使用基于分子核酸的技术确定细胞活性的改进方法

使用基于分子核酸的技术确定细胞活性的改进方法
【专利摘要】本发明涉及从含有活细胞和死细胞的混合物中选择性排除死细胞的新颖方法和试剂盒，所述混合物例如含有微生物细胞的临床样品、血液制品、医学/生物技术制品以及食物制品，其中对选定活细胞的随后质询是微生物活性存在的指标。具体而言，本发明涉及在血液和其他体液中进行例如聚合酶链反应（PCR）的直接核酸扩增技术以及恒温技术的改进方法，以与菌血症和真菌血症样品中的微生物细胞活性建立相关性。本发明所提供的改进方法特别有利于诊断败血症以及确定所有其他正常无菌体液的病理学状态。
【专利说明】使用基于分子核酸的技术确定细胞活性的改进方法
[0001]相关申请的交叉参照
[0002]本申请为非临时申请，其以引用的方式将2010年12月31日递交的第61/428，892号美国临时申请并入本文中，并且主张其优先权。
【技术领域】
[0003]本发明涉及利用分子检测从含有活细胞和死细胞的混合物中选择性排除死细胞DNA的方法，确切地说，涉及在血液以及其他体液中进行直接聚合酶链反应(PCR)技术以便与菌血症、真菌血症、病毒血症以及其他类型的含寄生物样品中的活微生物细胞建立相关性的改进方法。本发明所提供的改进方法特别有利于诊断败血症。
【背景技术】
[0004]诊断败血症时,得到结果的时间(time to result ;TTR)是病人存活的最重要决定因素。目前，血液培养是最高准则，但是其相对较慢，产生的的活微生物在随后鉴定中转为阳性的近似中值时间为15小时(通常范围是3小时到5天)，随后另外增加I至2天微生物鉴定用于分析。PCR等分子方法为微生物鉴定提供了极大改进的TTR，但是这些方法缺少特异性，这主要是由于在样品制备期间对活微生物细胞的选择不充分。传统的血液败血症PCR测试按照惯例需要进行昂贵的DNA分离以除去PCR抑制剂，但是与血液培养的最高准则相比，分离也会造成假阳性以及敏感度降低，这主要是由于在DNA分离过程中包含了死亡微生物细胞的DNA以及与样品处理相关的损失。
[0005]传统上，败血症血液样品PCR制备总是从血液以及血液制品中分离DNA，以除去久已熟知的Taq聚合酶血液源PCR抑制剂(参见下文引述的克鲁士(Klouche)以及施罗德(Schroder)论文)。近来，为试图克服这个抑制作用，一些团队已开发出PCR增强型混合物以及修饰的热稳定聚合酶(例如，熟知的“omni taq”以及“Phusion”技术)，这些聚合酶通过工程改造可减少血液制品对这些聚合酶的抑制作用(参见JMD，2010 ;12(2)，第152-161页)。然而，这些方法的约束条件仍然缺少敏感性，这是因为血容量耐受性低以及与分离系统相关的高成本及样品损失及高复杂度。此外，DNA分离系统通常包括来自死细胞的无细胞DNA，结果引起混淆不清的假阳性。
[0006]克鲁士.M (Klouche, M.)以及施罗德.U (Schroder, U.)在发表于临床化学与牟骀室医学(Clin.Chem.Lab.Med.),2008 ;46 (7)，第888-908页中的一篇标题为“血流感染的快速诊断方法(Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections)，，的论文中，披露了基于核酸直接检测和鉴定病人血液中的微生物病原体可以是快速诊断血流感染的一种非常有前景的工具。然而，根据这篇论文，利用血流感染常规检查中宽范围的分子方法检测循环细菌或真菌核酸的意义目前尚不明确。可使应用于血流感染的分子诊断质量和再现性改进的鼓舞性论点包括:针对细菌核酸的选择性富集程序、过量人类DNA的阻断或消除方法，以及利用活标记物辨别临床上相关的发现，如微生物安全分析经验所表明。尽管目前的工艺昂贵且技术性要求高，但针对疾病的多重PCR，病原体微阵列以及蛋白质组学分析具有发展成诊断传染性疾病的重要、快速且高通量诊断手段的潜能。目前，三个主要考虑妨碍了分子技术在血流感染常规诊断中的独特应用:难以解释NAT结果是由于:1)外部污染风险高，感染后核酸的持久性延长，以及暂时性菌血症；2)对临床上相对较低细菌负荷的分析灵敏度有限，以及对某些细菌和真菌的检测有限，以及3)缺乏通过分子测试以及蛋白质组学测试进行的常规抗微生物敏感性测试。
[0007]区分活细胞与死细胞是微生物诊断学中的重要挑战。代谢和复制活性以及在病原微生物情况下的潜在健康风险限于混合微生物群体中的有生命部分。常规技艺中利用四种生理状态、使用荧光染剂、以流式细胞术辨别:可复制的活细胞、代谢活跃的细胞、完整细胞以及通透化细胞。根据条件，除通透化细胞外的所有阶段在复活时都具有恢复的潜能，因此须视为潜在存活的。由于细胞死亡后的DNA的持久性相对较长，在数天到3周范围内，因此基于DNA的诊断倾向于过高估价活细胞的数目。从样品中提取的DNA可来源于处于上述四种生理状态下的任何一种的细胞，包括死亡的通透化细胞。然而，不想要检测到后者。区分活细胞与不可逆损害的细胞的最重要准则是细胞膜完整性。挑选出来源于膜受损细胞的噪音有助于针对细菌群落的完整存活部分指定代谢活性以及健康风险。具有完整细胞膜的活细胞的特征是它们能够排除轻易渗入死细胞或膜受损细胞中的DNA结合染料。
