专利名称：一种热带假丝酵母菌pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种热带假丝酵母菌菌株PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
近年来，由于广谱抗生素的广泛应用，肿瘤化疗、器官移植的开展以及免疫力低下患者尤其是艾滋病患者的增多，由真菌尤其是念珠菌引起的深部感染机会日益增多。念珠菌属于真菌界-半知菌亚门-芽孢菌纲-隐球酵母目-隐球酵母科。是双相型单细胞酵母菌。念珠菌是一种芽生的酵母状真菌，一种典型的条件致病菌。已知可以致病的常见念珠菌有白念(Candida albican)、热带(Candida tropicalis)、近平滑 (Candida, parapsilosis)、胃· (Candida krusei)(Candida stellatoidea)、_iii 蒙(Candida guilliermondii)和光滑念珠菌(Candida, glabrata)等八种在人体中，无症状时常表现为酵母细胞型；侵犯组织和出现症状时常表现菌丝型。念珠菌是一种腐物寄生菌，广泛存在于自然界。是人体正常菌群之一，平时主要生存于人体的口腔、皮肤、粘膜、消化道、阴道及其他脏器中。正常人群白色的带菌率可高达 40%;从阴道粘膜分离出来的念珠菌85% 90%为白色，而白色念珠菌(Candida albican) 的致病性最强。白色念珠菌(简称白念，Candida albicans, CA)、热带假丝酵母菌(简称热带， Candida tropicalis, CT)和光滑假丝酵母菌(简称光滑，Candida glabrata, CG)是其中的主要致病菌，其分布广泛，感染类型多样，已成为临床抗感染治疗的难点。目前临床应用的念珠菌的检测方法有以下几种常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉，当天出结果；缺点是敏感性低，特异性差，无法辨别死菌与活菌。通常需用科玛嘉念珠菌显色培养基进一步证实。沙氏培养基是念珠菌感染诊断较为常用的培养基，但临床上念珠菌感染症有的为混合感染，不同的念珠菌在沙氏培养基上生长均呈现白色菌落，要进一步鉴定不同的菌种， 有时还必须要做念珠菌的发酵试验和芽管试验，给实验室的诊断带来很大的不便。科玛嘉(CHROMagar)培养基培养法，该培养基含有特殊显色物质，无需通过任何仪器，仅通过观察菌落颜色即能在M 48小时(大多为48小时，30 37°C )用肉眼对念珠菌等进行定性和定量分析。但是培养所用的时间相对较长，不利于快速诊断。另外，随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等。 这些快速鉴定系统大多数是应用于临床酵母菌的鉴定，如假丝酵母属、隐球酵母属等，针对性较强，能鉴定的酵母菌种类较少，其中API 20C能鉴定的酵母菌种类为37种，ATB 32C能鉴定的酵母菌种类为69种。虽然，目前我国已累计引进Biolog微生物自动分析系统有100
3余台，但主要是应用于细菌的鉴定分析，应用于酵母菌鉴定的研究成果很少。乳胶凝集反应、放免测定以及酶联免疫吸附测定，也可以作为念珠菌的辅助检测手段，但它们的敏感性和特异性均较差。RAPD分型法，又称任意引物聚合酶链反应(Arbitrarily primed PCR)，AP-PCR)， 是一种以PCR为基础揭示基因组多态性的方法。该法采用随机合成的单个寡核苷酸引物。 在未知模板DNA序列情况下，以低退火温度与基因DNA两条链的多个非特异位点通过错配而复性，扩增产物经琼脂凝胶电泳分离产生指纹图谱。由于不同种细菌或同种细菌的不同菌株与引物结合的退火点的亲和性、数量和位置不同，所产生的指纹图谱均有各自的特征， 以此反映种系发育过程中的相互联系及不同克隆间的差异。该方法目前在日常医院感染的监测与预防控制中占主导地位，但存在分辨率低、 影响因素多、重复性较差等诸多不足。
发明内容
本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对热带假丝酵母菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断热带假丝酵母菌的存在，对热带假丝酵母菌感染的辅助诊断。本发明的技术方案为提供一种热带假丝酵母菌核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物A和下游引物A;所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，所述荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。优选的，所述试剂盒还包括DNA提取液，dNTPs、tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。优选的，所述dNTPs 包括 dATP、dCTP、dGTP、dUTP。优选的，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、正辛酸， 所述聚乙二醇辛基苯基醚的质量百分数为2%，所述乙基苯基聚乙二醇的质量百分数为 1%，所述正辛酸的摩尔浓度为0. 04M。优选的，所述试剂盒还包括提取固形物，所述提取固形物为直径0. 5mm和1. Omm两种玻璃珠，按质量配比9 1比例配制出。优选的，所述试剂盒引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物B核苷酸序列SEQ IDN0. 4 ；下游引物B核苷酸序列 SEQ ID NO. 5 ；荧光探针B核苷酸序列=SEQ ID NO. 6。优选的，所述荧光探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。本发明的有益效果为利用热带假丝酵母菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断热带假丝酵母菌的存在。本试剂盒具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短O 3小时)，结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。最低检出限为1. 0 X IO2Copies/ mL，具有灵敏度高和特异性高等优点。使用了大肠杆菌新霉素基因作为内参照基因，它在热带假丝酵母菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。
图1 :CT基因灵敏度检测结果图；图2 =CT基因精密度结果图；图3 =CT基因特异性结果图。
具体实施例方式本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(Molec μ LA. r beacon) 技术对热带假丝酵母菌(简称热带，Candida tropicalis,CT)基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断热带假丝酵母菌的存在。从而指导临床医生对热带假丝酵母菌感染的病人用药，帮助预后判断。上述高保守特异性核酸序列如SEQ ID NO. 7所示，其核苷酸序列如下GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCCCGGG TTTGGTGTTGAGCAATACGCTAGGTTTGTTTGAAAGAATTTAACGTGGAAACTTATTTTAAGCGACTTAGGTTTATC CAAAACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAATTTATTTCATAACTTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。内参照原理试剂盒设置了内参照，该内参照为含大肠埃希氏菌新霉素基因(neo 基因)的质粒，neo基因在念珠菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了 ；但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。阳性对照原理每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。阴性对照原理为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。实施例1本发明试剂盒的组成主要原材料来源及制备方法Tris 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7%，红外合格，pH(5% 水)10. 3-10. 9，水份0. 3%，熔点167-171°c，吸收系统合格，杂质最高含量合格。