专利名称：测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫 球方法
技术领域：
本发明涉及一种测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(H. pylori)属螺杆菌属，它是一种在人胃肠道发现的细菌，已经发现它与人胃十二指肠疾病如胃炎、消化性溃疡、胃癌和其它疾病有密切关系。已经有许多不同的技术用于幽门螺杆菌的测定。依据取材有无创伤性，目前，幽门螺杆菌感染的临床诊断方法可分为两大类①无创检查包括血清学方法、同位素标记尿素的呼气试验和胃液聚合酶链反应等。②创伤性检查均为胃镜依赖方法，包括多种形态学、微生物学和分子生物学技术等。对于有创检查，已经做胃肠镜检查后的所获得的胃黏膜活检标本，目前主要采用快速尿素酶法和病理检测两种方法检查可能存在的幽门螺杆菌。一般而言，这两个检测方法具有较高的一致性，但是，并不是可以相互取代，仍然有不一致的地方。不一致的原因可有(1)H. pylori胃内分布有差异，快速尿素酶法是检测一块组织。存在标本取样能否取到的问题，而病理只是一块组织的几块切片，取样的问题更为突出。( 尿素酶活性和 H. pylori的不一致。虽然H. pylori能够产生大量很高活性的尿素酶，而其他细菌罕有如此高尿素酶活性。但是目前发现，抑酸药物、一些抗菌素等会影响尿素酶试验，而抑酸药物有可能为患者服用。(3)pH法，因为其他混杂的尿素酶，颜色判断的视觉误差等存在假阳性。病理形态学上可有其他相似的螺杆菌、弧菌等干扰。正是因为这个原因，1999年4月中华医学会消化病学分会在《幽门螺杆菌若干问题共识意见》中提出，H. pylori培养阳性或下列4项中任2项阳性者，诊断为H. pylori阳性(I)H. pylori形态学(涂片、组织学染色或免疫组法染色)；( 尿素酶依赖试验(快速尿素酶试验)；C3)血清学试验(ELISA或免疫印迹试验等)；(4)特异的PCR检测。H. pylori感染的临床诊断标准，下列2项中任1项阳性者，诊断为H. pylori阳性(I)H. pylori形态学(涂片或组织学染色)；( 尿素酶依赖性试验(快速尿素酶试验，13C-UBT实验)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种解决现有技术中所采用的试剂和仪器成本高、操作费时、假阳性和假阴性高等问题的一种采用免疫微球技术测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌方法。本发明提供一种测定一种采用免疫微球技术测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌方法， 它包括(a)形成免疫微球具体方法有2种方式①把抗幽门螺杆菌的抗体标记微球，形成免疫微球；或②把幽门螺杆菌抗原标记微球，形成免疫微球；
(b)制作含有检测组织的样品缓冲液；
(c)①将步骤(a)①所述已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含胃黏膜的样品缓冲液混合；
或②将抗幽门螺杆菌抗体与含胃黏膜的样品缓冲液混合，然后加入步骤(a)②所述的幽门螺杆菌抗原标记的微球；
(d)检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌。
其中，样品缓冲液的制作方式为将怀疑含有幽门螺杆菌的胃黏膜样品悬浮于含有蛋白质和碱性物质的缓冲液中制备而成。
本发明的优点如下比传统的ELISA和RT-PCR方法方便快捷。能克服前述尿素酶依赖试验的假阴性。我们的试验显示，对于近期已服用制酸剂、铋剂或抗生素患者乳胶凝集试验和幽门螺杆菌荧光定量PCR具有同样地检测效能，而且前者具有后者所没有的价格低廉、方便快捷等优点，为胃镜室床旁快速检测的较优选择。
具体实施方式
本发明为一种测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，它包括
(a)形成免疫微球
具体方法有2种方式
①把抗幽门螺杆菌的抗体标记微球，形成免疫微球,用来标记微球的抗体可以是多克隆抗体，也可以是各种单克隆抗体或其混合，优选方案将采用多克隆抗体。
或②把幽门螺杆菌抗原标记微球，
其中，用来标记的微球颗粒为动物或人红细胞、细菌、高分子聚合颗粒、树脂、皂土、明胶颗粒、活性炭、火棉胶、玻璃微粒、分散染料颗粒中的一种或几种的混合。优选方案中将采用胶乳和红细胞，其中胶乳的种类很多，目前常用的是聚苯乙烯胶乳，现有市场上已有各种规格的商品化的胶乳。本发明采用的胶乳直径以0. 2 I. 5微米为优。