[0008]近来，据报道EMA-PCR是一种可替代显微镜或流式细胞分析来区分活细胞与死细胞的的易用型方法。这种基于DNA的诊断方法将辨别活-死的染料的用途与实时PCR的速度和灵敏度结合起来。就此而言，已使用单叠氮溴乙锭(EMA)，它是一种具有叠氮基团的DNA嵌入染料，在曝露于亮可见光(460nm下的最大吸光度)时可化学共价结合到DNA。使细胞暴露于EMA5分钟，让染料渗入细胞壁/膜受损的死细胞中并且结合到它们的DNA。使用亮可见光使EMA发生光解，产生氮烯，所述氮烯可与DNA以及其他分子形成共价键。
[0009]据报道，光诱导交联可以抑制死细胞DNA的PCR扩增。近来已表明，EMA与DNA交联实际上使得DNA不能溶解，并且在基因组DNA提取期间导致DNA与细胞碎片一起损失。在溶液中保持游离状态的未结合EMA可以通过与水分子反应而同时失活。所产生的羟胺不再能够共价结合到DNA。因此，曝露于光之前因细胞壁/细胞膜完整而免于接触反应性EMA的活细胞DNA，在细胞溶解之后未受到失活EMA的影响。因此，EMA处理包含活细胞与死细胞混合物的细菌培养物可选择性除去死细胞的DNA。所测试的物种为大肠杆菌0157:H7、鼠伤寒沙门式菌、单核细胞增生李斯特菌以及空肠弯曲杆菌。然而这些研究并没有检查死细胞DNA的选择性损失。
[0010]虽然此项技术很有前景，但是已发现在DNA提取之前使用EMA具有严重的缺陷。有时候，处理还导致了在对数生长期收获的活细胞的基因组DNA损失大约60%。已观察到EMA还容易渗入其他细菌种的活细胞中，导致部分DNA损失。敏感性以及总体适用性的这种缺乏已产生新开发的替代化学测试:单叠氮溴丙锭(PMA)。在2007年9月7日公开的授予诺克(Nocker)等人的第W0/2007/100762号已公开专利申请中，披露了 PMA适合从具有活细胞与死细胞的定义部分的细菌培养物中选择性除去检测到的死细胞基因组DNA。PMA与碘化丙锭(PI)相同，除了另外存在叠氮基团以便在曝露于光下时交联到DNA。PI已广泛用于鉴定混合群体中的死细胞。PMA分子电荷较高(两个正电荷，相比之下，在EMA情况下仅有一个电荷)，并且由于PI对非活细胞的选择性染色已成功地针对多种细胞类型执行，所以使得所属领域的人们相信使用PMA可以减少所观察到的EMA缺陷。在这个已公开专利中，在将这些参数应用于大范围不同细菌种的研究中之前，利用一种革兰氏阴性生物体以及一种革兰氏阳性生物体优化PMA浓度以及培养时间。据称，所披露的方法使分子诊断限于微生物群落中具有完整细胞膜的部分。这是通过将完整细胞与膜受损细胞混合物暴露于啡锭衍生物而实现。在所披露的优选实施例中，PCR是使用混合物中的基因组DNA作为模板来执行。
[0011]并且,2008年7月3日公开的授予洛伦兹(Lorenz)的第2008/0160528号已公开美国专利申请，披露了利用核酸酶，尤其是DNA降解核酸酶，在一种或若干种离液剂和/或一种或若干种表面活性剂存在的情况下使核酸降解。这个专利申请进一步披露了一种从DNA和RNA混合物中纯化RNA的方法以及执行此类方法的试剂盒。还披露了一种从额外包含高等真核细胞的混合样品中所提供的微生物细胞中分离核酸的方法以及于执行此类方法的试剂盒。
[0012]2001年10月18日公开的授予鲁迪(Rudi)等人的第W0/2001/077379号已公开专利申请披露了检测样品中的细胞以及获得样品内关于细胞群体的定量信息的方法。具体而言，披露了一种区分样品中活细胞与死细胞的方法。所述方法包含使样品与修饰样品内死细胞核酸的活性探针接触以及检测样品中的细胞核酸。还描述了一种检测样品中的细胞的方法，所述方法包含:(a)使样品与标记样品内死细胞核酸的活性探针接触；(b)将细胞核酸分离为标记部分以及未标记部分；以及(C)检测所述一个或两个部分中的核酸。

【发明内容】

[0013]鉴于上述【背景技术】，可以发现思考模式的转移会开发出一种方法，所述方法在基于分子核酸的分析技术之前(例如在PCR建立之前)可以有效区分活微生物细胞DNA与死微生物细胞DNA，并且所述方法规避了为除去例如PCR抑制剂并且浓缩目标DNA所设计的传统分离的高成本负面影响。出乎意料的是，根据本发明的一个实施例的实施，已经表明PCR与来源于血液的活微生物细胞相关联，其将选择性血液细胞溶解、洗涤(和/或)脱氧核糖核酸酶以及随后微生物细胞溶解和PCR组合使用。
