专利名称：微生物的捕获的制作方法
微生物的捕获本发明涉及从悬浮物中捕获微生物的方法，以及其随后的检测和/或鉴定。背景在许多应用中希望从其悬浮物中捕获微生物，这作为第一个步骤而允许随后对所述微生物进行其它工作，例如将微生物浓缩为不含杂质和污染物的小体积，用于例如诊断目的。所述微生物可起初存在于大体积样品材料中，例如痰，血液，分散的食物或饮用水中。浓缩为不含样品污染物的小体积在诊断程序中会优化灵敏度并去除抑制物，所述诊断程序是例如显微镜检查，免疫测定或核酸扩增程序，例如PCR。现存的用于实现微生物浓缩的方法包括使用涂覆了微生物特异性抗体的顺磁珠子；所述珠子可被用于从样品中特异性地捕获微生物，从而允许通过各种方法对其进行随后的检测(US7166425)。然而，在一些应用中，捕获条件可能不适于基于抗体的系统:例如，在从痰中捕获分枝杆菌时，所述痰已用氢氧化钠稀释并且保持为高PH，这将使抗体失活。在这些以及其它严苛条件的情形中，不能使用抗体捕获。此外，在其它应用中可能需要捕获可能存在于样品中的任何微生物。例如，在败血症中，重要的是捕获可能存在于血液中的任何细菌或真菌细胞从而可进行诊断。类似地，在测试血液产品时(例如在血小板筛选中)，重要的是了解所述血液产品(在此情形中是血小板)究竟是否被任何微生物污染。在这种情形中，用基于抗体的方法将难以进行这些，因为抗体倾向于是生物体或物种特异性的。曾描述过不是基于抗体的方法。JP2001112497描述了通过沉淀其中的磷酸钙而从碱净化的液体中去除分枝杆菌的方法，推测沉淀物在形成时带下细菌。W02009/086343描述了将碳水化合物涂覆的表面与生物素结合蛋白以及类固醇或三萜的两亲性糖苷一起使用以结合微生物。W028072242A2描述了以氨基酸衍生的聚合物基质作为结合表面，且W029046191A2描述了使用以各种金属或无机表面涂覆的硅藻土颗粒来实现相同的结果。这些方法比基于抗体的方法更为通用但是不是真正通用的，因为某些细菌种类比其它种类更好地被捕获，且某些细菌种类或菌株可能根本不被捕获。此外，没有显示这些方法用于捕获真菌。这些问题是依赖于结合基质的表面特性(其在性质上必然受限)来结合可具有多样的外细胞壁结构的细菌的结果。在本发明中，我们描述了新的方法，其较少依赖于表面基质的性质并且被显示出除对分枝杆菌(倾向于具有独特的疏水性细胞壁)起作用外，也对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌起作用。发明简述我们现在发现了有可能使用水溶性聚合物来引起悬浮的微生物沉积在固体表面上。此方法还起作用以引起微生物的可沉淀和不可沉淀的片段沉积在固体表面上。虽然已经得知通过加入水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)或右旋糖苷而不涉及固体表面可引起溶液中的蛋白沉淀有一段时间了，但是关于微生物及其片段的这些发现是出人预料的。W095/32304使用水性两相聚合物分离系统来选择性提高靶微生物相对于背景菌群的数目，但是没有暗示捕获至固体表面。因此，本发明现在提供了将水性液体中的微生物和/或其片段捕获至固体表面上的方法，所述方法包括在固体表面的存在下向所述液体中加入足量的水溶性聚合物以将所述微生物和/或片段从所述液体转移至所述固体表面。或者表述为，所述方法可包括将固体表面与含有微生物和/或其片段的水性液体及水溶性聚合物一同提供，以将所述微生物和/或其片段从所述液体转移至所述固体表面上。可以此方式被捕获的微生物片段包括可沉淀的片段，可利用以4，OOOx g离心20min来离心所述片段而从液体中沉积，其中4，OOOx g是通常用于沉淀细菌的速度。