专利名称：一种烟草hplc指纹图谱数据库的建立方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于烟草品质分级技术领域，具体涉及一种烟草HPLC指纹图谱的分析方法及在烤烟质量分析、烤烟品牌识别和打叶配方中的用途。
背景技术：
指纹图谱系指将分析对象经适当处理后，采用一定的仪器分析手段得到的能够标示该对象特性的共有峰的图谱。指纹图谱技术具有模糊指纹特征分析、宏观推断分析等特点，是进行复杂物质质量评价的有效手段。指纹图谱技术已经成功地应用于中药品质分析和判断及农产品朔源等领域。鉴于此，近年来，一些研究者对指纹图谱技术在烟草科研与生产上应用的理论和实践问题进行了有益的探索。经检索，中国发明专利中指纹图谱应用的发明专利申请涉及烟草和中成药鉴定等多个方面。经检索目前的相关专利文献如下
申请号为200810196806. 7文献涉及一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱分析方法。它是采用高效液相色谱分析方法测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用中草药指纹图谱软件对特征峰进行分析，建立指纹图谱特征峰总面积与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官质量为依变量y，指纹图谱总面积χ为因变量，建立两者的回归关系模型为:Y = 72. 04974+0. 1388*LN(X) *LN(X)或 Y = X/ (0. 011081*Χ+13· 247)；根据所测样品的指纹图谱总面积X，计算出感官质量Y。本发明具有准确性高、稳定性好的特点， 实际操作中可节省大量的人力物力财力，使用方便，能够代替利用传统的感官评吸方法对烟叶醇化质量的判定。申请号为200810196807. 1文献涉及一种烤烟醇化品质判定的高效液相指纹图谱主成分分析方法。它是采用高效液相色谱分析方法测定不同烟叶样品，得出烟叶指纹图谱特征峰，然后利用中草药指纹图谱软件对特征峰进行分析，建立特征峰主成分值与烟叶样品感官质量的回归关系模型；以感官评吸值Y为依变量，7个主成分值Al至Α7为因变量， 建立特征峰主成分值与感官评吸值的多元回归模型
Y = 85. 64+1. 34Α1+1. 21Α2+0. 27Α3-0. 40Α4-1. 17Α5-0. 46Α6+0. 48Α7 根据分析所得到的主成分值Α，计算出感官质量Y。具有准确性高、稳定性好的特点，实际操作中可节省大量的人力物力财力，使用方便，能够代替利用传统的感官评吸方法对烟叶醇化质量的判定。申请号为01119925. 3的文献涉及中药丹参水溶性提取物HPLC指纹图谱建立的方法及其标准指纹图谱。首先制备供试品溶液，取丹参药材粉末(过30目筛)4.00g，加水 50ml，精密称重，回流提取2小时，放冷至室温，补足失水，取2ml置25ml量瓶，甲醇定容至刻度，离心，取上清液作为供试品溶液。再配制对照品溶液，取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，用流动相稀释，制成每Iml中含丹参素钠20 μ g，原儿茶醛5. 0 μ g，作为对照品溶液。测定法是分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μ 1、10μ 1，分别注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，计算，即得。建立丹参标准指纹图谱。将待测丹参样品指纹图谱与标准指纹图谱对比，比较其异同。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握丹参的品种和质量情况，可将其作为丹参质量控制及真伪鉴别的指标之一。申请号为03147783. 6文献涉及一种使用高速逆流色谱(HSCCC)制订中药指纹图谱的方法。该方法包括制备各批次中药材的粗提物；通过TLC确定主要化合物类型；选取 HSCCC使用的溶剂体系；使用高速逆流色谱仪纯化中药材的粗提物；使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；通过HPLC和UV-Vis确定粗提物中各组份的对应性；判断共有指纹峰；综合中药指纹图谱方法学考察资料的数据即构成指纹图谱。