[0014]因此，与上述传统.方法对比，本发明如下设法实现基于分子核酸的技术(包括PCR)的潜在TTR优势:显著简化昂贵的DNA分离以及样品制备，并且不是通过分离DNA，而是通过在快速分离死亡微生物DNA以及细胞之后对粗制的微生物溶解产物执行快速简单的直接分析，从而选择性富集活微生物细胞。这出乎意料地特别有利于诊断败血症，并且根据本发明的优选实施例如下完成:
[0015]1.除去混杂性死亡微生物细胞DNA，随后获得阳性非污染PCR结果指示存在活细胞，且因此PCR结果将指示存在败血症活微生物，即，血液微生物PCR=败血症活微生物。
[0016]I1.众所周知，来自血液的死亡微生物细胞无法在血液培养液中生长，因此测量到单个血液培养瓶中的微生物特异性PCR信号显著增强的任何两个或多个时间点必须是测量活微生物。
[0017]II1.血液中的PCR抑制剂可以由化学变性剂(离液剂:清洁剂、pH、盐类、基于经由偶极矩进行差别拯救的有机化合物，例如含有醇和胺的化合物，以及酶，例如核酸酶、蛋白酶等)与洗涤的简单组合来清除，从而规避了 DNA分离并且能够进行微生物溶解产物直接PCR (microbe lysate-Direct-PCR) IV.。
[0018]IV.接着可使用存在于血液以及血液培养液中的活/死微生物的比率作为治疗有效性以及测试治疗功效的量度。
[0019]因此，本发明的一个目标在于提供一种利用分子检测从含有活细胞与死细胞混合物中选择性排除死细胞DNA的改进方法。
[0020]本发明的另一目标在于提供一种改进方法，所述方法在基于分子核酸的分析或PCR之前，有效区分活微生物细胞DNA与死微生物细胞DNA，并且还规避了传统分离的高成本负面影响，例如，为除去PCR抑制剂以及浓缩目标DNA所设计的传统分离。
[0021]本发明的另一目标在于提供如下使PCR及其他分子分析技术的结果与血液源活微生物细胞的存在相关的方法:例如，将选择性血细胞溶解、洗涤(和/或)脱氧核糖核酸酶以及随后微生物细胞溶解和PCR组合使用。
[0022]本发明的又一目标在于提供在血液以及其他体液中进行直接PCR技术以便与菌血症的以及真菌血症样品中的活微生物细胞相关联的改进方法，本发明提供的这些改进方法特别有利于诊断败血症。
[0023]本发明的其他目标和优势可从本发明的以下优选实施例的详细说明清楚看出。
【专利附图】

【附图说明】
[0024]图1以表格形式显示为比较过滤-珠磨-原位微生物溶解和分析物分析(通过DNA聚合酶(PolMA))以及基因组DNA (通过定量基因特异性PCR)所执行的实验的结果。
[0025]图2以图表形式显示根据本发明检测溶解产物中的微生物的策略说明。
[0026]图3显示的流程图 说明根据本发明添加胰蛋白酶以及脱氧核糖核酸酶能够明显减少在处理两种“困难”临床样品期间所观察到的凝结。
【具体实施方式】
[0027]虽然本发明已经进行了描述，但是还提供以下实例以便具体说明本发明的实施例以及清晰理解。对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，根据本文中所阐明的本发明传授内容，可以对如此所描述的这些实施例进行某些改变和修改，而此等改变和修改不脱离本发明的精神或范围。
[0028]离液剂，也被称作离液试剂和离散剂，是一种能够分裂蛋白质、DNA或RNA等大分子的三维结构并且使它们变性的物质。离液剂干扰由氢键、范德华力以及疏水效应等非共价力调节的分子间相互作用的稳定。如利用圆二色性等方法检测的常见结构特征可以离液剂浓度依赖性方式进行滴定。离液剂包括，例如:
[0029]尿素6_8mol/l
[0030]盐酸胍6mol/l
[0031]高氯酸锂4.5mol/l
[0032]变性作用(生物化学)
[0033]此外，高通用性盐通过屏蔽电荷以及防止盐桥稳定而可具有离液特性。氢键在非极性介质中较强，因此，增大试剂偶极距的盐也可以使氢键不稳定。
[0034]如利用圆二色性等方法检测的常见结构特征可以离液剂浓度依赖性方式进行滴定。历史上用于生物化学以及分子生物学中的离液试剂的一些实例包括:尿素6-8mol/l、盐酸胍6mol/l、高氯酸锂4.5mol/l、醇类、胺类(尤其是季胺)、清洁剂(尤其是非离子型)、pH值改变、甜菜碱、脯氨酸、肉毒碱、海藻糖、NP-40等，以及BSA。根据本发明，实验设计(DoE)流程已被用于优化多种离液剂的有效配方范围以及范围组合(混合物或试剂，或者“混合液”):a)使死细胞结构变性，从而根据尺寸(过滤)以及密度(离心)而轻易地将它们与活细胞分离；以及b)形成暴露于所得离液剂混合液的活细胞分离溶液，所述溶液与下游分析扩增试验(例如PCR)以及活细胞源内生性蛋白直接相容，并且维持它们可测量的生化活性。可有效地优化离液剂混合液，从而根据细胞膜完整性的差异来区分活细胞与死细胞，维持活细胞内生性蛋白活性供活性相关性分析用。
[0035]样品制备:
[0036]优选的血细胞溶解条件可优选地使血液微生物混合物中的血细胞均质化，例如在败血症血液培养样品中所发现。均质化需要以足够的水平发生(形成流体)，从而允许不需要的血细胞流体从进料侧(保留需要的微生物细胞)通过过滤器进入滤液侧，从而有效地分离这两种群体。这些溶解条件能够使微生物细胞保持完整，从而能够通过持留微生物细胞而对均质化的血细胞进行快速/灵敏的过滤式分离。
[0037]根据本发明，采用了不同的血细胞分解以及其所得细胞碎片的充分均质化，以将血细胞减少到能够采用不同的可滤性的流体水平，此处过滤器将微生物保留在进料侧，从而为了随后的无菌流体 分析而分离完整的微生物。所属领域的技术人员已知的过滤器孔径，即，直径在0.4511!11、0.2211111、0.1 um之间的孔径是足够的。然而，取决于微生物以及不同细胞碎片的尺寸可滤性，这些有效的孔径也可以是小于0.1或者大于0.45的。各种条件包括但不限于清洁剂、蛋白酶、离液剂、变性剂以及核酸酶的优化组合以获得期望的效果。
[0038]微生物特异性原位过滤在本文中被定义为采用物理的以及生化的细胞壁溶解方法，在过滤器进料侧捕获微生物以及/或者随后在原位应用的微生物特异性分析物试验。此外，本文中“原位”是指溶解以及/或者随后的分析是发生在不期望的干扰细胞(即，血细胞)的差异性分离之后，而期望的微生物细胞则仍然保留在过滤器的进料侧。因此，预期所捕获的微生物很有可能悬浮在用于加载和洗涤过滤器的残余进料过滤器溶液中。用于溶解这些现在为分离的、完整的以及进行了过滤的微生物所采用的物理力是所属领域的技术人员所熟知的那些，包括但不限于细胞壁酶消化。此外，根据本发明，所有微生物的原位过滤器声波降解法是通过直接探针接触残余液体，所述残余液是由含有分离的微生物的过滤侧上的表面张力保留的，替代性地通过声波探针接触过滤器的距离微生物的相对侧，并且通过孔而非通过固体过滤材料来传递其溶解能。此外，还意外地发现细菌和酵母的原位滤珠磨机微生物溶解的效能也发生在封闭的微离心管中，如同在捕获刺入到血液中的微生物之后直接作用在过滤器进料表面上，其中血细胞被分化溶解并且单独地进行了过滤。通过这种方式，本文中所定义的原位过滤是败血症样品制备的精致的简化，带来了具有较少的操作、较少的潜在污染风险、手动的以及自动装置设计的更加灵活的模式的更加有效的处理。
[0039]如下文的实例中所使用，过滤是作为所属领域中常用的术语来使用，即，用于将固体从流体(液体或气体)中分离的机械或物理操作，方法是插入一种介质使得只有流体能够通过。在典型的简单过滤中，被过滤的液体中的过大尺寸的颗粒无法通过过滤器的晶格结构，而流体以及小颗粒可以通过，成为滤过物。
[0040]实例I
[0041]进行实验以对通过DNA聚合酶(PolMA)的原位滤珠磨机微生物溶解和分析物的分析，以及通过量化基因特异性PCR的基因组DNA进行比较。所得结果示于附图的图1中描绘的表格中。
[0042]如同本文中所采用的，在比较相对qPCR值时，δ Ct值必须大于2才能够作为显著
性差异。
[0043]结果和结论:
[0044]起始输入微生物刺入值与对应的过滤后获得的样品之间的相对qPCR差值通常示出了刺入到血液中的多种微生物的非常高的％恢复率，所述多种微生物随后在过滤器的进料侧被捕获，然后在所述过滤器的进料侧被滤珠磨机溶解，这在本文中称作“原位过滤器磨机”。在PCR可以测量的14种不同的微生物中，只有四种(所有的假丝酵母)(28%)示出了显著的PCR恢复差异。对于这些酵母，在这些相同的样品中存在可测量的DNA聚合酶活性的增强。总体上，这表明了带来了较高的DNA聚合酶活性以及可以扩大的基因组DNA的良好的恢复以及高效率的原位过滤器磨机。出乎意料的是，用加粗的红色表示的显著性负值表明根据本发明的依赖于原位过滤器的PolMA可以是微离心管中的显著改进的标准研磨。
[0045]根据本发明溶解产物中的微生物的检测策略可以总结在本文的附图，即图2中。
[0046]实例2
[0047]本发明的一项实施例的该实例表明本发明的规避了传统的DNA分离技术的必要性，并且能够确保使用基于微生物溶解产物直接探针的PCR技术的执行的适用性。
[0048]a.将金黄色葡萄球菌刺入到标准的血液培养基中(假丝酵母共有试验，大肠杆菌、屎肠球菌)，随后是WBC清洁剂+底物溶解、制成小球以及洗涤。
[0049]b.发现的是在使用T.aqMan探针以及SYBR的直接溶解产物PCR之后，根据本发明的直接探针流程在每种情况下就PCR中％溶解产物的较高的容限(高达17%)而言具有优势，且在30ul PCR中在5ul研磨溶解产物中的至少5000个微生物中没有检测到抑制。
[0050]血液培养基阳性瓶将含有培养基的大约4000个微生物/ml，在准备过程中放置2ml将获得8000个微生物/50ul溶解产物，其中30ul PCR反应中的5ul=PCR中的160个微生物(上限BC水平所需要的试验容限)。目前估计BC检测的限制为500个微生物/瓶或者10个微生物/ml，因此5ul=2。如果10个微生物/瓶(通常)，那么5ul=0.2微生物，那么需要翻6翻的子代数以达到=640/瓶，该数目是可以检测到的。