令人惊讶地，所述方法也起作用以捕获片段，所述片段可包括在这种离心条件下不能被引起沉积并且可被称为不可沉淀的可溶性蛋白或其它可溶性细胞组分。可根据聚合物的性质自由调节水性液体中所添加的水溶性聚合物的浓度，从而产生所希望的将微生物和/或片段从待沉积液体中的悬浮物或溶液中转移至固体表面上。任选地，所述聚合物浓度为2至30%w/v,优选5至20%w/v,更优选7至15%w/v,最优选约10%w/ν.这些浓度特别适于与以PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(作为所述聚合物)一起使用。优选地，所述水溶性聚合物是非离子亲水性聚合物。其例如可以是右旋糖苷，PVP或PEG。所述PEG可以是在分子量方面多分散的或者是单分散的，可以是分支的或直链的并且可以是星型的。适当地，所述水溶性聚合物具有的重均分子量为200至100，000。其可例如具有下列分子量1，000至20，000，更优选5，000至13，000，例如约8000。这些分子量特别适于PEG或PVP的情形。可通过使用高离子强度条件来提高微生物与固体表面的结合。适当地，通过加入水溶性无机盐而将所述水性液体的离子强度提高到150mM至6M，更优选0.25至0.75M，例如 0.5M。可向所述溶液中加入许多不同的盐以实现高离子强度，例如硫酸铵，氯化铵，硫酸镁，氯化镁，但是氯化钠是优选的。可在1-14范围中的高或低pH条件下进行与表面的结合。当所述微生物是分枝杆菌时，高pH、例如9至14可以是优选的，以消灭或降低繁殖可能存在的其它种类的细菌的能力。此外，可在去污剂的存在下进行与表面的结合，所述去污剂可包括离子性(例如十二烷基硫酸钠)或非离子性(例如Tween20和Triton X100)去污剂。优选的是，所述固体表面具有高的比表面积，因而优选通过珠子提供所述固体表面。术语“珠子”包括但不限于下述不可溶颗粒:其性质为球形的或不规则的，大小为0.1微米至5mm。根据本发明的方法还可包括从所述液体中分离所述固体表面。对于微生物的一般性浓缩有完善的物理方法，例如:过滤样品，其中细胞被俘获在尺寸排阻滤器的表面上或深度滤器的结构内；或者离心，其中细胞被沉淀。虽然这些方法可用于制备不含样品污染物的微生物浓缩悬浮物，它们也有缺点。在过滤方法中，捕获确定大小的完整生物体是简单的(受制于过滤的内在缺点)，但是以这种方式来捕获不确定大小的生物体片段是更加困难的。此外，在通过过滤器俘获了微生物之后可能难以回收它们，并且当通过洗脱或逆流清洗过程进行回收时，所述微生物可能不利地存在于相对大的流体体积中。再一次地，离心可被用于浓缩完整的生物体但是在所使用的速度和时间下微生物的片段可能是不可沉淀的。此外，离心需要设备并且此步骤也不能被容易地并入微生物浓度和检测的自动化程序中。此外，在离心之后，以所希望的小体积可靠地重悬含有微生物的经沉淀的沉淀物是困难的，通常需要更大的体积来确保完全分散管中的沉淀物。因此，优选的是，在其上接受微生物和/或片段的固体表面的性质使得不使用过滤或离心而能将所述固体表面从悬浮液体分离。因此优选的是，所述珠子可被吸引至磁体以进行分离或者其足够致密从而即使含有聚合物的液体十分粘稠也可通过沉淀被分离。因此，优选的是所述珠子是顺磁的或者具有充分高于所述液体密度的密度从而它们在不离心时发生沉淀，例如高于2.0g/ml，更优选高于3.0g/ml。备选地，它们可具有充分低于所述液体密度的密度从而它们将分离以浮在所述液体上，例如空心珠，其可以是玻璃的。此类有浮力的珠子可具有低于0.8g/ml的密度,例如0.4至0.7mg/mL.
