专利名称：一种抗常用苏云金芽孢杆菌CryI单克隆抗体杂交瘤的制备方法及其单克隆抗体的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可以与转基因植物中外源基因表达蛋白结合的抗体及其杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗转基因植物中常见的苏云金芽抱杆菌CryI蛋白的单克隆抗体，可用于制备检测转基因植物中常见的CryI蛋白的试剂盒，属于生物检测领域。
背景技术：
苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis)简称Bt,属于革兰氏阳性土壤杆菌，广泛分布于土壤、尘埃、水域、沙漠、植被、昆虫尸体中。在芽孢形成过程中，苏云金芽抱杆菌可以产生大量的伴胞晶体，由具有高度特异性杀虫活性的结晶蛋白组成。这种蛋白质通常被称为杀虫晶体蛋白(ICP)或δ-内毒素。ICP通常以原毒素的形式存在，在昆虫中肠碱性环境下，原毒素被降解成60kDa左右的片段并和受体结合。结合于受体的蛋白质随之插入到细胞膜上并形成穿孔，使细胞膜周质和膜腔的离子平衡被破坏，引起细胞肿胀甚至破裂，从而导致昆虫的死亡。Bt杀虫晶体蛋白的选择杀虫特性是由昆虫消化道上皮细胞表面的特异性受体决定的。由于Bt菌所产生的蛋白具有杀虫能力，人们经培养Bt菌生产出一种微生物制剂一Bt杀虫剂。Bt杀虫剂其杀虫效果好，对人畜安全，对天敌无伤害，且较难产生抗药性，已被广泛应用于防治农作物害虫方面。随着Bt杀虫剂的不断运用和发展，以Bt基因为外源基因培育新的具有自身抗虫性的植物的基因工程技术相继兴起。随着转Bt基因植物的不断发展及其商品化的种类不断增加，转基因生物本身的安全性以及它们对人类健康和生态环境的潜在威胁成为国际社会和广大民众广泛关注的热点问题之一。包括我国在内的越来越多的国家制定并实施了转基因食品的强制标识制度。因此，转基因产品的科学管理和应用需要得到转基因产品及其成分检测技术的支持。目前，转基因产品及成分检测最常用的方法有两类一类是针对其外源核酸成分的检测技术；另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法。基于DNA的检测方法只能在核酸水平上反映转基因样品是否含有外源DNA，不能检测其外源基因是处于沉默还是表达，该检测技术对转Bt的抗性高低并无指导性意义。对于某些转基因植物的产品，DNA在加工过程中会降解掉而难以检测，此时，需要利用酶联免疫分析法来检测转基因的组分。基于外源蛋白的免疫学分析方法，采用高度特异性的抗原抗体反应，实现对转基因植物样本快速、准确、高效的检测，其技术关键是制备具有高度特异性的抗体。用于转基因的Bt ICP基因主要是CryI家族的基因，其中最常用的是CrylAb、CrylAc、CrylAh、CrylC和CrylA (由CrylAb前半段和CrylAc后半段组成的融合蛋白)。虽然带有CrylAh和CrylC转基因的品种目前还未在中国得到释放，但将来有可能释放，国外的也有可能流入。国内外文献报道中的Bt抗体，无论是多抗还是单抗，基本上只识别单一的Bt CryI基因，不能同时识别在转基因植物中各种常见的Bt CryI基因，只能用于检测单一 CryI基因的转基因事件。如专利号申请号为00510130058. 9的专利中的抗体只针对CrylA中的一段16氨基酸残基的多肽，目的是为了特异识别CrylA蛋白。我们经过序列比对发现，该段多肽序列也仅出现在CrylAb和CrylAc中，在CrylAh及CrylC中存在序列差异，据此制备的抗体将不能识别CrylAh及CrylC。其他以完整重组CrylAb蛋白为免疫原制备出的单克隆抗体，事先并未以识别多种毒素蛋白作为设计依据，也未对其抗原表位进行确认，因此其识别多种毒素蛋白的能力无法确认(张霄，纪炜，王耘，温爽，刘贤进，间接ELISA法检测苏云金芽孢杆菌(Bt) CrylAb毒蛋白抗体方法的建立，南京农业学报，2010，26 (4))。如果能够制备针对转基因植物常见Bt CryI蛋白的广谱单克隆抗体，就可以利用一个试剂检测多种CryI基因的转基因事件，从而大大节约检测成本。
发明内容
本发明的第一个目的是提供 一种能针对转基因植物中常见的Bt CryI蛋白的广谱单克隆抗体杂交瘤及其制备方法。本发明的第二个目的是提供一种特异性好的单克隆抗体的制备方法，该抗体能特异结合 Bt 重组抗原 Cry 1A、CryIAa> CrylAb、CryIAc> CryIAh> CrylC 和天然抗原。本发明的第三个目的是提供一种可以用于实验室或田间检测农作物叶片中是否带有常见Bt CryI基因的检测试剂。解决技术问题所采用的技术手段本发明对转基因植物中常用的Bt ICP基因CrylAb、CrylAc、CrylAh、Crylc和CrylA的抗原表位分析后，选择既有免疫原性又同源的13个氨基酸残基作为合成多肽的序列。将合成的多肽与载体蛋白偶联作为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、重组CrylA筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备,Protein A/G柱亲和层析纯化腹水,获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定其亚类和亲和常数。用免疫印记(WB)实验检测该抗体特异识别重组及转基因水稻中的CryI蛋白的能力。具体地，本发明涉及以下几个方面I. 一种单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CGMCC 4856的小鼠杂交瘤细胞系70647s-9 产生。2.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No 1的氣基酸残基序列的多妝与载体蛋白偶联得到。3.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。4.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其识别多种重组苏云金芽抱杆菌CryI蛋白。5.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其用于免疫印迹，酶联免疫检测转基因植物(水稻、棉花、玉米等)中的CryI蛋白。6.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于可以作为检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。7. 一种小鼠杂交瘤细胞系70647S-9，保藏号为CGMCC 4856，其特征在于能稳定分泌权利要求I所述的单克隆抗体。本发明的优点及有益效果