上述抗体或抗原标记微球的方法有数种物理吸附、化学交联和间接法等，上述的方法都是为现有常见手段。在实施时应根据微球的具体特点和抗体的特性进行选择。
(b)制作含有检测组织的样品缓冲液；
(C)①将步骤(a)①所述已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含胃黏膜的样品缓冲液混合；
或②将抗幽门螺杆菌抗体与含胃黏膜的样品缓冲液混合，然后加入步骤(a)②所述的幽门螺杆菌抗原标记的微球；
(d)检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌。
其特征在于样品缓冲液的制作方式为将怀疑含有幽门螺杆菌的胃黏膜样品悬浮于含有蛋白质和碱性物质的缓冲液中制备而成。
具体方式为将一定量活检的胃黏膜样品按适当比例稀释于样品缓冲液中，充分搅拌混匀，低速离心数分钟，取上清液，待测。其中的样品缓冲液应含有蛋白质，可减少非特异性反应，为了中和胃黏膜样品中的酸性物质，故为样品缓冲液内还设有碱性物质；另外还应含胃蛋白酶抑制剂如抑肽素、硫柳汞、叠氮钠等。
其中蛋白质成分选自胎牛血清、羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶、牛血清白蛋白、人血清白蛋白的一种或几种混合。
所述的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1_哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗非啉)乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，由碱性物质配制而成的缓冲液其pH大于8。
在样品缓冲液中还设有洗涤剂，所述的洗涤剂为吐温-20或聚乙二醇辛基苯基醚。同样是为了减少非特异性反应，所以在样品缓冲液中还设有洗涤剂。在样品稀释液中还含有胃蛋白酶抑制剂，所述的胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞、叠氮钠中的一种或几种的混合物。
将含胃黏膜的样品缓冲液针对幽门螺杆菌进行浓集处理，其中浓集处理的具体方法是将含有胃黏膜样品的缓冲液进行离心或过滤浓集处理。浓集处理的目的是为了提高检测敏感度。
检测胃黏膜样品中可能存在的幽门螺杆菌的免疫微球方法有直接法和间接法。直接法是指将抗幽门螺杆菌抗体标记微球，形成免疫微球；直接将免疫微球与含胃黏膜的样品缓冲液混合，检测与免疫微球结合的幽门螺杆菌，如凝集反应、免疫花环、检测免疫微球与缓冲液混合前后缓冲液物理或化学特性的改变(如颜色、浊度、通透性等)、检测免疫微球与缓冲液混合前后微球数量以及物理特性的改变(游离的微球的浓度)等。间接方法通常有凝集抑制反应，其原理是幽门螺杆菌抗原标记的微球与一定量抗该细菌的抗体结合而出现凝集反应，当存在该细菌感染时，胃黏膜中的幽门螺杆菌抗原竞争与抗体结合，从而抑制幽门螺杆菌抗原标记微球的凝集。
直接法中凝集反应的操作步骤如下检测(a)①与免疫微球结合的幽门螺杆菌的方法为将(C)①混合液体连续摇动I分钟以上，观察结果出现凝集颗粒的为阳性反应， 说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌；保持均匀乳液状为阴性反应，说明胃黏膜品中无幽门螺杆菌或者量很少。
直接法中免疫花环的操作步骤如下检测(a)①与免疫微球结合的幽门螺杆菌的方法为将(c)①混合液体置室温或37°C保温5分钟以上，取一部分液体染色，在显微镜下检测免疫花环，免疫微球吸咐在幽门螺杆菌的周围形成花环，如此花环存在则可间接推测样品中存在幽门螺杆菌；反之则无幽门螺杆菌或者量很少。
直接法中检测免疫微球与缓冲液混合前后缓冲液物理或化学特性的改变的操作步骤如下检测(a)①与免疫微球结合的幽门螺杆菌的方法为检测(C)①免疫微球与样品缓冲液混合前后缓冲液的散射光强度、粒子数以及浊度的改变，从而推测胃黏膜样品中可能存在幽门螺杆菌。
间接方法通常有凝集抑制反应，其原理是幽门螺杆菌抗原标记的微球先与一定量抗该细菌的抗体结合而出现凝集反应，当存在该细菌感染时，胃黏膜中的幽门螺杆菌抗原竞争与抗体结合，从而抑制幽门螺杆菌抗原标记微球的凝集。