[0051]c.相应地，根据本发明示出了 SA微生物通过了(离液剂+清洁剂)Mc^Ysis缓冲物以及DNA酶处理，随后是ITE小球以及洗涤，它们与磨机直接探针PCR兼容。本发明的新颖的改进的方法的是通过在所使用的血液磨机直接系统中的改进示出的，是就优于传统技术的敏感度以及％血液的容限而言的，方法是对没有变性剂的血液培养珠磨机系统(贝克顿迪金森(Becton Dickinson)葡萄球菌S/R试剂盒,可从贝克顿迪金森公司购得),其中只有1/10e6th的样品在PCR中，与具有变性剂(DoE:胍/吐温，氚核/NaOH，吐温/氚核等)的本发明的改进所提供的系统进行比较。
[0052]实例3
[0053]在本发明的发展期间进行的实验表明胰蛋白酶以及DNA水解酶的添加确保了在根据本发明对两种“困难的”临床样品进行处理期间观察到的堵塞的显著减少，如同本文所附的图3中的流程图所示。
[0054]对于所属领域的技术人员而言应理解的是本发明的广泛的基本原理以及教示能够应用于对多种生物组织样品(包括，但不局限于，血液、体液，以及软组织)的启用变性剂的原始分解产物(珠磨机以及超声波)直接探针/SYBR-PCR的所有变体进行优化，所针对的不仅是上文具体描述的SA，还可以针对多种病原体，例如，任何细菌、真菌、病毒、寄生虫等。
[0055]上述实例还表明本发明所提供的实践可以有效地压制特定的信号，所述信号是来自界定的混合物中被杀死的细胞或者是穿刺有活细胞以及被杀死的细胞的界定的混合物的环境样品。还值得注意的是根据本发明的样品处理是将细胞膜受损的细胞排除于分析之外的较好的方式。
[0056]综上所述，本发明提供了能够确保在进一步的下游分析之前的细菌种群的快速且易于执行的预处理的新颖的方法。虽然对于所属领域的技术人员而言本发明的多种潜在的应用是显而易见的，但是本发明所提供的方法可以对多个领域中的基于DNA的诊断造成重大的影响，包括病原体诊断、生物恐怖主义以及微生物生态学。
[0057]在本发明的优选实施例的实践中，显而易见的是由于细胞不会生长，使用来自单个血细胞培养基的单独的但是相等的整除数的示出了微生物目标信号的显著的增长的在至少两个单独的时间点处的任何PCR测量结果，一定是由于微生物生长造成的，从而指示了活性微生物的存在(不考虑污染的影响)。应理解在活性细胞溶解以及PCR建立(排除了任何由PCR过程造成的污染)之前，当所有的死细胞DNA已被清除时，血液的基于非生长的单个点阳性PCR分析将指示活性微生物的存在。这可以通过DNA酶解以及洗涤掉死细胞DNA来说明。
[0058]虽然本文是专门参考PCR的，但是还应理解本发明的改进并不局限于PCR或者类似的方法。在本发明中使用的构思出的扩增试验包括，但不局限于，其他熟知的核酸类技术，例如，DNA扩增试验、并入热稳定聚合酶的PCR试验以及恒温扩增方法。应理解所属领域的技术人员可以构思出可用于本发明的实践中的多种适当的扩增方法，因此本发明并非意图局限于此。
[0059]应理解本发明可以应用于涉及DNA诊断的所有方法、流程以及过程中。此类应用的实例包括，但不局限于那些涉及食品、水安全、生物恐怖主义、医学/药学以及/或者任何涉及病原体检测的应用。在食品工业中，本发明可以用于监测防腐剂的功效。本发明所述的方法具有应用到所有细胞中的潜能。虽然在实例中列举的是细菌细胞，但是所属领域的技术人员可以轻易地发现本发明的方法可以应用到多种其他细胞类型中。本发明还可以用于对干扰细胞膜和/或杀死细胞，例如，细菌细胞，的物质进行鉴别。由于多药耐药性生物体的繁盛以及在卫生机构与病人中的传播，新的消毒剂和/或抗生素的鉴别已成为目前的优选考虑事项。
[0060]还应理解本发明的方法与量化PCR结合起来形成的一种工具，能够快速且成功地识别消毒剂和/或抗生素的影响，而无需花费时间培养细胞并且等待细胞生长。在一些实例中，可能需要花费很多天甚至很多周来培养生物体，因此将要花费大量的时间来观察候选物质是否能够杀死微生物等细胞。在其他实例中，某些生物体不会在细胞培养基中生长，因此难以确定某一物质是否是有效的。因此，采用本发明的新颖的方法可以节省鉴别新型的消毒剂和/或抗生素的时间以及资源。
[0061]根据本发明的新颖的方法的另一优势在于易于使用。例如，通过使用这些方法，可以轻易地针对活性细胞(例如，细菌)的存在对大量的样品进行检测。例如，可以针对具有完整的细胞膜的潜在存活的细菌的存在来对样品进行检测。在另一实施例中，可以针对活性细胞(例如，细菌)的存在对环境样品进行测试。这些样品可以是，例如，从土壤或者植物的一部分中收集的。根据本发明的方法还可以用于在排放之前和之后对处理过的污水进行检测。
[0062]根据本发明的方法还可以用于检测医药学样品，例如，粪便样品、血液培养物、唾液、组织样品(以及切片)、创伤材料、尿液、以及来自呼吸道、植入物和导管表面的样品。