该法首次将HSCCC应用于中药指纹图谱的制订，是对现有方法的重要补充，其精密度和重现性明显优于TLC，又解决了 HPLC难以分析/分离高粘度和易填料吸附的样品以及仪器耗材昂贵的问题。申请号为200410066701. 1文献涉及一种中药指纹图谱的制作方法，是一个用裂解-气相色谱-质谱联用技术来制作中药指纹图谱的方法，该方法包括下列三步步骤1、中药材的裂解；2、GC/MS分析；3、计算机处理，获得标识混合体系的彩色二维条形码，即是使得计算机能够识别中药的指纹图谱。通过对同一药材或不同药材的标准谱图进行精确的类似度比较，根据类似度的大小，人们可对中药材进行鉴别。因而本发明制作方法可用来快速有效地鉴别中药材，控制中药材的质量，为提高中药生产现代化程度提供一个重要的手段。申请号为200610(^9707. 0文献涉及一种治疗心血管疾病的中药组合物及其指纹图谱分析方法。该中药组合物由人参、蟾酥、牛黄、肉桂、麝香、冰片、苏合香七味药材或者七味药材的提取物组成。这种中药组合物的非挥发性成分和挥发性成分的指纹图谱具有一定数量的特征峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积符合一定的比例。本发明对于发展我国传统医药，促进人类健康具有十分重大的意义。申请号为201010106834. 2的文献涉及天麻生化指纹图谱分类与品质鉴定技术及其应用，涉及中药和天然药物的鉴定与品质评价技术。本发明提供了分离和检测天麻生化成分的关键技术参数最佳流动相(梯度浓度乙腈溶液)和最佳检测波长Ol9nm)以及其他基本条件，提供了测定天麻生化指纹图谱的技术和计算天麻有效成分天麻素含量的公式和方法。本发明不仅能用于天麻生化指纹图谱的测定、天麻品种的分类、天麻品质的鉴定和评价，还能用于天麻适宜种植地区确定和天麻真伪鉴别。上述专利文献多是中药指纹图谱的分析及其应用，只有二份涉及烤烟的指纹图谱建立及其应用。该二份烤烟指纹图谱文献均是采用多元分析方法预测烤烟的感官评吸值， 由于感官评吸受人为主观因素影响，评吸值变异大、重现性差，因此上述二个专利文献的应用具有局限性。中草药指纹图谱的测定对象和分析对象与烤烟有根本的不同，虽然其科学原理可以作为参考，但其技术方法不能照搬。另外，过去建立的烤烟和中草药指纹图谱均是采用共有峰图谱，没有考虑非共有峰的作用，在实际应用中，理论上存在误判的可能性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术没有考虑指纹图谱非共有峰、仅靠预测烤烟的感官评吸值来进行品质分析的缺陷，寻找一种高效经济的烤烟品质分级方法及其应用技术途径。本发明寻找一种能够反映烤烟的特征品质的指纹图谱分析方法，并提出具体的应用技术途径。本发明提出的指纹图谱分析方法能够科学的将烤烟进行分类，切实降低烤烟评吸工作量，提高打叶配方生产水平，达到国家标准。本发明是这样实现的一种烟草HPLC指纹图谱数据库的建立方法，其特征步骤为
1)、烤烟成分提取以甲醇为提取剂，提取条件为液固比v/g为20— 40，提取温度为 20 30°C，超声波提取时间50 60min，离心分离后取上清液过0. 45Mm的滤膜，滤液为待测溶液；
2)、HPLC指纹图谱分析取步骤1)的待测溶液，采用HPLC进行指纹图谱分析，得到烤烟原始指纹图谱数据库，分析条件为C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0. 08 0. 2%的甲酸；梯度洗脱程序不同分析时间时，流动相A与B体积比分别是0min时为0 5 95 100，30min 时为 20 25 75 80，45min 时为 30 40 60 70，55min 时为 50 60:40 50并保持5 min，停止色谱分析；65min时，A与B的体积比为0 5:95 100 ； 保持aiiin后运行5min ；其体积流量范围0. 8-1.2 ml/min ；柱温20 30°C，检测波长 250nm ；
3)、指纹图谱分时数据库的建立通过计算机编程技术，将步骤2)得到的烤烟原始指纹图谱数据库转换成烤烟指纹图谱分时数据库；