间接方法中凝集抑制反应的操作步骤如下将(C)②中的抗幽门螺杆菌抗体，含胃黏膜的样品缓冲液及幽门螺杆菌抗原标记的微球充分混合、连续摇动I分钟以上，观察结果出现凝集颗粒的为阴性反应，说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少；保持均勻乳液状为阳性反应，说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌。在本发明使用了抗幽门螺杆菌的抗体，有单克隆抗体和多克隆抗体两种，常用的为多克隆抗体。这些抗体能够从致敏的动物的血清中获得。目前国内外已有多家公司可提供商品化的抗幽门螺杆菌的抗体，可以较经济的价格获得。中国专利(申请号97103112. 6) 已详细描述幽门螺杆菌抗体的制备方法。在此仅简述如下把幽门螺杆菌抗原注射到哺乳动物如兔、羊等体内，多次注射适当剂量的抗原，验证试验动物已产生抗幽门螺杆菌抗体， 取试验动物血清，经纯化即可得到所需抗体。以下对抗体或抗原标记微球的方法进行概述抗体或抗原标记微球的方法有物理吸附和化学交联等。物理吸附是利用胶乳颗粒表面的带电性，物理吸附方法操作简单方便，但这种结合的牢固度往往较差。随着致敏试剂保存期的延长，脱落比较明显。化学交联指采用含有化学活性基团的胶乳作为载体，抗体或抗原以化学键共价交联在胶乳表面。这种化学交联的性能稳定，保存期长，使用效果有明显提高。胶乳的表面活性基团可以是羧基、氨基或一些其它具有化学活性的基团，它与蛋白质抗原或抗体的结合可以通过缩合剂来完成。将抗体或抗原结合在微球上的技术是本领域普通技术人员所熟知的。具体的物理吸附法、化学交联法如下A、物理吸附法先用蒸馏水将胶乳悬液稀释至适当浓度，继将抗体或抗原溶于缓冲液后，逐滴加入稀释的胶乳悬液中，摇动使之充分混和。混合后可放置室温或37°C，保温一定时间。吸附完成后，离心沉淀，除去游离在上清液中的末吸附物，倾去上清液后，沉淀用缓冲液重新恢复悬浮状态。加入牛血清白蛋白或水解明胶等，使胶乳表面的吸附能力充分饱和，减少非特异性反应；并应严格避免在吸附过程中发生胶乳自凝。B、化学交联法带活性基团的微球可采用化学交联法与抗体或抗原结合。不同活性基团其交联方法有所不同。如羧化聚苯乙烯胶乳采用化学交联法与抗体或抗原结合。为了提高交联效果，通常先给胶乳引入“手臂”。如将抗体直接紧贴地交联在羧化聚苯乙烯胶乳上，由于空间位阻，妨碍它与相应的抗原起反应。因此先接上“手臂” ￡_氨基己酸，以增大配基与载体表面的距离，这样制成的免疫微球敏感度和特异性均高于物理吸附的，试剂的稳定性也显著提高。胶乳上的氨基和被交联物上的氨基是通过缩合剂碳化二亚胺来完成。其中胃黏膜样品的样品缓冲液详细制备参数将一定量胃黏膜按适当比例稀释于样品缓冲液中，充分搅拌混勻，离心，如采用200-500转/分，3-15分钟，取上清液，待测。也可以不离心，采用过滤方法，去除可能的沉淀和颗粒等感染凝集反应。为提高检测敏感度可将含胃黏膜的样品缓冲液针对幽门螺杆菌进行离心或过滤等浓集处理。将该上清液以大于 4000转/分的速度，离心10分钟以上，去上清液，将沉淀再打散、混勻，待测。其中的样品缓冲液应含有蛋白质及洗涤剂，可减少非特异性反应。蛋白质成分可选自胎牛血清、羊血清、 豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、脱脂奶粉等。洗涤剂可含有吐温-20(Tween-20)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-IOO)等。为对抗胃黏膜样品所含的酸性液体，样品缓冲液应含碱性物质，为PH大于8的缓冲液。常见的碱性生物缓冲液有三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸(Tricine)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐(HEPES)、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、3_(N_吗非啉)乙磺酸 (MOPS)。
在样品稀释液中还含有胃蛋白酶抑制剂，所述的胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞、叠氮钠中的一种或几种的混合物。
以下是对本发明实施例中出现的检测检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌的检测方法进行简单概述