(I)本发明获得的杂交瘤(70647S-9，保臧号为CGMCC 4856)分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白CrylAb、CryIAc> CryIAh> CrylC和CrylA,具有检测多种常见转基因Bt CryI蛋白的特性，较之识别单一 Bt CryI基因的抗体具有更广的用途。(2)本发明获得的杂交瘤(70647S-9，保藏号为CGMCC 4856)产生的单克隆抗体与从转基因水稻叶片的蛋白提取物中的CryI蛋白的结合有极强特异性和敏感性。(3)本发明获得的杂交瘤(70647S-9，保藏号为CGMCC 4856)产生的单克隆抗体可应用于免疫印记(Western blotting)、双抗体夹心ELISA、间接ELISA、抗体芯片制备等转基因植物的检测与筛查，特异性和灵敏度高，具有很高的使用价值。
图I :常用Bt CryI基因的序列比对 图2 70647-S9对重组CrylAb、CrylAc和CrylA蛋白的WB检测结果图3 70647-S9对转基因水稻的Western Blot检测结果
具体实施例方式下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。实施例I免疫抗原的制备利用软件分析Cry I Aa、CrylAb、Cry I Ac、Cry I Ah、CrylC 和 CrylA 蛋白序列，结合其同源性(图I)、抗原性、亲水性、表面可及性及二级结构，选择其中既具有免疫原性又具有序列同源性的12个氨基酸残基(见序列表中SEQ IDNo 1)组成的多肽片段，用固相合成法合成，并用马来酰亚胺法与载体蛋白进行偶联。具体步骤如下将10mg/ml 的 sulfo-GMBS (PIERCE 公司)和 10mg/ml 的 mcKLH(Thermo-Fisher 公司)以I : 5的比例混合,室温下置于摇床上缓慢摇勻30min后，12000rpm离心5min。取上清，经s印hadex G-25Fine (GE公司)分离收集活化好的载体蛋白质KLH_suIfo-GMBS，以等质量比滴加到10mg/ml的多肽溶液中，在室温下旋转混匀3h(或4°C旋转过夜)即可。实施例2重组CrylA蛋白的制备—、基因克隆将编码CrylA的基因序列(GenBank ACF32736. I)人工合成基因后，通过PCR的方法在该融合蛋白基因的5’和3’端分别加入NcoI和BamHI酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体PET-BPI进行NcoI和BamHI酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取平板上的克隆接种，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。PCR显示融合蛋白基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于表达重组的CrylA蛋白。二、蛋白表达和纯化按I : 100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至IOOml LB培养基，加入终浓度为50 μ g/ml的卡那霉素，37°C振荡培养至OD600为O. 6 O. 8。加入O. lmol/L的IPTG，25°C震荡培养8h，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用Ni柱进行蛋白质的亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样进行SDS-PAGE分离检测，重组CrylA蛋白的纯度在90%以上，浓度约为1-1. 5mg/mL，可以满足抗体筛选和鉴定的要求。实施例3杂交瘤细胞系的建立一、免疫将实施例I中偶联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4_6周龄雌性Balb/c小鼠(由军事医学科学院提供)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60yg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30 μ g/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μ g/只。二、细胞融合 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 (ATCC)以5 I比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37°C水浴中，在I分钟内缓慢加入Iml的PEG1500(ROche公司)，并搅动细胞。在温水中静置Imin后，加入IOml无血清的IMDM (Sigma公司),混勻，离心IOOOrpm, 5min。弃上清后，加入IOml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合IOxHAT (Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2. 1%硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37。°C 5% CO2培养箱中培养。三、挑克隆融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37°C 5% CO2培养箱中培养。四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100 μ I上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200 μ I含饲养细胞和I % HT (Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100 μ I上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。实施例4腹水诱生法制备单克隆抗体一、腹水制备对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数 5X105，lml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4°C离心4000rpm，IOmin。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4°C或-20°C保存。二、单克隆抗体的纯化用HiTrap rProteinAFF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于_20°C。