专利名称：一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测试剂盒领域，具体涉及一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试齐U盒。
背景技术：
肺癌是世界范围内最常见致死人数最多的恶性肿瘤之一，其发病率增长速度亦高居各恶性肿瘤之首，由于肺癌起病隐匿。目前仍缺乏有效地筛查和早期诊断方法，患者出现症状是多为晚期，预后较差，总得五年生存不超过15%，有症状者小于10%，但是在早期诊断的肺癌患者中，手术治疗的预后叫中晚期肺癌有明显改善，其生存率可达70%。临床上传统的诊断方法如胸片、支气管镜、痰细胞学检查等方法。但是缺乏足够的特异性和灵敏性。因此，临床上急需一种能够针对肺癌早期诊断的方法。目前，对于肺癌早期诊断比较简便快捷的方法是借助酶联免疫试剂盒，而国内外对于肺癌诊断的试剂盒都是针对肺癌某一种标志物进行检测，但是肺癌到目前没有一种特异性的肺癌标记物，都是一些相关的标记物，同时由于肺癌分类复杂，不同病理时期标志物的表达量有所不同，只是针对某一种标志物进行诊断，会带来极大地误诊情况。目前所采用的酶联免疫试剂盒联合检测是把几种标志物的酶标板同时操作，已达到联合检测的目的，此种操作会带来很大的人为误差。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的检测试剂盒中存在的人为误差大等问题，提供一种可同时在一块酶标板上对两种或三种标志物同时进行定量检测的试剂盒，可以消除人为误差，兼具操作简便、成本低廉的优点。本发明另一目的在于提供上述检测试剂盒的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述检测试剂盒的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，由包被有神经元特异性烯醇化物酶 (NSE)、细胞角蛋白片段21-1 (CYFRA21-1)和Dkkopf 1 (DKKl)单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21-1和DKK1，显色底物TMB和底物终止液组成；所述多孔板每孔包被NSE单克隆抗体l、ug/mL ；每孔包被CYFRA21-1单克隆抗体广2ug/mL ；每孔包被 DKKl单克隆抗体广2ug/mL。NSE、CYFRA21_1、DKKl三种检测性抗体按4:4:2比例加入酶标板孔中，总体积为100 uL。作为一种优选方案，上述多孔板中，每孔的包被液为lOOuL。作为一种优选方案，所述辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21_1和DKKl的工作浓度稀释倍数均为l:50(Tl:2500。作为一种优选方案，酶结合物保护液由0. Olmol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释得至IJ，所述磷酸盐缓冲液中含0.1%的牛血清白蛋白和0. 1%的硫柳汞。
本发明联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒的制备方法包括如下步骤制备包被有NSE、CYFRA21-1、DKKl单克隆抗体的多孔板；用pH 8 10碳酸盐缓冲液将NSE、 CYFRA21-1、DKKl单克隆抗体稀释，然后将上述NSE、CYFRA21-1、DKKl单克隆抗体稀释液加入到孔中；37°C包被lh，将5%牛血清白蛋白溶液加入到酶标板各孔，37°C封闭1 h ；封闭后用磷酸盐缓冲液洗版拍干，将其保存于4°C。本发明联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒可以应用于肿瘤相关标志物的检测中。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明所述试剂盒可以同时检测两种或三种肿瘤相关抗原，检测的特异性和灵敏度高，生产成本低。
图1是本发明检测试剂盒中酶标板包被抗体的示意图； 图2是本发明检测试剂盒的稳定性分析图。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1试剂盒的制备过程
(1)用碳酸盐缓冲液稀释NSE、CYFRA21-1、DKKl三种检测性抗体按4:4:2比例加入酶标板孔中，总体积为100 uL,置于370C，包板2h。(2)拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤5次。(3)用5%牛血清白蛋白溶液封闭酶标板，每孔200uL，37°C封闭1 h ；封闭后用磷酸盐缓冲液洗版拍干，将其保存于4°C。(4)拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤5次。(5)用锡箔袋抽真空，4°C放置备用。实施例2双抗夹心法酶联免疫试剂盒检测NSE、CK19、DKK1三种抗原
(1)反应孔中分别加入不同的待检血清，每例待检血清设三个平行复孔，待检血清稀释 5倍，每孔加入IOOuL,置于370C，lh。(2)拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤5次。(3)各孔加入稀释后的酶标抗体，每孔100uL，37°C，温育lh。(4)拍干板内液体，加入洗涤液洗板，每孔200uL，每次30s，洗涤5次。(5)各孔加入显色液11\^，每孔100uL，37°C反应10 min，加入终止液TMB，450nm读数(图1)。实施例3双抗夹心ELISA法重复性分析
选取高、中、低3份不同的阳性血清样品，用同一批试剂盒进行检测，每份样品分别平行测8孔，进行试剂盒批内重复性检测。表权利要求
1.一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于由包被有NSE、 CYFRA21-1和DKKl单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21-1和DKKl，显色底物TMB和底物终止液组成；所述多孔板每孔包被NSE单克隆抗体广如g/mL ；每孔包被 CYFRA21-1单克隆抗体广2ug/mL ；每孔包被DKKl单克隆抗体广2ug/mL，NSE、CYFRA21-1、 DKKl三种检测性抗体按4:4:2比例加入酶标板孔中，总体积为100 uL。
2.根据权利要求1所述的联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述多孔板中，每孔的包被液为lOOuL。
3.根据权利要求1所述的联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征还在于所述辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21-1和DKKl的工作浓度稀释倍数均为1 50(Tl 2500。
4.根据权利要求1所述的联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，其特征还在于酶结合物保护液由0. Olmol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释得到，所述磷酸盐缓冲液中含 0. 1%的牛血清白蛋白和0. 1%的硫柳汞。
5.权利要求1、中任意一条权利要求所述联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤制备包被有NSE、CYFRA21-1、DKK1单克隆抗体的多孔板；用PH 8 10碳酸盐缓冲液将NSE、CYFRA21-1、DKKl单克隆抗体稀释，然后将上述 NSE、CYFRA21-1、DKKl单克隆抗体稀释液加入到孔中；37°C包被lh，将5%牛血清白蛋白溶液加入到酶标板各孔，37°C封闭1 h;封闭后用磷酸盐缓冲液洗版拍干，将其保存于4°C。
6.权利要求1、中任意一条权利要求所述联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒在肿瘤相关标志物的检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒。本发明所述检测试剂盒由包被有NSE、CYFRA21-1和DKK1单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21-1和DKK1，显色底物TMB和底物终止液组成。本发明所述检测试剂盒具有简便、灵敏、稳定、重复性好等优点，具有实用价值。
文档编号G01N33/577GK102507951SQ20111038083
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者刘大路, 潘雪刁, 臧林泉 申请人:广东药学院