4)、主成份一聚类分析法判定烟草品质级别采用主成份分析法对步骤3)的烤烟指纹图谱分时数据库进行分析，提取主成份，对不同样品的主成份值进行聚类分析；或者直接对步骤3)的烤烟指纹图谱分时数据库指标进行聚类分析，以达到对不同品质的烟叶进行分类的目的。所述步骤3)的分时数据库的时长为l-5min。所述步骤1)的超声波频率为20 80MHz，离心机离心力为5，000 12，000 g，离心时间8 15min。所述步骤2)的色谱柱为C18色谱柱。本发明方法涉及在烤烟品质分类及品牌烟叶识别中的应用。本发明首次提出分时图谱数据库，并直接将指纹图谱信息转化为烤烟品质的分类结果，理论上更为完善、方法上更为科学、实际上更好操作。本发明的烤烟HPLC指纹图谱包括共有峰和非共有峰。所谓共有峰是在供研究样品的指纹图谱中都出现的特征峰。共有峰数据库的优点是简单明了，但其缺点是忽视了非共有峰的作用和贡献。不可否认，一定条件下，可能正是非共有峰的作用和贡献决定了烟叶的品质和级别的差异性。基于这一崭新的指导思想，实施本发明的核心技术是建立HPLC分时指纹图谱数据库的方法，这一方法充分考虑到了非共有峰的贡献，通过对分时数据库进行主成份一聚类分析，从而确定烤烟品质级别，达到烤烟品质分级的目的。HPLC指纹图谱分时数据库建立的方法是，通过人工和计算机编程技术使原始指纹图谱数据库转换成分时数据库。理论上，任何时间段都可以选用来进行建库。一般是时间段越短、信息量越丰富。通常根据计算要求，可以选1至5min不等。比如，为选取合适的时间段，采用lmin、2min、;3min和5min这四个时间段，分别将60min的图谱剪切成60、30、20禾口 12个时段图谱数据进行分析。从不同时间段选取的结果来看，Imin和^iin时间段太短，特征峰之间还是会出现漂移；而5min时间段包含的稳定性不高的特征峰太多。最终选取:3min时间段来对烤烟指纹图谱进行化学计量学分析。本发明的研究结果表明，采用甲醇提取液，HPLC分析建立的烟草特征提取物色谱图基线平稳、响应峰多、分离度好(如图1)。对样品提取液连续进样5次，比较保留时间和峰面积的精密性和重现性，结果表明，峰面积RSD<3%以下。取烤烟样品提取液相隔池，4h，他， 8h，10h, 12h进行方法稳定性检测，结果发现，检测结果RSD<3%以下，表明该方法很稳定。另外，选取10个样本指纹图谱，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”，经过数据导入和数据匹配，以平均数法建立对照指纹图谱(如图2)。从图2指纹图谱共有模式和匹配结果可以看出，有48个峰为10个批次样品所共有(表1)，经统计共有峰峰面积占总峰面积的90%以上。相似度分析表明，10批次样品指纹图谱的相似度在0. 98以上(表2)， 表明所建立的指纹图谱完全符合技术规范。本发明首次提出了指纹图谱分时数据库的概念并提出了相应的计算软件和方法 (图3)。分时数据库的提出是为了快速处理指纹图谱数据，降低人为操作失误，最大程度利用图谱潜在信息，包括非共有峰对烟叶品质的影响。同时，可以实现数据的客观性，降低人为误差，使数据整理工作变的简单方便，实现指纹图谱工业化的目的。本发明采用HPLC技术获得指纹图谱，采用分时软件构建指纹图谱的分时数据库，通过主成份一聚类分析实现对烟草品质的分类。本发明的HPLC指纹图谱分析新技术，能够提高烟草HPLC指纹图谱分析的科学性，对于提高烤烟质量分级水平及提高烟草生产水平和经济效益具有十分重要的
眉、ο本发明的技术原理是
烤烟的指纹图谱是烤烟多种品质复杂成分的集合，如同人的指纹的唯一性一样，烤烟的指纹图谱是一定品质特征的反映。采用科学的方法对烤烟指纹图谱进行表征和分析，就可以实现对烤烟品质的分类。采用HPLC技术建立的指纹图谱包括共有峰和非共有峰，显然，可能正是非共有峰的作用和贡献决定了烟叶的品质和级别的差异性。然而，过去有关指纹图谱的分析均是采用共有峰，而忽视了非共有峰的作用和贡献。而且，HPLC指纹图谱共有峰和非共有峰众多， 靠人工辨别，很容易导致错误。本发明提出分时指纹图谱数据库的概念和分析技术，是为了快速处理指纹图谱数据，降低人为操作失误，最大程度地利用图谱的潜在信息，包括非共有峰对烟叶品质的影响。同时，降低人为误差，使数据整理工作变的简单方便，实现指纹图谱分析自动化的目的。本发明的有益效果是
