专利名称：一种定量检测肿瘤坏死因子α的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定一种定量检测肿瘤坏死因子α的诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
肿瘤坏死因子，简称TNF，是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白。肿瘤坏死因子 α (TNF- α )主要由单核一巨噬细胞分泌；TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌，两者有相似致热性。小剂量呈单峰热，大剂量呈双峰热；TNF在体内外均能刺激IL-I的产生。人类的TNF-α基因长约2. 76kb,小鼠为2. 78kb,结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上。1984 年从HL-60、U937等细胞中克隆成功rHu TNF-α CDNA，并在大肠杆菌中获得高表达。人 TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型 TNF-α为157氨基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。 rHu TNF-α分子量为17kDa。成熟的小鼠TNF-α与rMu TNF-α有79%氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似无明显的种属特异性。TNF-α参与了多种体内的生物学过程，能够杀伤或抑制肿瘤细胞，提高中性粒细胞的吞噬能力，抗病毒细菌感染，促进髓样白血病细胞向巨噬细胞分化等。应用TNF-α在治疗肿瘤等方面开始临床II期试验，也可与IL-2联合治疗肿瘤，目前认为全身用药的疗效不及局部用药，后者如病灶内注射，局部浓度高且副作用也较轻。近年来已采用TNF基因治疗开始对黑素瘤等肿瘤进行临床验证。TNF还与一些临床某些疾病的病变程度有关，例如大骨节病、结肠炎、脑膜炎以及哮喘等等，临床上可通过检测TNF-α等生化指标来分析疾病的发生程度。过去以放免为代表的检测肿瘤坏死因子的检测试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法， 抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种定量检测TNF-α的诊断试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行TNF-α检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
本发明提供的试剂盒，其包含的试剂有TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物。所述的磁分离试剂含有标记有TNF-α单克隆抗体的磁性微球。所述的酶标抗体是含有辣根过氧化物酶标记的TNF- α单克隆抗体。所述的增强剂是含有Tris的缓冲液。所述的校准品及控制品是含有一定量的TNF-α抗原的溶液。所述浓缩液是含有TWEEN-20和ftx)clin-300的缓冲液。所述的底物为酶促化学发光底物。本发明TNF-α的定量检测试剂盒，优选通过如下步骤制备而成第一步磁分离试剂的制备步骤1、将1. Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取^igTNF-α单克隆抗体溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；2、用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中， 置室温90min ；3、将步骤2抗体溶液加入到浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重复操作3次； 将步骤3获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混勻后室温反应4小时；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分钟；7、每次加入1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已经标记的磁珠，混勻30秒，上架，去
上清，重复操作3次；8、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为(均为质量体积比)0. 1% BSA,0. 05%吐温-20，0. 02% NaN3，20% 乙醇，4°C保存。9、将步骤8获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1 1的体积比例混勻，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是lmol/L的TRIS-HCl缓冲液。第二步酶标抗体制备步骤1、2. 5mgTNF-a单克隆抗体溶于1. Oml的N，N_二甲基甲酰胺中，加入Iml的IOmg/ ml辣根过氧化物酶水溶液和1. 3mg碳化二亚胺，1小时后将1. 0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4°C过夜；2、将步骤1的溶液装入透析袋中，对0. 15M的PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；然后加入IOml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4°C储存备用；最后将收集到的辣根过氧化物酶与TNF-a单克隆抗体的偶联物用酶标抗体稀释液以1 1000的体积比混合均勻，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是lmol/L的TRIS-HCl缓冲液。第三步增强剂配制步骤1、称取TRIS1. 56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器将Proclin-300量取 0. 2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中； 2、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH 在 7. 35-7. 45 之间；3、称取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤
器过滤ο第四步校准品和控制品的配制校准品浓度分别为0. 10,0. 20,0. 40,0. 80、1. 60ng/ml ；控制品浓度分别为0. 20、 0.80ng/mlo第五步浓缩液配制步骤，配制IL 1、称取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、称取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容
器中；3、用移液器将Proclin-300量取0. 2ml于盛有IOml纯化水的烧杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解；5、调PH，控制其范围在7. 35-7. 45之间；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um滤器过滤即得。第六步底物配制步骤，配制IL 1、称取 TRIS 2.35g、NaCl 6. 41g、Nei2SO3O. 002g 和 Proclin-3000· 2ml 于 IL 烧杯中；2、用量筒量取600ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7. 95-8. 05之间；3、加入250ml Lumi-Phos 530后，用0. 2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混勻后即得。本发明的主要创新之处在于1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。2、本发明公开了一种新的专用增强剂以及浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠， 实验数据灵敏有效，可精确到O.Olng，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；3、本试剂盒中的TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。4、本试剂盒采用免疫磁微粒分离技术与竞争酶联免疫技术结合，与现有技术的试剂盒相比，大大缩短了检测时间，可以在10分钟内检测数个生物样本，对于尿液、血清等样本可以不需前处理直接进行检测。
具体实施方式
实施例1、一、TNF-α磁分离试剂制备步骤1、将1. Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取^igTNF-α单克隆抗体 (Santa Cruz公司产品)溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；2、用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中， 置室温90min ；3、将步骤2的溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；磁珠为本领域常用磁珠，优选浓度25mg/mL，直径为800nm。5、每次加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重复操作3次； 将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混勻后室温反应4小时；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分钟；7、每次加入1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已经标记的磁珠，混勻30秒，上架，去