凝集试验分试管法与玻片法。玻片法操作简便，一定体积上述方法制备胃黏膜样品(为提高灵敏度通常要将样品浓集处理)和等体积抗幽门螺杆菌抗体致敏的胶乳试剂在玻片(一般为黑色背景)上混匀后，连续摇动I分钟以上，即可观察结果。出现凝集颗粒的为阳性反应，说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌；保持均匀乳液状为阴性反应，说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少。
免疫微球花环形成试验
取一定体积上述方法制备胃黏膜样品和等量的抗幽门螺杆菌抗体致敏的免疫微球试剂在小试管中，混合后置室温或37°C孵育10-40分钟。以磷酸盐缓冲液离心洗涤2次， 取末次沉淀细胞一滴置载玻片上，然后染色，在显微镜下检测免疫花环。显微镜下，幽门螺杆菌的典型形态为s状、海鸥状弯曲。如果有免疫花环形成，则在细菌的四周有免疫微球粘附，似花环一样，故称免疫微球花环试验。如果发现S状或海鸥状弯曲的被染色细菌，同时在其四周有2 3个以上的微球粘附，则表示花环试验阳性，据此可推测该胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌；如未发现免疫花环形成，则说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少。
检测缓冲液的物理或化学特性改变的方法，常用的有浊度法。浊度法是根据抗幽门螺杆菌抗体致敏的免疫微粒与其相应的抗原结合后形成凝集颗粒，使反应混合物系统的浊度变小，透射光增强，浊度的改变与幽门螺杆菌的浓度呈函数关系，由此可测出样品中幽门螺杆菌的量。可利用实验室常用分光光度计以340-500纳米波长的入射光进行测定， 亦可用光散射法测定凝集颗粒在某一角度的射光强度的改变，检测灵敏度高于透射光浊度法。浊度法的灵敏度比粒子计数法约低1-2倍，但己能满足定量测定要求。
检测免疫微球与缓冲液混合前后微球数量以及物理特性的改变。常用的方法有粒子计数法。粒子计数法的原理是根据包被了抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球，与其相应的抗原结合发生凝集反应，使原来处于分散状态的免疫微球数量减少。被测物浓度越高，凝集反应愈强，游离免疫微球数量愈少，通过计数反应前后游离状态免疫微球数量的变化，就能对样品中被测物-幽门螺杆菌作出定量分析。该方法操作简便，检测灵敏度高，一般为 0. 1-lng/ml范围；所用仪器设备可以和临床实验室常用的血细胞计数仪及生化自动分析仪系统通用。
下面结合具体试验数据对本发明进行说明
现有的胃黏膜免疫病理检测幽门螺杆菌和本发明所述乳胶凝集进行检测的结果对比。结果显示，两种方法没有显著性差异，本发明所述乳胶凝集方法与胃黏膜免疫病理检测幽门螺杆菌检测效能相当。以下通过一些非限定性实施例对本发明作进一步说明。制备检测组织的样品缓冲液的实施例以及检测幽门螺杆菌存在与否的方法实施例，其他在操作步骤属于在说明书上文中已经做出表述，本技术领域人员容易通过上述表述进行操作。
(一)、常见碱性溶液配制
本发明涉及的采用碱性生物缓冲液的配制方法如下1、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液HEPES 分子式=C8H18N2O4S 分子量238. 3每IOOOml去离子水中加入2 5克HEPES，待溶后用IN NaOH调pH至8. 2 9. 15 范围之间，滤过除菌后使用。 2、硼砂-氯化钙缓冲液取硼砂0. 3 2g与氯化钙2 5g，加水约800ml溶解后，用lmol/L盐酸溶液约 2. 5ml调节pH值至8. 0-9. 5，加水稀释至IOOOml，即得。3、硼酸-氯化钾缓冲液(pH8. 0 9. 5)取硼酸2. 7 5. Og,加0. lmol/L氯化钾溶液500ml使溶解，再加0. lmol/L氢氧化钠溶液210ml，即得。4、甘氨酸缓冲液配制甘氨酸缓冲液6 8克甘氨酸、9 12克氯化钠溶于蒸馏水，用lmol/L氢氧化钠调节PH值至8. 2 9. 15，蒸馏水补足至1升。(二)、样品稀释液的配制样品稀释液的配制方法如下在上述碱性液体IOOml加上Ig牛血清白蛋白 (BSA)，加入适量(终浓度为0. 01% 0. 02% )硫柳汞或(终浓度为0. 01 0. )叠氮钠，再加上 0. 05 2% 的 Triton X—100 禾口 / 或 Tween 20，。关于形成免疫微球的方法实施例1 物理方法致敏微球材料准备直径0. 6 1. 2微米的聚苯乙烯微球(可直接购买)、羊抗幽门螺杆菌的多克隆抗体、幽门螺杆菌抗原(抗原标准品或可溶性抗原，该抗原可直接购买)。