1)本发明的分时数据库的建立方法，简单、实用、运行成本低；
2)指纹图谱分时数据库的更能反映烤烟的品质特征，以此为基础的品质分析方法，更科学，更完善；
2)本发明采用的烤烟品质判定方法，能够取代人工评吸方法实现对烤烟品质的判定及在打叶配方中的应用，避免了人的主观错误，提高了打叶配方中烤烟品质判定的科学性，在实际运用中显著提高经济效益。
图1 本发明的烤烟甲醇特征提取物HPLC指纹图谱图；图2 本发明在实验条件下，选用的云南烤烟10批次样品甲醇提取物HPLC指纹图谱及其共有模式。图3 本发明提出的指纹图谱数据库分时数据软件视窗示意图。图4:本发明在实验条件下，2010年云南省典型产区C3F等级烟叶指纹图谱聚类分析。图5 本发明在实验条件下，2010年云南省典型产区B2F等级烟叶指纹图谱聚类分析。图6 本发明在实验条件下，2010年云南省典型产区X2F等级烟叶指纹图谱聚类分析。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的内容并不限于实施例。实施例1
本发明提供的烟草HPLC指纹图谱数据库的建立方法，经过下列步骤
1)烤烟提取以甲醇为提取剂，具体提取条件是液固比(v/g)为30，提取温度25°C， 频率为40 MHz的超声波中提取60min，离心机(10，000 g)离心8min ；离心后取上清液，过 0. 45Mffl的滤膜，滤液为待测溶液；
2)取步骤1)的待测溶液进行指纹图谱分析HPLC，具体条件为C18色谱柱(250 mmX 4.6mm，5Mm)，乙腈为流动相A，0. 1% (ν/ν)的甲酸为流动相B ；梯度洗脱程序不同分析时间时，流动相A与B体积比分别是0min时为5: 95 ；30min时为20:80 ；45min时为 30:70 ；55min时为55:45，保持5 min停止色谱分析，65min时，A与B的体积比为5:95 ；保持anin后运行5min ；其体积流量0. 8ml/min，柱温25°C，检测波长250nm ；
3)指纹图谱分时数据库的建立通过计算机编程技术使原始指纹图谱数据库转换成分时数据库，时间段越短，信息量越丰富，根据计算要求，选取:3min时间段来对烤烟指纹图谱进行化学计量学分析；
4)主成份一聚类分析法判定烟草品质级别采用主成份分析法对烤烟指纹图谱分时数据库进行分析，提取主成份，对不同样品的主成份值进行聚类分析，即最短距离法，达到对不同品质的烟叶进行分类的目的。实施例2
本发明提供的烟草HPLC指纹图谱数据库的建立方法，经过下列步骤
1)烤烟提取以甲醇为特征提取剂，具体提取条件是液固比(v/g)为40，提取温度 30°C，频率为80 MHz的超声波中提取50min，离心机(5，000 g)离心15min ；离心后取上清液，过0. 45Mffl的滤膜，滤液为待测溶液；
2)取步骤1)的待测溶液进行指纹图谱分析HPLC，具体条件为C18色谱柱(250 mmX 4.6mm，5Mm)，乙腈为流动相A，0.2% (ν/ν)的甲酸为流动相B ；梯度洗脱程序不同分析时间时，流动相A与B体积比分别是=Omin时为0: 100 ；30min时为25:75 ；45min时为 40:60 ；55min时为50:50，保持5 min停止色谱分析，65min时，A与B的体积比为0:100 ；保持aiiin后运行5min ；其体积流量1. 2ml/min，柱温30°C，检测波长250nm ；
3)指纹图谱分时数据库的建立通过计算机编程技术使原始指纹图谱数据库转换成分时数据库，时间段越短，信息量越丰富，根据计算要求，选取^iin时间段来对烤烟指纹图谱进行化学计量学分析；
4)主成份一聚类分析法判定烟草品质级别采用主成份分析法对烤烟指纹图谱分时数据库进行分析，提取主成份，对不同样品的主成份值进行聚类分析，即最短距离法，达到对不同品质的烟叶进行分类的目的。实施例3
供试烟叶品种K326，等级为C3F，分别取自云南省16个不同烟叶产区。所有烟样在 2010年分别收集上来，经云南省烟叶公司统一复烤后制成烟丝。将烟丝样品在60°C下烘干，用植物粉碎机粉碎，过60目筛，用塑料袋密封，置于超低温冰箱(-80°C)中保存待测。按照实施例1的分析方法进行分析，得出不同样品的聚类图(如图4)。通过聚类分析图4可以看出，在距离为0. 1左右时，可以将云南省各个产区C3F等级烟叶分成4类第一类烟叶产区是富源、沾益、马龙和楚雄；第二类是宣威、会泽、昆明、保山、丽江和思茅；第三类是麒麟、罗平、红河和文山；第四类是临沧和昭通。实施例4