合适的致密珠子材料，或珠核心材料是氧化铝，碳化硅，氮化硅，碳化钛，氧化铁(例如磁石)和玻璃。所述固体表面可以是由具有正电或负电表面基团的聚合物构成的。合适的表面基团的实例是胺，季铵，羧酸，磺酸或硫酸盐基团。合适的材料包括硫酸葡聚糖和聚(二甲基二烯丙基氯化铵)(pDADMAC)。所述珠子可以整个是一种材料的或者可以具有带有表面涂层的核心。我们发现使用呈现磁石表面的颗粒(未涂覆的磁石颗粒)具有特别的优势。此类颗粒是铁磁的(广义的，包括亚铁磁的)并因此容易地从液体培养基中被分离且通过液体培养基中可溶性聚合物的存在而容易地引起微生物和/或其片段附着至此类颗粒的表面。此外，去除含有此种聚合物的液体培养基以及用其中不存在此种聚合物的液体对其进行替代提供了从所述固体表面去除经捕获的材料的便利手段。根据本发明的方法还可包括在将所述固体表面从所述液体分离后从所述固体表面洗脱所述微生物和/或片段。所述洗脱可以在广泛的条件下进行，例如在具有150mM至6M盐浓度的缓冲液中。此外，可包括非离子性、离子性或两性离子去污剂、例如Tween20，Triton X-100, CTAB，十二烷基肌氨酸钠或SDS来帮助从所述珠子表面洗脱。为了实现微生物和/或片段的浓缩，优选将所述微生物和/或片段从固体表面洗脱到这样的液体体积中:其至少2倍、例如至少4倍少于所述微生物和/或片段原本在其中悬浮的液体的体积。本发明的方法还可包括检测被捕获至固体表面上的微生物和/或片段。这可在从所述固体表面洗脱之后或者当所述微生物和/或片段保留在所述固体表面上时进行。这可在从所述固体表面去除水性液体之后或者当所述水性液体仍保留时进行。例如，在将微生物和/或片段捕获至珠子之后，可加入经标记的结合剂(例如特异于所述微生物和/或片段的抗体或者金胺染料)并且可使所述液体通过细胞分选装置以检测经标记的珠子。可用微生物染料对珠子或者带有微生物和/或片段的其它形式的固体表面进行染色，所述染色是直接的或者是在培养所述生物体以增加其数目之后。例如，可通过使用用于可视化的酸快速染料(acid fast stain)来显示分枝杆菌。对于微生物本身或其细胞组分可使用其它的检测形式，例如核酸扩增技术(如PCR)，代谢物的检测，基于抗体的检测(例如ELISA)。一种合适的用于检测分枝杆菌和/或片段的ELISA方法是例如GB1004710.8中公开的。本文中所描述的捕获方法可被用作GB1004709.0中所描述的方法的修改。所使用的检测方法可以是要求存在活微生物的那种，例如培养。根据本发明可被捕获的微生物和/或片段包括细菌、病毒、真菌细胞、动物细胞和植物细胞，以及它们的细胞组分。通过下面的具体实施例将进一步描述和阐释本发明。实施例1结合至不同珠子类型的生物体的证明原理使用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和光滑念珠菌(Candida glabrata)的过夜培养物来研究在各种条件下与各种珠子类型的结合。使用了足够的每种培养物从而溶液是浑浊的且可通过眼睛追踪结合以及随后的洗脱。方法1.以8，OOOx g将IOml细菌培养物离心5min并重悬于IOml蒸馏水中以提供浑浊的生物体悬浮物。2.用 IM NaCl 或 IM NaCl，20%(w/v) PEG8000 (引起培养基中的 PEG 浓度为 10%)将500 μ I的每种悬浮物稀释至1ml。3.加入25 μ I各种顺磁珠子(约Img珠子)的悬浮物并孵育IOmin。4.使用磁力架将所述珠子拉至管子侧边并去除上清液。5.以8，OOOx g离心5min后就浑浊度以及生物体沉淀物的存在观察上清液。6.为了洗脱所捕获的生物体，将所述珠子重悬于250 μ 10.5Μ NaCl中，然后放回磁力架中。