[0063]根据本发明的方法的另一应用领域可以是食品控制。在其他实施例中，食物样品是从牛奶或乳制品(酸奶、乳酪、甜乳酪、黄油以及脱脂乳)、饮用水、饮料(梓檬水、啤酒以及果汁)、焙烤产品或者肉制品中获得的。本发明的方法可以确定食物中的防腐剂或者食物的杀菌处理(例如，巴氏杀菌)能否能够阻止细胞的生长。根据本发明的方法的另一应用领域是药学产品以及化妆品的分析，例如，软膏、乳膏、酊剂、汁液、溶液、液滴等。
[0064]本发明的方法解决了较长的培养时间(在许多天的范围内)的问题，使得老式的方法不适于及时的警告以及防范措施。此外，基于当前PCR的方法可以给出假阳性的结果(针对某一生物体测试出阳性，但是该生物体并不是活性的)。此外，近期的研究表面一些生物体可以在某些情况下丧失复制的能力，即使它们仍然是活性的。这些“存活但是无法进行培养”(VBNC)的细菌是无法使用传统的培养方法来检测的，但是如果将它们转移到更加合适的环境中，那么它们可能重新获得生长的能力。这些缺点的解决可以通过采用分子学方法，基于对这些生物体的基因材料/DNA的检测并结合本发明的方法。因此，涉及例如，污染的水、废水、食物、药品和/或化妆品等样品中的活性生物体的快速和精确的结果，可以防止被污染的物质被释放到公共环境中。与目前耗时较多的方法相比，本发明的方法可以节约资源，通过的是将假阳性(针对某一病原体测试结果为阳性，尽管该病原体并非是活性的)结果最小化以及样品的快速检测。
[0065]此外，本发明的方法可以识别用于生态学研究、农业上特定土壤的健康以及/或者生态系统的微生物群落的潜在的具有活性成员。传统上，细菌群落的识别是使用基于培养的方法或者平板计数来进行 的。计数的种群越多，则会在原始的样品中估计出越多的细菌，然而，有时由于较长的培养时间(在很多天的范围内)引发的问题使得这种方法不适于即使的且精确的结果。需要使用本发明的方法来克服这些缺点。
[0066]可以使用本发明的方法来进行分析的或者使用本发明的方法在样品中检测潜在活性的细菌的非限制性实例，除了上文描述的SA之外，还包含:百日咳杆菌、钩端螺旋体波莫纳群、甲、乙、丙型副伤寒沙门菌、白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒菌、产气荚膜杆菌、气肿疽梭菌以及其他气性坏疽细菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、败血性巴氏杆菌、脑膜炎双球菌、奈瑟氏淋球菌、流感嗜血杆菌、放线菌(例如，诺卡氏菌)、不动杆菌、芽孢杆菌(例如，炭疽杆菌)、拟杆菌(例如，脆弱拟杆菌)、芽生菌、博德氏杆菌、疏螺旋体(例如，伯氏疏螺旋体)、布鲁氏菌、弯曲杆菌、衣原体、球孢子菌、棒状杆菌(例如，白喉杆菌)、大肠杆菌(例如，肠毒性大肠杆菌以及肠出血性大肠杆菌)、肠杆菌(例如，产气肠杆菌)、肠杆菌(克雷伯氏菌)、沙门氏菌(例如，伤寒杆菌、肠炎沙门氏菌、沙雷氏菌、耶尔森氏菌、志贺氏杆菌)、丹毒丝菌、嗜血杆菌(例如，B型流感嗜血杆菌)、螺杆菌、军团杆菌(例如，嗜肺军团杆_、钩端螺旋体、李斯特菌(例如，单核细胞增生李斯特菌)、支原体、分枝杆菌(例如，麻风分枝杆菌以及结核分枝杆菌)、弧菌(例如，霍乱弧菌)、巴斯德氏菌、变形杆菌、假单孢菌(例如，绿脓杆菌)、立克次氏体、螺旋体(例如，密螺旋体属、钩端螺旋体属、疏螺旋体属)、志贺氏杆菌属、脑膜炎球菌、肺炎球菌以及所有的链球菌(例如，肺炎链球菌以及A3、B，以及C类链球菌)、脲原体、梅毒螺旋体、金黄色葡萄球菌、溶血性巴式杆菌、棒状杆菌、白喉类毒素、脑膜炎球菌多糖、百日咳杆菌、肺炎链球菌、破伤风杆菌类毒素，以及牛型结核杆菌。上述列表仅仅是说明性的，而并非意图将本发明限制为检测这些特定的细菌生物体。
[0067]本发明的一项尤其优选的实施例使用的是PCR。PCR的常规的流程教示于第4，683，195号美国专利申请案(穆利斯等人)以及第4，683，202号美国专利申请案(穆利斯等人)。然而，用于每次扩增反应的最佳PCR条件通常是根据经验确定的或者是使用所属领域的技术人员通常采用的计算机软件来评估的。多种参数都会影响反应的成功。它们中的一些是退火温度和时间、延伸时间、Mg2+、pH以及引物、模板、脱氧核苷酸的相对浓度。通常，模板核酸的变性是通过在聚合酶反应之前在至少大约95°C下加热I至10分钟进行的。执行大约20-99个扩增循环，使用的是在90°C至96°C的范围内的大约0.05分钟至I分钟的变性，在48°C至72°C的温度范围内的大约0.05分钟至2分钟的退火，以及具有最佳末循环的在68°C至75°C的范围内的至少01分钟的延伸。在一项实施例中，PCR反应可以含有大约IOOng模板核苷酸、20uM的上游引物和下游引物，以及每种类型的0.05至0.5mm dNTP，以及0.5至5单元的可购得的热稳定DNA聚合酶。