缓冲液配制0. 27mol/L甘氨酸缓冲液7. 51克甘氨酸、9. 95克氯化钠溶于蒸馏水，用lmol/L 氢氧化钠调至PH8. 2，蒸馏水补足至1升。0. 27mol/L甘氨酸缓冲液+1 %人血清白蛋白1克人血清白蛋白溶于100毫升 0. 27mol/L甘氨酸缓冲液。0.054mol/L甘氨酸缓冲液用蒸馏水将0.27mol/L甘氨酸缓冲液作1 5稀释即可。先用蒸馏水将1毫升10%的胶乳悬液稀释至1-2%，用0. 054mol/L甘氨酸缓冲液将乳胶洗压积3次(3000g离心20分钟)。然后重新悬浮于10毫升0. 054mol/L甘氨酸缓冲液，逐渐将1毫克抗体或抗原加入稀释的胶乳悬液中，摇动使之充分混和。(1%胶乳悬液 Iml 一般能吸附0. 1 Img物质)。混合后可放置室温或37°C保温，时间一般为30-60分钟。吸附完成后，10，OOOg离心沉淀30分钟，除去游离在上清液中的末吸附物，倾去上清液， 沉淀用0. 27mol/L甘氨酸缓冲液+1%人血清白蛋白缓冲液恢复悬浮状态。加0. 04%叠氮钠，于4°C保存，备用。形成免疫微球的方法实施例2 化学交联法致敏微球所需溶液配制0. lmol/LpH5. 3醋酸盐缓冲液0. lmol/L醋酸10毫升，0. lmol/L醋酸钠40毫升。Tris 缓冲液0. 05mol/L Tris 0. Imol 氯化钠。
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带醛基的聚醛基聚苯乙烯微球1%乳胶I毫升加0. I毫克抗体或抗原，加10毫升0.lmol/LpH5. 3醋酸盐缓冲液。室温下，使容器搅拌10小时，然后IOOOOg离心20分钟，去上清液。沉淀加10毫升pH 9. 51mol/L乙醇胺含0. 1% Tween-20。搅拌3小时，然后IOOOOg 离心20分钟，去上清液。沉淀加10毫升Tris缓冲液，搅拌24小时，离心IOOOOg 20分钟， 去上清液。加入含1%人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液10毫升，重新悬浮；加0. 04%叠氮钠， 于4°C保存，备用。
制作含有检测组织的样品缓冲液的实施例I :胃黏膜样品准备
将胃黏膜样品按I : 4或I : 6稀释，将适当胃黏膜样品加入样品缓冲液中，充分混合。200转/分，离心3分钟。取上清液，待测。在采用凝集反应以及凝集抑制反应检测幽门螺杆菌时，为提高检测灵敏度，可将样品浓集处理，将该液体12000g离心15分钟，去上清液，将沉淀再打散、混匀，待测。
样品缓冲液100毫升0. 27mol/L甘氨酸缓冲液，加入人血清白蛋白I克，加 Tween-203毫升，同时加0. 04%叠氮钠。
检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌的方法实施例I :采用乳胶凝集反应。
凝集试验(采用玻片法)12cmX 16cm玻璃凝集反应板(板上分IcmX I. 5cm的30 个小方格，一般为黑色背景)。一滴(约30-50微升)样品缓冲液和一滴(约30-50微升) 抗幽门螺杆菌抗体致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动I分钟以上(顺时针或反时针方向)，即可观察结果。出现凝集大颗粒的为阳性反应，说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌；保持均匀乳液状为阴性反应，说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少。
对照设置以生理盐水为空白对照，以酶联免疫检测为阴性的胃黏膜标本做为阴性对照。
判断结果
“++++”:乳胶颗粒全部凝集出现粗颗粒，并且四周成一白色框边，一般I 2分钟出现凝集颗粒，液体清亮为特强阳性“++++”。
“+++” 乳胶颗粒全部凝集出现粗颗粒，4周白色框边不太明显.一般3-4分钟出现凝集颗粒，液体较清亮为强阳性“+++”。
“++” 乳胶出现凝集颗粒，液体微混浊，一般5-6分钟出现凝集颗粒为较强阳性 “++”。
“ + ” :乳胶出现凝集颗粒，液体混浊，一般8-10分钟出现凝集颗粒为弱阳性“ + ”。不凝集，呈白色均匀混浊为阴性
阳性判断标准凡出现凝集就判为阳性。
必要时可将胃黏膜标本作一系列等倍稀释，进行半定量测定。