7.以8，OOOx g离心5min后就浑浊度以及生物体沉淀物的存在观察上清液。结果结果显示在下表中。所使用的顺磁珠类型如下所列:A.BioMag Amine 珠(Bangs Laboratories,目录号 ΒΜδ46)。B.如A中的，但是以pDADMAC涂覆。C.如B中的，但是以硫酸葡聚糖再涂一层。D.Dynalbeads M-270 胺(Invitrogen)。E.碳化硅珠子(50微米)，涂覆了 pDADMAC。F.碳化娃珠子(50微米)，未经涂覆。
权利要求
1.将水性液体中存在的微生物和/或微生物片段捕获到固体表面上的方法，所述方法包括在固体表面的存在下向所述液体中加入足量的水溶性聚合物以将所述微生物和/或片段从所述液体中转移至所述固体表面。
2.权利要求1的方法，其中所述水性液体中添加的水溶性聚合物的浓度为2%至40%w/Vo
3.权利要求2的方法，其中所述浓度为5-15%w/v。
4.任意前述权利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物为非离子亲水性聚合物。
5.任意前述权利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物为右旋糖苷，PVP或PEG。
6.任意前述权利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物具有1,000至20，000的分子量。
7.权利要求6的方法，其中所述水溶性聚合物具有5，000至13，000的分子量。
8.任意前述权利要求中的方法，其中通过加入水溶性无机盐将所述水性液体的离子强度提高至150mM至6M。
9.任意前述权利要求中的方法，其中所述盐的浓度为0.25至2.5M。
10.任意前述权利要求中的方法，其中所述固体表面是由珠子提供的。
11.权利要求10的方法，其中所述珠子为顺磁的，铁磁的或具有使得它们在静置时分离的密度。
12.权利要求11的方法，其中所述珠子为磁石的。
13.权利要求11的方法，其中所述珠子为碳化硅的。
14.任意前述权利要求中的方法，其中所述固体表面由具有带正电或带负电的表面基团的聚合物构成。
15.权利要求14的方法，其中所述表面基团为胺，季铵，羧酸，磺酸或硫酸盐基团。
16.任意前述权利要求中的方法，还包括从所述液体中分离所述固体表面。
17.权利要求16的方法，其还包括在将所述固体表面从所述液体中分离后，从所述固体表面上洗脱所述微生物和/或片段。
18.权利要求17的方法，其中将所述微生物和/或片段从所述固体表面上洗脱到一定体积的液体中，所述体积为至少两倍少于所述微生物和/或片段原始在其中悬浮的液体的体积。
19.任意前述权利要求中的方法，其还包括检测被捕获到所述固体表面上的微生物和/或片段。
20.权利要求19的方法，其还包括鉴定被捕获到所述固体表面上的微生物和/或片段。
全文摘要
通过在固体表面的存在下向液体中加入足量的水溶性聚合物以使微生物和/或片段从液体转移至所述固体表面而将存在于水性液体中的所述微生物、包括真菌、病毒和细菌例如分枝杆菌和/或微生物片段、例如细胞壁组分捕获至固体表面。可通过珠子提供所述表面。所述水溶性聚合物可以是聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
文档编号G01N33/569GK103189747SQ201180041506
公开日2013年7月3日 申请日期2011年6月29日 优先权日2010年7月2日
发明者C·J·斯坦利, S·M·威尔森 申请人:米克罗森斯医疗技术有限公司