm，时间90min～120min；高效液相色谱法测得指纹图谱。本发明的有益效果能有效表征凉粉草药材的质量，有利于监控药材的质量；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可快速、准确地鉴别药材的真伪优劣。
文档编号G01N30/14GK102269748SQ20111009452
公开日2011年12月7日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者丁婕, 赖小平, 黄松 申请人:东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院