供试烟叶品种K326，等级为B2F，分别取自云南省17个不同烟叶产区。按照实施例2 的制备方法和分析方法进行分析，得出不同样品的聚类图(如图5)。通过聚类分析图5可以看出，在距离为0. 1左右时，可以将云南省各个产区B2F等级烟叶分成3类第一类烟叶产区是大理、师宗、楚雄、宣威；第二类是玉溪、昆明、昭通、沾益、文山、麒麟、保山；第三类是陆良、临沧、红河、罗平、富源、思茅。实施例5
供试烟叶品种K326，等级为X2F，分别取自云南省14个不同烟叶产区。按照实施例1 的制备方法和分析方法进行分析，得出不同样品的聚类图(如图6)。通过聚类分析图6可以看出，可以将云南省各个产区X2F等级烟叶分成2类第一类烟叶产区是宣威、易门、富源、禄劝、临沧、罗平、楚雄、大理和景东；第二类是保山、红河、 昭通、马龙和麒麟。表1烤烟10批次样品指纹图谱共有峰的出峰时间
权利要求
1.一种烟草HPLC指纹图谱数据库的建立方法，其特征步骤在于1)、烤烟成分提取以甲醇为提取剂，提取条件为液固比v/g为20— 40，提取温度为 20 30°C，超声波提取时间50 60min，离心分离后取上清液过0. 45Mm的滤膜，滤液为待测溶液；2)、HPLC指纹图谱分析取步骤1)的待测溶液，采用HPLC进行指纹图谱分析，得到烤烟原始指纹图谱数据库，分析条件为C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0. 08 0. 2%的甲酸；梯度洗脱程序不同分析时间时，流动相A与B体积比分别是0min时为0 5 95 100，30min 时为 20 25 75 80，45min 时为 30 40 60 70，55min 时为 50 60:40 50并保持5 min，停止色谱分析；65min时，A与B的体积比为0 5:95 100 ； 保持aiiin后运行5min ；其体积流量范围0. 8-1.2 ml/min ；柱温20 30°C，检测波长 250nm ；3)、指纹图谱分时数据库的建立通过计算机编程技术，将步骤2)得到的烤烟原始指纹图谱数据库转换成烤烟指纹图谱分时数据库；4)、主成份一聚类分析法判定烟草品质级别采用主成份分析法对步骤3)的烤烟指纹图谱分时数据库进行分析，提取主成份，对不同样品的主成份值进行聚类分析；或者直接对步骤3)的烤烟指纹图谱分时数据库指标进行聚类分析，以达到对不同品质的烟叶进行分类的目的。
2.根据权利要求1所述的烟草HPLC指纹图谱分时数据库的建立方法，其特征在于所述步骤1)的超声波频率为20 80MHz，离心机离心力为5，000 12，000 g，离心时间8 15min。
3.根据权利要求1所述的烟草HPLC指纹图谱分时数据库的建立方法，其特征在于所述步骤3)的分时数据库的时长为l-5min。
4.一种如权利要求1所述的方法在烤烟品质分类及品牌烟叶识别中的应用。
全文摘要
本发明提供一种烟草HPLC指纹图谱数据库的建立方法，经过烤烟成分提取、HPLC指纹图谱分析，得到烤烟原始指纹图谱数据库，通过计算机编程技术，将烤烟原始指纹图谱数据库转换成烤烟指纹图谱分时数据库，采用主成份分析法对烤烟指纹图谱分时数据库进行分析，以达到对不同品质的烟叶进行分类的目的。本发明能客观的描述烤烟指纹图谱的信息特征，更科学地反映烟草的内在品质，能取代传统的人工评吸及普通化学测定等方法在烤烟品质判定实际中应用，对于提高烟草品质评价的科学性及提高烤烟生产经济效益具有重要意义。本发明的特征是，利用指纹图谱分时软件建立烤烟指纹图谱的分时数据库，通过主成份－聚类分析方法建立烤烟质量分类体系。本发明还公开了这一方法在烤烟品质分级、打叶配方及品牌识别中的应用。
文档编号G01N30/88GK102507829SQ20111036563
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者何云燕, 何结望, 刘磊, 唐徐红, 尹晓东, 李琳, 涂书新, 矣跃平, 袁仕信, 阎铁军 申请人:云南省烟草烟叶公司