用于生物学样品中大量荧光标记物的定位的系统和方法

专利名称：用于生物学样品中大量荧光标记物的定位的系统和方法
技术领域：
本发明总体涉及聚焦带电粒子束系统，并且具体地涉及用于对样品中的荧光标记物进行激发和定位的系统。
背景技术：
目前生物学研究正在日益集中于将多种细胞组分的细胞内位置确定至甚至更高的空间分辨率。对于电子显微镜(TEMs、STEMs、SEMs等)以及所有类型的光学显微镜，这涉及用以增强图像分辨率和对比度的很多不同的技术，包括最新的超分辨率技术。对于细胞结构、转运、代谢和运动的研究获得广泛认可的一种强效技术是应用 重组遗传技术将“报告”基因连接到“目标基因”(GoIs)上。因此，当特定GoI在正常的基因转录/翻译过程中表达时，报告基因也将表达，产生末端附着于由GoI编码的“目标蛋白质”(PoI)上的小蛋白质。一种公认的报告基因是编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因，这些报告基因可以以野生形式或者经遗传修饰的形式利用，并且所表达的GFPs具有发射波长从蓝色扩展至黄色的荧光。GFP相对小(29.6kDa，直径为3nm，长度为4nm)，其中其发色团被充分地保护在里面并且不需要任何辅因子以发射光。使GFP “发光”所需要的所有条件是利用波长比GFP的发射波长稍短的激光进行照射。GFPs显示对其所附着的PoI的适当功能基本上是“惰性的”，这在一些情况下通过利用短且灵活的多肽“接头”使GFP与PoI相连得以保证，所述接头使得GFP能够自由围绕蛋白质而摇摆，这可能是为了保持研究者所研究的细胞功能而必须不被干扰的一些胞内结构或者机制的一部分。显然，如果可以精确地确定GFP在细胞内的X-Y-Z位置(比如说精确度为IOnm)，则可以以类似的精确度得知PoI的位置。可以通过光学显微镜观察发荧光的GFP，因而可以在显微镜中看到PoI相对于样品中可观察到的结构的位置。已经提出并且在一些情况下阐述了现有技术中的几种技术，其用于由多种荧光标记物(FMs)例如GFPs以及量子点获得主要的位点信息。在一种技术中，使用绿色激光对样品中的荧光标记物(FMs)中的一小部分进行激发，接着使样品成像。利用高斯曲线(Gaussian curve)拟合,可以在基本小于成像系统的衍射极限的20nm的FWHM内确定FMs的位置。利用多次绿色激光闪光并且交替使用使荧光消失的红色荧光闪光，可以在通常可耗费数十分钟的过程中确定大量FMs的位置。在描述于Buijsse等人的美国专利号7，317，515 “对荧光标记物进行定位的方法”(转让于本申请的受让人，通过引用并入本文)的另一种技术中，带电粒子束对样品表面进行扫描，当束击中FM时破坏标记物并使荧光消失。当荧光消失时，FM的位置对应于带电粒子束的位点。由于可以将带电粒子束聚焦于比照射标记物的激光小得多的点，并且可以非常精确地确定扫描过程中任何时间处带电粒子束的位点，FM的位点以及因而PoI的位点可以以类似的精确度确定。在本文对本发明的所有描述中，术语GFP将用于表示可以被带电粒子束(包括电子或者离子)破坏的FMs较大家族，包括GFPs、有机染料以及无机标记物例如量子点(通常使其功能化，以使得能够选择性地附着于特定细胞内组分例如蛋白质、核酸等上)。
用于对生物学样品中的FMs进行定位的很多现有技术方法仅对相对少量的FMs起作用，从中在任何一次使小的子集活化，因此成像时间可以是很多分钟并且仍然受到光学成像的一些限制。使用带电粒子束选择性地破坏样品中FMs的现有技术方法利用了仅能够处理相对少量FMs的图像处理方法，对于这些方法，统计学信噪比将其应用限制于不固有地以大密度出现的FMs。这特别是对于GFPs存在障碍，因为在基因转录成mRNA随后翻译成蛋白质(GoI+接头+GFP)的正常细胞过程中可以产生非常大量的任何类型的可表达标签(与功能化标签例如量子点相对)。因此，需要一种快速的方法以在时间框架内例如I分钟级对细胞内或者细胞组分中非常大量(彡10000)的FMsjB CFPs进行定位。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种改进的方法和设备，以定位样品中的目标蛋白质。