专利名称：一种酶信号循环放大高灵敏免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及免疫检测技术领域，特别涉及一种基于酶信号循环放大超灵敏免疫检测方法，属于酶联免疫(ELISA)技术领域。
背景技术：
酶联免疫(ELISA)技术是现代免疫分析中较为重要的一项技术，尤其是基于ELISA技术的各种类型的初筛试剂盒在临床检验、食品安全领域得到广泛的应用。这项检测技术中有3项必要的试剂①固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法，如双抗体夹心测抗原、双抗原夹心测抗体、间接法测抗体、竞争法等模式。ELISA技术检测不同的项目，其检测灵敏度和相应的抗原及抗体有着紧密联系，而随着检验检疫要求越 来越严格，对方法灵敏度的要求越来越高，而基于传统的ELISA技术在灵敏度方面往往提闻空间有限，也只能依赖提闻抗原抗体的未和力，从而间接提闻其检测灵敏度。
发明内容
针对当前ELISA技术发展趋势的需求如何有效的提供其检测灵敏度，本发明所要解决的技术问题就是在原有的ELISA检测体系基础之上，进行创新型设计以获得更高的检测灵敏度。本发明的创新主要在于在原有的ELISA检测体系中引入“抗酶抗体-酶标记复合物”如兔抗辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)多抗-HRP复合物,兔抗HRP-碱性磷酸酶(Alkaline phosohatase, AP)复合物等，以达到更高的检测灵敏度。本发明的目的在于提供一种基于酶信号循环信号放大的ELISA检测系统。本发明的另一目的在于提供一类“抗酶抗体-酶标记物”制备方法及其应用于传统ELISA技术中。本发明的再一目的是利用一类“抗酶抗体-酶标记物”实现传统ELISA中酶信号的循环放大，从而提高检测灵敏度。本发明的目的通过以下技术方案实现一类抗酶抗体-酶标记物的制备并应用于传统ELISA技术中。针对HRP显色体系，制备抗HRP多抗-HRP复合物；针对AP显色体系，制备抗AP多抗-AP复合物；也可能制备其他类型显色酶抗体酶标复合物及其不同类型显色酶抗体-酶交叉制备的复合物，此类复合物能够实现酶信号的循环放大，提供传统ELISA检测体系的灵敏度，本说明书以HRP为例进行来描述本发明的设计模型。本发明的技术方案是首先通过多抗制备技术获得抗HRP多抗，并与一定量的HRP进行亲和反应形成抗HRP多抗-HRP复合物。选取某一 ELISA检测模型如双抗夹心检测HBsAg建立基于酶信号循环放大的新型ELISA检测体系。上述抗HRP多抗-HRP复合物的制备流程及检测系统构建具体可以包括下述步骤
(I )、用纯化的HRP免疫兔，得到含有抗HRP抗体的兔血清；先用(NH4) 2S04沉淀法从兔的血清中初步纯化免疫球蛋白IgG,再用ProteinA-Sepharose亲和层析柱进一步纯化抗HRP的IgG, SDS-PAGE及Western blotting鉴定分离纯化的抗HRP多抗；(2)、取上述纯化后的抗HRP多抗，加入一定量的HRP形成不饱和的抗HRP多抗-HRP复合物，此复合物不仅具有HRP酶活性，而且仍然具有与HRP酶反应的活性位点；(3)、应用举例I :双抗夹心法检测乙肝表面抗原(HBsAg)的基础之上，引入抗HRP多抗-HRP复合物，在ELISA显色步骤之前加入上述抗HRP多抗-HRP复合物反应30min后进行洗涤，再进行酶显色步骤；(4)、应用举例2 :间接法测口蹄疫病毒(FMDV)抗体ELISA试剂盒基础之上，引入抗HRP多抗-HRP复合物，在ELISA显色步骤之前加入上述抗HRP多抗-HRP复合物反应30min后进行洗涤，再进行酶显色步骤。本发明提供了抗HRP多抗-HRP复合物的制备方法，该复合物能够用于ELISA检测体系中，形成基于酶信号循环放大免疫检测系统，能够远远的提高检测的灵敏度。
图I酶信号循环放大应用实例I-双抗体夹心ELISA模式。图2酶信号循环放大应用实例2-间接法测抗体ELISA模式。
具体实施例方式实施例是对本发明所提供的抗HRP多抗-HRP复合物的制备及应用到酶信号循环放大系统应用举例的进一步说明，但发明的实施方式不限于此，对于其他方式的ELISA，该发明策略同样适用。实施例I抗HRP多抗-HRP复合物的制备 (O油包水抗原乳化剂的制备
用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂I. 2mL混合2 mg纯化HRP，用匀浆器混合2小时，将制好的乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中，若一滴乳化剂状态完整地停留在水面上，而不扩散，表明形成稳定的油包水抗原乳化剂。(2)免疫新西兰大白兔
选取4周大的，体重约I. 5Kg的健康新西兰大白兔2只。先将新西兰大白兔背部的毛小心剪去，然后取600 μ L制备好的油包水抗原乳化剂，用微量注射器多位点地进行皮下注射，一只动物背部两侧注射总数约为8 10点，使抗原能缓慢扩散，每隔Γ2周免疫一次，观察注射点是否红肿，如果糜烂可用紫药水收干。在免疫3-4次后，从兔子的耳缘静脉抽血约lmL，离心IOmin后，得血清可进行效价鉴定。共进行6次免疫，在末次免疫后5天后采用颈动脉放血法取血。(3)颈动脉放血法
