专利名称：微量蛋白检测方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白检测方法，尤其涉及一种基于磁珠、纳米金探针和滚环扩增的微量蛋白检测方法。
背景技术：
免疫学技术是用以检测特定蛋白(抗原)的最有效的方法，比如在实验室最常用的Western blot、免疫荧光和在临床广泛使用的酶联免疫吸附试验(ELISA)，都是利用抗体的特异性实现的。由于所有的结合反应都通过自由扩散进行，结合效率比较低。因此， 磁珠就被引入到反应体系中，磁珠是可以作为固相载体，对抗原进行分离和富集，又因为其尺寸较小，可以与待测的液体样品充分接触，有利于提高抗原结合效率。但是，蛋白检测的灵敏度始终低于核酸检测，其原因在于核酸可以扩增而蛋白无法扩增。于是有人想到了将DNA与抗体相连接，通过扩增与抗体相连的DNA以放大信号，借此弥补蛋白无法扩增的劣势。DNA扩增的方法有聚合酶链式反应(PCR)以及各种等温扩增的方法，PCR是一种变温扩增的方法，需要特定的仪器，且与之前的抗原抗体反应不在同一种管子内进行，在操作上造成不便，也容易造成交叉污染。等温扩增对仪器的要求较低，其中滚环扩增(RCA)因其技术的成熟性，是等温扩增中最为广泛使用的一种，将其与抗原抗体反应相结合，就形成了免疫RCA(Immuno-RCA)的方法。在免疫RCA方法中，寡核苷酸引物的5’端标记有抗体，抗原抗体反应后，加入RCA反应组分与环状DNA模板进行RCA,然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交，最后对荧光信号进行检测。免疫RCA方法使蛋白检测的灵敏度得到了改善，但是，对于微量蛋白的检测，现有免疫RCA方法的灵敏度仍然偏低。随着纳米技术的发展，纳米材料在其它学科的应用也逐渐增加，这也为生物医学的发展提供了新的契机。作为标记材料的纳米金颗粒，对生物分子具有很强的吸附已经在免疫检测和免疫电镜中被使用，是纳米材料中最成熟的一种。将纳米材料与生物医学相结合，将推动生物医学的发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种微量蛋白检测方法，该方法比传统的免疫RCA方法具有更高的灵敏度。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种微量蛋白检测方法，包括以下步骤将抗待测蛋白的抗体标记到磁珠表面，制成抗体标记的磁珠；将纳米金颗粒与抗待测蛋白的抗体、DNA连接，制成抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针；将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附该抗体标记的磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；
加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；检测荧光信号，得待测蛋白的检测结果。所述连接抗体与DNA的纳米金颗粒的直径为10 30纳米。所述纳米金探针的抗体与DNA的分子数之比为I : 5 I : 20。优选的，所述抗体与DNA的分子数之比为I : 8 I : 16。所述纳米金颗粒由还原剂还原氯金酸制得。所述纳米金探针的DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接。在本发明的另一方面，还提供了一种纳米金探针，包含抗体、DNA、纳米金颗粒，所述抗体和DNA通过纳米金颗粒相连接。 所述抗体与DNA的分子数之比为I : 5 I : 20。优选的，所述抗体与DNA的分子数之比为I : 8 I : 16。在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述纳米金探针的微量蛋白检测试剂盒。本发明的微量蛋白检测方法，是基于磁珠、纳米金探针和滚环扩增的蛋白检测方法，该方法使DNA分子与抗原的比例从原先的I : I提高到50 : I至100 : 1，多了一级信号放大，提高了灵敏度；也使DNA与抗体的连接更简便，无须化学试剂处理，减少对环境的污染。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图I是本发明纳米金探针的制备流程示意图；图2是本发明蛋白检测流程示意图；图3是本发明实施例I的流式细胞仪检测结果图。
具体实施例方式为了提高微量蛋白检测的灵敏度，本发明方法将抗体标记的磁珠、纳米金探针和滚环扩增相结合，其中使用的纳米金探针是抗体与DNA通过纳米金颗粒连接的探针，且连接在纳米金颗粒上的抗体与DNA的分子数之比为I : 5 I : 20，该纳米金探针取代了现有免疫RCA中抗体与DNA直接I : I连接的方法，使检测信号明显放大，显著提高了微量蛋白检测的灵敏度。本发明微量蛋白检测方法，包括以下步骤将抗待测蛋白的抗体标记到磁珠表面，制成抗体标记的磁珠；将纳米金颗粒与抗待测蛋白的抗体、DNA连接，制成抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针(见图I)，其中，纳米金颗粒的直径为10 30纳米，抗体与DNA的分子数之比为I : 5 I : 20，DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接；将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附该抗体标记的磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；