实施例5单克隆抗体特性鉴定一、亚类鉴定用IOOmM PBS (pH7. 4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至O. 5μ g/ml，每孔加100μ 1，4°C，过夜。倾空液体，用含O. 05% Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200 μ I封闭液(含2% BSA和3%蔗糖的PBS)，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入O. Iml杂交瘤上清，37°C孵育lh。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液I : 1000稀释HRP标记的羊抗鼠(K，λ )抗体或I : 2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM, IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA)抗体(Southern Biotech 公司)0. Iml每孔分别加入适当的孔中，37°C孵育lh。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含
O.15% ABTS(SouthernBiotech公司)和O. 03% H2O2的柠檬酸缓冲液(ΡΗ4. O)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。二、亲和常数测定包被合成多肽，包被浓度为2 μ g/ml, 100 μ I/孔，4°C包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200 μ I封闭液37°C封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从I : 200开始2倍梯度稀释，最后I孔留空白对照，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗I 20000稀释，每孔100 μ 1，37°C孵育lh，PBS-T洗3次。每孔加入100 μ I含O. I % TMB (Sigma公司)和O. 03% H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色IOmin,加50 μ I O. 5Μ硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出彡1/2 “平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为3. 8X109。
亲和常数《 150000xA
抗体原始浓度三、单抗反应特异性选择Bt重组CrylAb、CrylAc、CrylA蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性。免疫印迹实验过程如下每种蛋白上样约lOOng，进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4°C过夜。加入单克隆抗体70647-S9(l 1000稀释)4°C孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入I 5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育I小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(普利莱公司)，用ImageQuant ECL仪器(GE公司)捕获显色图像。图2显示的是单克隆抗体70647-S9对重组蛋白的免疫印记结果。该抗体可以识别CrylAb、CryIAc> CrylA蛋白，而不识别其他无关重组蛋白。实施例6本发明单克隆抗体的应用效果从转基因和非转基因水稻叶片中提取蛋白，用实施例5中所述的免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体在检测转基因植物中的应用效果。图3显示的是单克隆抗体70647-S9对转基因水稻的免疫印记结果。该抗体可以检测经100倍稀释的转基因水稻叶片蛋白提取物，而对非转基因水稻没有检出，检出的特异性和灵敏度都很高。
权利要求
1.一种单克隆抗体，其特征在于由保藏号为CGMCC 4856的小鼠杂交瘤细胞系70647s-9 产生。
2.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No 1的氣基酸残基序列的多妝与载体蛋白偶联得到。
3.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。
4.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其识别多种重组苏云金芽抱杆菌CryI蛋白。
5.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于其用于免疫印迹，酶联免疫检测转基因植物(水稻、棉花、玉米等)中的CryI蛋白。
6.权利要求I所述的单克隆抗体，其特征在于可以作为检测试剂用于转基因植物检测试剂盒的制备。
7.一种小鼠杂交瘤细胞系70647S-9，保藏号为CGMCC 4856，其特征在于能稳定分泌权利要求I所述的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及一种针对转基因中常见苏云金芽抱杆菌(Bt)CryI蛋白的广谱单克隆抗体及其制备方法，目的是提供一种新的可以检测天然转基因植物(水稻、棉花、玉米等)中是否存在Bt蛋白的单克隆抗体。制备该单克隆抗体的专用抗原，是根据常见Bt CryI蛋白的氨基酸序列设计的多肽与载体蛋白偶联得到的。该单克隆抗体的亚型为IgG2a，亲和常数达到3.84×109。该单克隆抗体能识别CryI家族中的多个蛋白，可用于多种BT CryI蛋白的检测。本发明还提供了分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞系70647s-9，保藏号为CGMCC No.4856。该细胞系能够稳定分泌高效价的该单克隆抗体。
文档编号G01N33/577GK102816235SQ201110128699
公开日2012年12月12日 申请日期2011年5月18日 优先权日2011年5月18日
发明者尹长城, 刘国振, 吴 琳, 刘斯奇, 郝育杰, 邓汉超, 韦汉福, 潘秦 申请人:北京华大蛋白质研发中心有限公司