MgCl2 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量不少于99%，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。(MgC12极易吸潮，启用新瓶后放于干燥器下保存)。EDTA 分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99. 5 %，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。HCl 分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。纯化水购买乐百氏桶装纯净水，然后经Millipore公司的Milli-Q Biocel型纯水机处理，电阻率16 18ΜΩ。引物和探针本发明所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；其中CT基因保守序列最优引物、探针序列组合如下5， -GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-3，；所述下游引物A的核苷酸序列为5， -ATTGCTCAACACCAAACCCG-3‘；所述荧光探针A的核苷酸序列为5’ -FAM-ACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCG-BHQ-3，。其中neo内参照系统的引物、探针序列组合如下上游引物B (SEQ ID NO. 4) :5，-GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物B (SEQ ID NO. 5) :5，-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；荧光探针B (SEQ ID NO. 6) 5，-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-3，。用于PCR反应的引物，紫外检测结果A260nm:A280nm彡1.5可视为合格引物。_20°C保存。荧光探针A 在寡核苷酸5’端标记FAM，3，端标记BHQ，紫外检测结果A260nm A280nm彡1. 5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，-20°C保存。neo荧光探针B:在寡核苷酸5’端标记TE&d，3’端标记BHQ，紫外检测结果 A260nm :A280nm彡1. 5，在TE)(rd荧光素的激发波长610nm处有吸收峰。_20°C保存。dNTPs :dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司，或其他有合格资质的供应商， 并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。根据供应商质量标准为HPLC纯，无DNase和RNase污染。_20°C保存。Taq酶本产品在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司， 或其他有合格资质的供应商。浓度5υ/μ 1，含10XPCRBuffer、25mmOl/LMgCl2，根据供应商质量标准本品具有DNA聚合酶活性，无3’ 一5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94V保温1小时后仍保持50 %活性。-20 V保存。UNG酶本产品在研制开发及生产过程中，所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。浓度> lU/μ 1， 根据供应商质量标准本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性， IUUNG在50°C 2min能降解至少IO3Copies含dU的模板，使其不能产生扩增产物。_20°C保存。基础试剂配制10 X浓缩清洗液A 配制0. 2N NaOH, 5mL/管分装；10 X浓缩清洗液B 配制10 X TE缓冲液(ρΗ8· 0)，IOmL/管分装；DNA 提取液按"Triton X-100 2%, NP-40 1 %、正辛酸0. 04M浓度配制成DNA提取液，充分混勻后按5mL/管分装。提取固形物取直径为0. 5mm和1. Omm两种玻璃珠，按质量配比约为0.5mm LOmm = 9 1比例配制出提取固形物，每管约0. 15g分装。IOmmol/L iTris-HCl溶液的配制称取0. 12114g的Tris，加入已含60mL蒸馏水的 IOOmL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入IOOmL的容量瓶中，用IOmL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8. 0，最后用蒸馏水定容到IOOmL,翻转容量瓶使之充分混勻。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。dNIPs的配制如表1。表 权利要求
1.一种热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物A和下游引物A ；所述上游引物A的核苷酸序列为5’ -GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT-3，；所述下游引物A的核苷酸序列为5' -ATTGCTCAACACCAAACCCG-3‘；所述荧光探针A的核苷酸序列为5’ -FAM-ACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCG-BHQ-3’。
2.按权利要求1所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取液，dNTPs、tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。
3.按权利要求2所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述dNIPs包括 dATP、dCTP、dGTP、dUTP。
4.按权利要求2所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇、正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚的质量百分数为2%，所述乙基苯基聚乙二醇的质量百分数为1%，所述正辛酸的摩尔浓度为 0. 04M。
5.按权利要求1所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括提取固形物，所述提取固形物为直径0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比9 1比例配制出。
6.按权利要求1所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统的引物、探针序列组合如下上游引物 B :5’ -GACTAAACTGGCTGACGG-3，；下游引物 B :5’ -GTATTTCGTCTCGCTCAG-3，；荧光探针 B :5，-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-S'
7.按权利要求1所述的热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的 5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。
8.一种热带假丝酵母菌PCR检测方法，其特征在于，其中PCR扩增的靶序列如SEQ ID NO. 7，PCR扩增所用引物为上游引物A序列如SEQ ID NO. 1，下游引物A序列如SEQ ID NO. 2，荧光探针A序列如=SEQ ID NO. 3。
全文摘要
本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒。本发明的技术方案为提供一种热带假丝酵母菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物和荧光探针A，所述引物分为上游引物A和下游引物A；所述上游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
文档编号G01N21/64GK102409107SQ20111041670
公开日2012年4月11日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者何华东, 黄发平 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司