检测荧光信号，得待测蛋白的检测结果(见图2)。本发明微量蛋白检测方法的具体步骤如下I.磁珠标记按照所购买磁珠的说明书，将针对待测蛋白的抗体标记到磁珠表面。2.纳米金探针制备用柠檬酸钠还原四氯金酸法制备直径为10 20纳米的纳米金颗粒，将纳米金的pH调至9 9. 5，再加入能使纳米金稳定的最少量抗体，室温孵育30分钟后加入一定量的巯基修饰的DNA，10度孵育4分钟，加入IOOmM磷酸钠缓冲液(pH7. O)至磷酸盐终浓度9mM，室温振荡30分钟，然后放置3小时以上；加入高盐缓冲液(IOmM磷酸盐缓冲液(pH7. O)，2M
氯化钠)至氯化钠终浓度150mM，室温放置I小时，4度10000 Xg离心15分钟，用洗液(IOmM磷酸盐缓冲液(PH7. 4)，150mM氯化钠)洗3次；最后加200微升洗液，4度保存。3.微量蛋白检测取一定量的抗体标记的磁珠用100微升洗液重悬，加入100微升待测血清样品，室温振荡I. 5小时，用磁铁吸附磁珠，弃上清，用洗液洗两次，加入49微升洗液和I微升纳米金探针，室温振荡I小时，用洗液洗两次，加入环形模板孵育30分钟，用洗液洗两次，加入φ29 DNA聚合酶、配套的缓冲液、dNTP，30度反应I. 5小时，最后进行检测。实施例II.磁珠标记取100 微升 Dynabeads M-280 Tosylactivated (Invitrogen 公司)，按照说明书，加入60微克抗乙肝表面抗原单抗进行标记，最后重悬到I毫升说明书推荐的缓冲液，4度保存。2.纳米金颗粒的制备在一个回流装置中加热250毫升ImM四氯金酸至110度以上，然后加入25毫升38. SmM柠檬酸钠，再加热15分钟，冷却至室温，4度保存，制备的纳米金颗粒平均直径为13纳米。3.纳米金探针制备取I毫升纳米金，用氢氧化钠调节pH至9. 2，加入8微克抗乙肝表面抗原多抗，室温孵育30分钟后加入Inmol的巯基修饰的DNA，10度孵育4分钟，加入110毫升IOOmM磷酸钠缓冲液(PH7. O)，室温每分钟1000转振荡30分钟，然后放置3小时；加入99微升高盐缓冲液(IOmM磷酸盐缓冲液(ρΗ7· O)，2Μ氯化钠)，室温放置I小时，4度10000 X g离心15分钟，用I毫升洗液(IOmM磷酸盐缓冲液(pH7. 4)，150mM氯化钠)洗3次；最后加200微升洗液，4度保存。4.微量乙肝表面抗原检测乙肝表面抗原用血清稀释成10ng/mL、lng/mL、100pg/mL、10pg/mL 和 lpg/mL。取 5微升抗体标记的磁珠，用100微升洗液重悬，加入100微升待测血清标准样品，室温每分钟1000转振荡I. 5小时，用磁铁吸附磁珠，弃上清，用200微升洗液洗两次，加入49微升洗液和I微升纳米金探针，室温振荡每分钟1000转I小时，用200微升洗液洗两次，加入IOpmol环形模板(溶于50微升洗液)，孵育30分钟，用200微升洗液洗两次，加入50微升反应体系，包括 10 单位 φ29 DNA 聚合酶(Fermentas 公司)、1Χ 缓冲液、O. 2mM dNTP.O. 2μΜ Cy3标记的探针，30度反应I. 5小时；经重悬后用流式细胞仪进行检测，结果见错误！未找到引用源。。检测极限可以达到10pg/mL，是常规ELISA灵敏度的100倍，且线性关系较好。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种微量蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤 将抗待测蛋白的抗体标记到磁珠表面，制成抗体标记的磁珠； 将纳米金颗粒与抗待测蛋白的抗体、DNA连接,制成抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针； 将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附该抗体标记的磁珠，使待测蛋白得到分离和富集； 加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合； 加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应； 检测荧光信号，得待测蛋白的检测结果。
2.根据权利要求I所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述连接抗体与DNA的纳米金颗粒的直径为10 30纳米。
3.根据权利要求I所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述纳米金探针的抗体与DNA的分子数之比为I : 5 I : 20。
4.根据权利要求I所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述纳米金颗粒由还原剂还原氯金酸制得。
5.根据权利要求I所述的微量蛋白检测方法，其特征在于，所述纳米金探针的DNA通过金硫键与纳米金颗粒连接。
6.—种纳米金探针,其特征在于,包含抗体、DNA、纳米金颗粒,所述抗体和DNA通过纳米金颗粒相连接。
7.根据权利要求6所述的纳米金探针，其特征在于，所述抗体与DNA的分子数之比为I: 5 I : 20。
8.根据权利要求7所述的纳米金探针，其特征在于，所述抗体与DNA的分子数之比为I: 8 I : 16。
9.一种微量蛋白检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求6所述的纳米金探针。
全文摘要
本发明公开了一种微量蛋白检测方法，包括以下步骤制备抗体标记的磁珠；制备抗体与DNA通过纳米金颗粒相连接的纳米金探针；将抗体标记的磁珠与待测蛋白样品混合，用磁铁吸附磁珠，使待测蛋白得到分离和富集；加入纳米金探针，该探针与所述分离和富集的待测蛋白结合；加入环形DNA模板、滚环扩增反应组分及荧光标记探针，进行滚环扩增反应；检测荧光信号。本发明的微量蛋白检测方法，显著提高了灵敏度，降低了蛋白与DNA连接的难度，适用于医学检测。
文档编号G01N33/532GK102879580SQ20111019335
公开日2013年1月16日 申请日期2011年7月11日 优先权日2011年7月11日
发明者张捷 申请人:上海生物芯片有限公司