[0068]传统的PCR的一项变体是逆转录PCR反应(RT-PCR)，其中逆转录酶首先将RNA分子转化为单链的cDNA分子，随后将该cDNA作为模板用于聚合酶链反应中随后的扩增。RNA的分离是所属领域中所熟知的。为了执行RT-PCR，通常在目标核酸经加热变性之后将逆转录酶添加到反应样品中。随后将反应维持在适当的温度(例如，30-45°C)下足够的时间(10-60分钟)以在计划的扩增循环开始之前生成cDNA模板。所属领域的一般技术人员会理解如果期望获得定量的结果，那么必须小心地使用一种方法以维持或者控制扩增的核酸的相对的拷贝。“定量”扩增的方法是所属领域的技术人员所熟知的。例如，定量PCR可以涉及使用相同的引物的同时对已知量的对照序列进行共同扩增。这提供了可以用于校准PCR反应的内部标准。
.[0069]PCR的另一替代方案是定量PCR (qPCR)。qPCR可以使用竞争性技术来进行，采用的是通过小片段的插入或者删除而与目标产物尺寸不同的内部同源对照。然而，也可以使用非竞争性以及动态定量PCR。实时的动态PCR检测与可以和目标序列同时进行检测的内部同源对照的组合会是非常有利的。
[0070]PCR、RT-PCR和/或qPCR的引物是从某些区域或者特定的细菌中选择的，所述引物仅对为特定的生物体选择的DNA区域进行扩增。或者，所选择的引物会对所有生物体通用的DNA部分进行杂交和扩增。引物的选择和构建是所属领域所熟知的。通常，一种引物位于待扩增的序列的每一端。此类引物的长度通常在10至35个核苷酸的范围内，并且具有的优选的长度在18至22个核苷酸的范围内。可以进行扩增的最小的序列的长度为大约50个核苷酸(例如，正向引物和反向引物的长度都为20个核苷酸，所述引物在序列中的位置至少由10个核苷酸隔开)。可以对更长的序列进行扩增。一种引物被称作“正向引物”并且位于待扩增的区域的左端。正向引物的序列与DNA的上游链的区域中的序列相同(当按照惯例描绘双链DNA时，其中上游链被示为具有5’到3’方向的极性)。所述正向引物的序列使得它与同DNA的上游链互补的DNA链杂交。另一种引物被称作“反向引物”并且位于待扩增的区域的右端。反向引物的序列使得它在序列上互补于DNA的上游链中的一个区域，即，它是DNA的上游链中的一个区域中的序列的反向互补。反向引物与DNA的上游端杂交。还可以根据多种其他条件来选择PCR引物。PCR引物应该足够长(优选地为10到30个核苷酸长)，以对杂交进行最小化，使其大于模板中的一个区域。如果可能的话，应该避免具有较长的单个碱基的引物。引物优选地具有大约在40%至60%之间的百分G+C含量。如果可能的话，引物的3’端的百分G+C含量应该大于引物的5’端的百分G+C含量。引物不应具有可以在该引物中与另一序列杂交的序列(即，回文序列)。在相同的PCR反应中使用的两个引物不应具有彼此杂交的能力。虽然优选地为根据上述推荐内容来选择PCR引物，但是引物也不一定必须符合于这些条件。其他引物也可能是可行的，但是获得较好结果的几率较低。
[0071 ] 可以用于在给定的序列中扩增DNA的PCR引物的选择可以使用能够获得的多种计算机程序中的一种。此类程序可以选择出用于给定序列的扩增的最佳引物(即，此类程序根据上述条件，外加可以使PCR引物的功效最大化的其他条件来选择引物)。一种计算机程序是遗传学计算机组(Genetics Computer Group) (GCG最近成为Accelry)分析程序包,其具有用于选择PCR引物的例程。
[0072]下文所披露的寡核苷酸引物和探针可以按多种方式制备。制备这些寡核苷酸的一种方式是使用可购得的核酸合成仪来合成它们。存在多种此类合成仪，并且它们是所属领域的技术人员所熟知的。
[0073]可以用于与本发明结合使用的PCR的另一种替代物是用于检测特定DNA或RNA目标的恒温核酸扩增试验。核酸的恒温扩增的非限制性实例是均一实时链取代扩增、用于DNA测序的模板的基于Phi29DNA聚合酶的滚环扩增，由PNA开放剂协助的双螺旋DNA序列的滚环扩增或者DNA分析物的环介导恒温扩增。
[0074]还可以通过杂交方法类检测核酸。在这些方法中，可以将标记的核酸添加到含有标记的或者未标记的核酸探针的底物中。或者，可以将未标记的核酸添加到含有标记的核酸探针的底物中。杂交方法披露于，例如，马克?索那(Marc Schena)的微阵列分析(MicroArray Analysis),约翰?威利父子出版公司(John Wiley and Sons),新泽西州霍博肯,2003。