将胃黏膜便样品浓集处理后(两次离心，200转/分，离心3分钟，取上清液，再将该上清液12000g离心15分钟，去上清液，将沉淀再打散、混匀，待测)，乳胶凝集反应灵敏度与酶联免疫方法类似。
将胃黏膜免疫病理检测幽门螺杆菌方法和本发明所述乳胶凝集进行检测的结果对比。结果显示，两种方法没有显著性差异，本发明所述乳胶凝集方法与胃黏膜免疫病理检测幽门螺杆菌检测效能相当。以下通过一些非限定性实施例对本发明作进一步说明。
检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌实施例2 :采用凝集抑制反应
把适当稀释度的50微升抗幽门螺杆菌抗体与制备的含胃黏膜的样品缓冲液充分混合，然后加入等体积幽门螺杆菌抗原标记的免疫微球；将上述液体充分混合、连续摇动1 分钟以上(顺时针或反时针方向)，即可观察结果。结果判定出现凝集颗粒的为阴性反应，说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少；保持均勻乳液状为阳性反应，说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌。凝集抑制反应较乳胶凝集反应敏感度高检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌实施例3、采用免疫微球花环形成试验取一滴(50微升)实施例三制备胃黏膜样品和一滴(50微升)抗幽门螺杆菌抗体致敏的免疫微球试剂在小试管中，混合后置37°C间断振摇30 60分钟。然后用磷酸盐缓冲液以4000转/分离心20分钟洗涤2次。取末次沉淀细胞一滴置载玻片上，同时加一滴美蓝溶液，染色3 15分钟加上盖玻片；在高倍镜或油镜下检测免疫花环。显微镜下，幽门螺杆菌被美蓝染成蓝色，其典型的形态为s状、海鸥状弯曲。如果有免疫花环形成，则在该细菌的四周有微球粘附，似花环一样，故称免疫微球花环试验。在显微镜下，如果发现S状或海鸥状弯曲的被染成蓝色细菌，同时在其四周有2 3个以上的微球粘附，则表示花环试验阳性，该胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌；如未发现免疫花环形成，则说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少。用于幽门螺杆菌染色的方法有很多种，这是本研究领域技术人员所熟知的，如革兰氏染色、银染色、美蓝染色。在此仅选择一种较方便的染色方法。美蓝染液美蓝(亚甲基蓝)1. 0g，硼酸0.5g，加蒸馏水至100ml。检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌实施例4、采用透射比浊法应用半自动生化分析仪上采用透射比浊法检测胃黏膜样品幽门螺杆菌。采用前述物理吸附方法将抗幽门螺杆菌的抗体标记到较细的微球上(直径0. 2微米左右)O幽门螺杆菌抗原标准品(可向深圳晶美生物工程公司购买)，标准曲线制备用 0. lmol/L，甘氨酸缓冲液(ρΗ7· 4)将幽门螺杆菌标准品稀释成1. 1 X IO6,3X IO6U. 9X IO7, 1.9X IO7/毫升，按下列步骤操作，作标准曲线。操作方法将制备的胃黏膜样品(只一次离心后取上清液)200微升加免疫微球 100微升，充分混勻，30°C水浴1分钟，RA-50半自动生化分析仪，340纳米彼长终点法测定， 仪器根据内存的标准曲线计算打印测定结果。标准曲线测定时加标准品与免疫微球，同上水浴后，读数。为避免胃黏膜样品本身浊度干扰，应设样品对照。浊度法的灵敏度比酶联免疫方法低，但己能满足临床定量测定要求。
权利要求
1.一种测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，它包括(a)形成免疫微球具体方法有2种方式①把抗幽门螺杆菌的抗体标记微球，形成免疫微球；或②把幽门螺杆菌抗原标记微球，形成免疫微球；(b)制作含有检测组织的样品缓冲液；(c)①将步骤(a)①所述已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含胃黏膜的样品缓冲液混合；或②将抗幽门螺杆菌抗体与含胃黏膜的样品缓冲液混合，然后加入步骤(a)②所述的幽门螺杆菌抗原标记的微球；(d)检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌。其特征在于样品缓冲液的制作方式为将怀疑含有幽门螺杆菌的胃黏膜样品悬浮于含有蛋白质和碱性物质的缓冲液中制备而成。