在大白兔颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离(连同与之同行的迷走神经)，用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端钳住，插入输血针管，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即通过输血针管流入瓶中。采用室温自然凝固分离抗血清，然后放置37°C I小时,再4°C过夜，待凝块收缩，4000rpm离心15分钟，收集上清。
(4)抗血清的纯化
饱和硫酸铵溶液取500ml蒸馏水加热至70 80°C，将400g硫酸铵溶于其中，搅拌20min，冷却。待硫酸铵结晶沉于瓶底,其上清即为饱和硫酸铵。在使用前用28%氨水调PH7. O。用55%饱和硫酸铵提取血清I份加生理盐水I份混匀，然后逐滴加入饱和硫酸铵2份中，边加边搅拌，防止形成团块降低沉淀物的特异性.混匀后静置30min或置4°C冰箱过夜。低温高速10 000/min离心IOmin,将上清液(含白蛋白)弃去，取沉淀物(含球蛋白)溶于少量生理盐水中。用33%饱和硫酸铵提取将上述提取物生理盐水溶液2份加I份饱和硫酸铵。然后再10 000/min离心，其余操作同上。用33%饱和硫酸铵重复上述步骤提取一次。将提取物装入透析袋，在生理盐水中透析，以除去其中所含的硫酸铵。放_20°C冰箱保存。按照ProteinA-Sepharose亲和层析柱纯化试剂盒操作说明书进行抗体的进一步纯化。并采用SDS-PAGE及Western blotting鉴定分离纯化的抗HRP多抗。
(5 )抗HRP抗体-HRP复合物的制备
取纯化好的HRP抗体10mg，加入一定量的HRP，二者亲和而成不饱和抗HRP抗体-HRP复合物，装入透析袋，在生理盐水中透析，放_20°C冰箱保存。实施例2酶信号循环放大高灵敏免疫检测乙肝表面抗原系统(双抗体夹心测抗原)
(I)材料准备
HBsAg包被板取抗HBsAg多抗，用PH 9. 6碳酸盐缓冲液稀释终浓度5_8 ug /ml，包被体积为 100 150ul/孔。包被条件 4° C 过夜。1%BSA，0. OlM PBS，PH7. 4，37° C 封闭 2h，
甩干备用。抗HBsAg酶结合物①取5 mg HRP溶于0. 5ml双馏水中，加入新配制的0. 06 Mol/L NaIOjjC溶液0.5 ml，混匀，置4 °C 30 min ;②取出后加入0. 16 Mol/L乙二醇水溶液0. 5ml,室温放置30 min !③加入含5mg纯化HBsAg抗体的水溶液Iml,混勻，并装入透析袋,对
0.05 Mol/L pH 9. 5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6 h，使之结合；④加入NaBH4溶液(5 mg/ml) 0.2 ml,混匀，置4 °C 2 h ;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，40C 30 min，离心，去上清，沉淀以少许0.02 Mol/L pH7. 4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4 °C透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得抗HBsAg酶结合物，以0. 02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5 ml ;⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。显色剂A 液醋酸钠 13. 6g，柠檬酸 I. 6g，H202 (30%) 0. 3ml, dH20 500ml ；显色剂B液EDTA-Na 0. 2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB (四甲基联苯胺)0. 2g终止液2M H2S04 ；
20X 浓缩洗涤液8 mM 磷酸钠，2mM 磷酸钾，0. 14 M NaCl, 100 mM KCl, 0. 05%Tween-20, pH 7. 4。(2)操作步骤
取出抗体包被板，预留空白孔I孔、阴性对照3孔，阳性对照2孔，其余各孔每孔加入50 u L待测样本。阴阳性对照每孔加入50 ii L对照血清。然后每孔加入50 ii L抗HBsAg酶结合物(不包括空白孔)，空白孔空置。混匀后，37°C温育30分钟。用稀释好的洗涤液洗板I次，甩干后加入抗HRP抗体-HRP复合物50 u L/孔(稀释比1000-10000)，37°C温育30分钟。用稀释好的洗涤液洗板4次，洗板时洗涤液应注满板孔，但不应溢出，每次注入洗涤液后应浸泡15秒。每孔先加入50 ii L显色剂A液，再加入50 ii L显色剂B液，混匀后，37°C避光温育30分钟。每孔加入100 终止液，混匀。选择酶标仪测定波长为450nm，参考波长630nm,测定各孔吸收值。实施例3酶信号循环放大高灵敏免疫检测猪口蹄疫病毒抗体系统(间接法测抗体)
(I)材料准备