[0075]检测核酸的方法可以包括标记的使用。例如，可以使用感光膜或者磷光影像分析仪(用于对并入的放射性磷进行检测和量化)来检测放射性同位素标记。可以使用光探测器对荧光标记进行检测和量化以检测发射的光(参见第5，143，854号美国专利，作为示例性仪器)。酶标记的检测通常是通过提供与底物一起的酶，并且对所述酶在底物上的反应所生成的反应产物进行测量。通过简单的 将彩色的标记可视化就可以检测出比色标记。在一项实施例中，扩展的核酸分子的可视化是通过直接用核酸嵌入染料对扩增产物进行染色。对于所属领域的技术人员而言显而易见的是，示例性染料包括，但不局限于，SYBR green,SYBR blue、DAP1、碘化丙锭、Hoeste, SYBR gold以及溴化乙锭。嵌入到扩增的DNA分子中的发光染料的量与扩增产物的量成正比，可以方便地使用Flurolmager (分子动力学)或者根据制造商说明书的其他等效的装置来量化所述染料。这种方法的一个变体为扩增产物的凝胶电泳，随后是选定的嵌入染料的染色和可视化。或者，标记的寡核苷酸杂交探针(例如，荧光共振能量转移(FRET )探针以及比色探针等荧光探针)可以用于检测扩增。如果需要的话，那么代表被检测的生物实体的基因组序列的特异性扩增的证实，可以通过测序或者表明扩增产物具有预测的大小、展现出预测的限制性降解模式，或者与正确的克隆的核苷酸序列进行杂交。
[0076]本发明还包含试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含用于对与特定的生物体或通常的生物体对应的核酸分子进行扩增的引物、用于分离DNA的缓冲液和试剂，以及用于PCR的试剂。所述试剂盒还可以包括可以检测到的标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸被杂交到一条核酸序列上，所述核酸序列对与关注的生物体相对应的多肽进行编码。所述试剂盒还可以包含一种对照样品或者一系列对照样品，可以对所述对照样品进行分析并且与所含有的测试样品进行比较。所述试剂盒的每种组分都可以封装在独立的容器中，并且所有这些容器与用于理解使用所述试剂盒所进行的分析的结果的说明书一起可以存在于一个单个的包装中。
[0077]本申请文件中引用的所有的参考、专利案以及公开专利申请案的内容在本文中以引用的方式并入，如同每个独立的公开案、专利案或专利申请案都是特定的且独立的以参考文件的方式并入的。
[0078]上述细节描述仅仅是出于便于理解的目的而给出的，而不应从中理解出任何不必要的限制，而对其进行的修改对于所属领域的专业人员而言是显而易见的。不应认为本文所提供的任何信息为现有技术或者关联于当前主张的发明，或者任何明确的或者暗示的参考的公开案为现有技术。
[0079]除非另外界定，否则本文中所使用的所有技术和科技术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。
[0080]虽然本发明是结合其特定的实施例来描述的，但是应理解可以做出进一步的修改，并且本申请文件意图涵盖大体上遵照本发明的原理的本发明的任何变体、应用，或者调整，并且包括本披露的此类扩展内容，即在本发明所涉及的领域内的已知的或者惯常的实践的范围内的、可以应用到上文提出的基本特征并且遵照所附权利要求书的范围的。
[0081]并且，虽然上文描述了且具体实例化了本发明的某些优选实施例，但是这并非意图将本发明限制于此类实施例，并且任何此类的限制仅包含在上文的权利要求书中。
【权利要求】
1.一种利用分子检测从含有活细胞和死细胞的混合物中选择性排除死细胞DNA的方法，所述方法包含除去死亡微生物细胞，随后从核酸扩增试验中获得阳性未污染结果，从而指示存在活细胞；从所述扩增试验中测量到两个或更多个时间点的微生物特异性信号增强作为活微生物存在的指示；通过添加化学变性剂从所述混合物中清除扩增试验抑制剂；以及确定所述混合物中存在的活微生物和死微生物的比率。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物中存在的活微生物与死微生物的比率的确定可以用作治疗有效性或治疗功效的量度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学变性剂包含一种或多种化学试剂的混合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增试验为PCR试验。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含血液以及其他体液。
6.根据权利要求4所述的方法，其中执行所述PCR试验提供与菌血症以及真菌血症样品中的活微生物细胞的相关性以便诊断败血症。
7.根据权利要求1所述的方法，其中抑制所述混合物中死细胞的信号，并且从分析中排除所述混合物中的膜 受损细胞。
【文档编号】G01N33/48GK103476945SQ201180065315
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2011年12月27日 优先权日:2010年12月31日
【发明者】肖恩·马克·奥哈拉 申请人:宙斯科技公司