2.根据权利要求1所述的测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，其特征在于用来标记的微球颗粒为动物或人红细胞、细菌、高分子聚合颗粒、树脂、皂土、明胶颗粒、 活性炭、火棉胶、玻璃微粒、分散染料颗粒中的一种或几种的混合。
3.根据权利要求1所述的测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，其特征在于将含胃黏膜的样品缓冲液针对幽门螺杆菌进行浓集处理，其中浓集处理的具体方法是将含有胃黏膜样品的缓冲液进行离心或过滤浓集处理。
4.根据权利要求1所述的测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，其特征在于样品缓冲液应含有蛋白质蛋白质成分选自胎牛血清、羊血清、豚鼠血清、马血清、酪蛋白、白蛋白、明胶、牛血清白蛋白、人血清白蛋白的一种或几种混合。
5.根据权利要求1所述的测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，其特征在于所述的碱性物质包含但不限于三羟甲基甲胺基丙磺酸、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、N-三-(羟甲基)甲基氨基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸、3-(N-吗非啉)乙磺酸、四硼酸钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合，其中由碱性物质配制而成的缓冲液其PH大于8。
6.根据权利要求1所述的测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫微球方法，其特征在于在样品缓冲液中还设有洗涤剂，所述的洗涤剂为吐温-20或聚乙二醇辛基苯基醚。根据权利要求1的胃黏膜样品中幽门螺杆菌的免疫测定法，其特征在于在样品稀释液中还含有胃蛋白酶抑制剂，所述的胃蛋白酶抑制剂包含但不限于抑肽素、硫柳汞、叠氮钠中的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求1方法，其特征在于检测(a)①与免疫微球结合的幽门螺杆菌的方法为将(c)①混合液体连续摇动1分钟以上，观察结果出现凝集颗粒的为阳性反应，说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌；保持均勻乳液状为阴性反应，说明胃黏膜品中无幽门螺杆菌或者量很少。
8.根据权利要求1方法，其特征在于检测(a)①与免疫微球结合的幽门螺杆菌的方法为将(c)①混合液体置室温或37°C保温5分钟以上，取一部分液体染色；在显微镜下检测免疫花环，免疫微球吸附在幽门螺杆菌的周围形成花环，如此花环存在则可间接推测样品中存在幽门螺杆菌；反之则无幽门螺杆菌或者量很少。
9.根据权利要求I方法，其特征在于；检测(a)①与免疫微球结合的幽门螺杆菌的方法为检测(C)①免疫微球与样品缓冲液混合前后缓冲液的散射光强度、粒子数以及浊度的改变，从而推测胃黏膜样品中可能存在幽门螺杆菌。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌的方法是将(C)②中的抗幽门螺杆菌抗体，含胃黏膜的样品缓冲液及幽门螺杆菌抗原标记的微球充分混合、连续摇动I分钟以上，观察结果出现凝集颗粒的为阴性反应，说明胃黏膜样品中无幽门螺杆菌或者量很少；保持均匀乳液状为阳性反应，说明胃黏膜样品中存在幽门螺杆菌。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种解决现有技术中所采用的试剂和仪器成本高、操作费时、假阳性和假阴性高等问题的一种采用免疫微球技术测定胃黏膜样品中幽门螺杆菌方法。它包括(a)形成免疫微球(b)制作含有检测组织的样品缓冲液；(c)已标记抗幽门螺杆菌抗体的免疫微球与含胃黏膜的样品缓冲液混合(d)检测胃黏膜中可能存在的幽门螺杆菌。其中，样品缓冲液的制作方式为将怀疑含有幽门螺杆菌的胃黏膜样品悬浮于含有蛋白质和碱性物质的缓冲液中制备而成。本发明采用免疫微球技术，检测胃黏膜样品中的幽门螺杆菌。它具有成本低廉、操作方便快捷、结果可靠，能够避免假阳性和假阴性的优点。
文档编号G01N33/569GK102539756SQ20111044094
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者王滔 申请人:王滔