包被抗原取0型口蹄疫病毒VPl蛋白，用PH 9. 6碳酸盐缓冲液稀释终浓度3-10 ug/ml，包被体积为150ul/孔。包被条件4° C过夜。5%脱脂奶粉，0. OlM PBS,0. 05% Tween20,PH7. 4,37° C封闭2h，甩干备用。 酶标二抗①取5 mg HRP溶于0. 5ml双馏水中，加入新配制的0. 06 Mol/L NaIO4水溶液0.5 ml，混匀，置4 0C 30 min ;②取出后加入0. 16 Mol/L乙二醇水溶液0. 5 ml,室温放置30 min 加入含5mg 二抗的水溶液Iml,混勻，并装入透析袋,对0. 05 Mol/L pH9. 5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6 h，使之结合；④加入NaBH4溶液(5 mg/ml) 0.2 ml，混匀，置4 °C2 h ;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4 0C 30 min，离心，去上清，沉淀以少许0.02 Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4 °C透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得抗HBsAg酶结合物，以0.02 Mol/L pH 7.4PBS液加至5 ml ;⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。显色剂A 液醋酸钠 13. 6g，柠檬酸 I. 6g, H202 (30%) 0. 3ml, dH20 500mL ； 显色剂B液=EDTA-Na 0. 2g，柠檬酸0. 95g，甘油50mL, TMB (四甲基联苯胺)0. 2g 终止液1M HCl ；
20X 浓缩洗涤液8 mM 磷酸钠，2mM 磷酸钾，0. 14 M NaCl, 100 mM KCl, 0. 05%Tween-20, pH 7. 4。(2)操作步骤
取PVl抗原包被板，预留空白孔I孔、阴性对照3孔，阳性对照2孔，其余各孔每孔加入50 y L待测样本。然后每孔加入50 y L酶标二抗(不包括空白孔)，空白孔空置。混匀后，37°C温育30分钟。用稀释好的洗涤液洗板I次，甩干后加入抗HRP抗体-HRP复合物50 u L/孔(稀释比1000-10000)，37°C温育30分钟。用稀释好的洗涤液洗板4次，洗板时洗涤液应注满板孔，但不应溢出，每次注入洗涤液后应浸泡15秒。每孔先加入50 y L显色剂A液，再加A 50 u L显色剂B液，混匀后，37°C避光温育30分钟。每孔加入100 u L终止液，混匀。选择酶标仪测定波长为450nm，参考波长630nm，测定各孔吸收值。上述实施例为本发明的实施方式一部分，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化。均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于酶信号循环放大免疫检测方法的构建，其特征在于米用抗HRP多抗-HRP复合物进行酶信号的循环放大，而不仅仅限于HRP，也可是其他类型的酶如碱性磷酸酶AP坐寸ο
2.根据权利要求I所述的酶信号循环放大免疫检测方法，是在传统ELISA检测模式上再进行酶信号的循环放大，传统的常见检测模式有双抗体夹心测抗原、双抗原夹心测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体\抗原、亲和素-生物素-ELISA等不同类型的ELISA检测模zpf*坐坐工、O
3.—种如权利要求1，2所述的酶信号循环放大免疫检测方法，其特征在于使用一种抗HRP多抗-HRP复合物(或等效的其他类型酶对应的复合物)，其所采用的是抗HRP的多抗，并与HRP形成不饱和类型复合物，此复合物具有HRP酶活性，同时还能与HRP进行结合。
4.根据权利要求I所述的抗HRP多抗-HRP复合物的制备方法，其特征在于用纯化的HRP免疫兔，得到含有抗HRP抗体的兔血清；先用(NH4)2SO4沉淀法从兔的血清中初步纯化免疫球蛋白IgG,再用ProteinA-Sepharose亲和层析柱进一步纯化抗HRP的IgG, SDS-PAGE及Western blotting鉴定分离纯化的抗HRP多抗。
5.取上述纯化后的抗HRP多抗，加入一定量的HRP形成不饱和的抗HRP多抗-HRP复合物。
6.根据权利要求1，2所述的酶信号循环放大免疫检测方法，其特征在于能够实现酶信号的循环放大，大大提高其检测灵敏度，而不限制于采用何种ELISA检测模式。
7.—种如权利要求1，2所述的酶信号循环放大方法，适用于各类ELISA试剂盒的研制，所要求是一种基于酶信号循环放大的新型ELISA检测系统。
8.—种如权利要求I所述的抗HRP抗体，属于多抗，而不局限于何种类型的多抗，即可为兔多抗，也可为鼠多抗、羊多抗等。
9.一种权利要求I所述的酶信号循环放大免疫检测系统在临床检验、食品安全、动物疫病等相关领域的应用。
全文摘要
本发明涉及酶联免疫(ELISA)领域，特别是一种抗HRP多抗-HRP复合物应用于ELISA技术，从而获得酶信号循环放大。基于酶信号循环放大免疫检测方法，适合于各种类型的基于酶信号放大的免疫检测系统，该免疫检测系统的优势是能够最大程度上提高其检测灵敏度。
文档编号G01N33/53GK102809648SQ20111014449
公开日2012年12月5日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者张恒, 汤慕瑾, 吕敬章, 谢丽琪, 岳振峰, 万志刚, 蓝芳, 黄李华, 范放, 洪小柳, 蔡伟增, 陈昊翰 申请人:深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心