上清，重复操作3次；8、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为0. 1 % BSA, 0. 05 %吐温-20，0. 02 % NaN3, 20 %乙醇(均为质量体积比)，4°C保存。9、将步骤8获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1 1的体积比例混勻，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是lmol/L的TRIS-HCl缓冲液。实施例2一、酶标抗体的制备步骤1、2. 5mgTNF-a单克隆抗体溶于1. Oml的N，N_二甲基甲酰胺中，加入Iml的IOmg/ ml辣根过氧化物酶水溶液和1. 3mg碳化二亚胺，1小时后将1. 0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4°C过夜；2、将步骤1的溶液装入透析袋中，对0. 15M的PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；然后加入IOml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4°C储存备用；最后将收集到的辣根过氧化物酶与TNF-a单克隆抗体的偶联物用酶标抗体稀释液以1 1000的体积比混合均勻，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是lmol/L的TRIS-HCl缓冲液。实施例3增强剂配制步骤1、称取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器将ftx)clin-300量取 0. 2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之间；3、称取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤器过滤。Mak33是罗氏公司的商品化的试剂。实施例4校准品和控制品的配制步骤1、最高点最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为表权利要求
1. 一种定量检测TNF-α的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物；所述试剂盒按照如下方法制备而成第一步TNF-α磁分离试剂的制备步骤1)将1.Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取^igTNF-α单克隆抗体溶于 PH 9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；2)用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温 90min ；3)将步骤2获得的溶液加入到浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩 30min至体积为0. 5ml ；4)取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；5)加入步骤3获得的抗体溶液，混勻后室温反应4小时；6)加入0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分钟；7)加入1.5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已经标记的磁珠，混勻30秒，上架，去上清；8)用IOOml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为0.1 % BSA, 0. 05%吐温-20，0. 02% NaN3，20% 乙醇，4°C保存；9)将步骤8获得的溶液用磁珠缓冲液按照1 1的体积比例混勻，即得试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是lmol/L的TRIS-HCl缓冲液。第二步酶标抗体制备步骤1)2.5mgTNF- α单克隆抗体溶于1. Oml的N，N- 二甲基甲酰胺中，加入Iml的10mg/ml 辣根过氧化物酶水溶液和1. 3mg碳化二亚胺，1小时后将1. 0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4°C过夜；2)将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液； 然后加入IOml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4°C储存备用；最后将上述溶液用酶标抗体稀释液以1 1000的体积比混合均勻，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是lmol/L的 TRIS-HCl缓冲液。第三步增强剂配制步骤1)称取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器将Proclin_300量取0. 2ml 于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2)用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH在 7. 35-7. 45 之间；3)称取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um滤器过滤ο第四步校准品和控制品的配制将TNF-α配制浓度分别为0. 10,0. 20,0. 40,0. 80、1. 60ng/ml的校准品；将TNF-α配制成浓度分别为0. 20,0. 80ng/ml的控制品。第五步浓缩液配制步骤，配制IL :1)称取 TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2)称取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；3)用移液器将ftx)Clin-300量取0.2ml于盛有IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；4)用量筒量取800ml纯化水于上述IL容器中，充分搅拌，直至完全溶解；5)调PH，控制其范围在7.35-7. 45之间；6)最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。 第六步底物配制步骤，配制IL :1)称取TRIS 2. 35g、NaCl 6. 41g、Na2SO3O. 002g 和 Proclin-3000. 2ml 于 IL 烧杯中；2)用量筒量取600ml纯化水于IL烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH在7.95-8. 05 之间；3)加入250mlLumi-Phos 530后，用0. 2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至 1000ml，混勻后即得。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下1)、加15μ 1 TNF-α校准品、TNF-α控制品、待测标本至对应试管底部；2)、加25μ 1酶标抗体至每一试管中；3)、加25μ 1增强剂至每一试管中；4)、加25μ 1磁分离试剂至每一试管中；5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混勻器轻轻振荡试管架30s后，置37°C水浴30分钟；6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，倒转分离器倒出上清液；7)、浓缩液用纯化水稀释10倍后，加100μ 1稀释后的浓缩液至每一试管中，置多管混勻器上轻轻振荡混勻30s ；8)、加100μ 1底物溶液至试管中混勻3秒，发光检测仪检测。
3.如权利要求1或者2所述的试剂盒在诊断疾病中的应用。
全文摘要
本发明公开了定量检测肿瘤坏死因子α的诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒包含TNF-α磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物。本发明试剂盒采用免疫磁微粒分离技术与竞争酶联免疫技术结合，具有更高的检测灵敏度和特异性，并且大大缩短了检测时间，可以在10分钟内检测数个生物样本，对于尿液、血清等样本可以不需前处理直接进行检测。
文档编号G01N33/535GK102495215SQ201110399728
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者任庆远, 李守玮 申请人:任庆远, 李守玮