一个优选的实施方案包括能够使含有荧光标记物(FMs)，例如绿色荧光蛋白(GFPs)或者量子点的样品成像的带电粒子设备和方法，其中利用标准的电子显微信号，例 如二次电子(secondary electrons, SEs)或者透射电子(未散射、弹性散射和/或非弹性散射)，同时利用激光激发FMs并收集由被激发的FMs发射的光。—个实施方案包括一种检测器光学器件(detector optics)配置,其对于二次电子和发射光均表现非常大的收集立体角，其中不存在两种类型检测器之间的干扰，所述干扰会倾向于使Ses和光各自的收集立体角减小。本发明的一些实施方案包括一种示例性图像处理方法，与利用现有技术中较简单的图像处理方案而可能发生的相比，其潜在地能够同时对较大(例如> 10000)数目的FMs进行定位(在持续大约I分钟的单次成像扫描过程中)。前面相当宽泛地概括了本发明的特性和技术优点，以便可以更好地理解以下对本发明的详细描述。本发明的附加特性和优点将在下文中描述。本领域技术人员应当理解的是，可以容易地利用所公开的构思和具体实施方案作为改动或者设计其他结构的基础，以实施本发明的相同目的。本领域技术人员还应当认识到，这种等同构造不背离所附权利要求中所说明的本发明的精神和范围。


为了更全面地理解本发明和其优点，现参考以下描述以及所附附图，其中图I显示目标蛋白质(PoI)的示意图，其中绿色荧光蛋白(GFP)通过接头附着于其上。图2是X-Y扫描光栅的示意图，图解了含有GFPs的像素和不含GFPs的像素。图3是本发明的第一个实施方案的示意图，其包括位于样品上方的检测器光学器件。图4A是图3中的检测器光学器件的光和二次电子轨迹的侧视图。图4B是图3和4A中检测器光学器件的剖面等轴视图。图5是本发明的第二个实施方案的示意图，其包括位于样品下方的检测器光学器件。图6是本发明的第三个实施方案的示意图，其包括位于样品上方和下方的检测器光学器件。图7是在对含有100个GFPs的扫描场进行光栅扫描的过程中信号作为时间函数的图。图8是显示图7中图表初始阶段的特写图，其显示总共100个GFPs中前8个GPFs的破坏。图9是在对含有10000个GFPs的扫描场进行光栅扫描的过程中信号作为时间函数的图。
图10是显示图9中图表初始阶段的特写图，其显示总共10000个GFPs中前8个GPFs的破坏。图11是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号和平滑信号作为时间函数的图，其显示总共100个GFPs中前3个GPFs的破坏。图12 是显不平滑函数和导函数(smoothing function and the derivativefunction)的图。图13是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号、平滑信号和平滑导数作为时间函数的图，其显示总共100个GFPs中前3个GPFs的破坏。图14是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号和平滑信号作为时间函数的图，其显示总共10000个GFPs中前3个GPFs的破坏。图15是显示光栅扫描过程中具有统计噪声的原始信号、平滑信号和平滑导数作为时间函数的图，其显示总共10000个GFPs中前3个GPFs的破坏。图16是显示图像处理方法的性能的柱状图，所述方法用于对扫描场中总共10000个GFPs中的前3个GFPs进行检测的过程中在大量统计噪声的存在下确定扫描信号内GFPs的位置。图17是该图像处理方法的优化结果图。图18是本发明中用于对样品中的可表达标签例如GFPs进行定位的方法的流程图。图19是本发明中用于对样品中的功能化标签例如量子点进行定位的方法的流程图。图20是联合二次电子和荧光标记物图像的示意图。图21是用于对荧光标记物进行定位的图像处理方法的流程图。
具体实施方案本发明的一些实施方案提供了带电粒子系统，其包括检测器光学器件系统，其经优化以同时对二次电子和光的收集效率均非常高，而不存在两种类型检测器之间的空间干扰。在一些实施方案中，这通过样品上方和/或下方的至少一个镜、优选抛物面镜以使由带电粒子束碰撞的样品表面上的点在或接近于抛物面(一个或者两个)的焦点而完成。焦点“接近于”带电颗粒是指由镜反射的光所照射的区域包括并且大于带电粒子束所碰撞的区域。此外，抛物面光镜的传导表面(通常是金属的)是被电偏置(通常负几百伏)，以在样品和镜之间提供电场，使二次电子偏转以使其不碰撞镜并将二次电子反射至检测器。因此，从样品发射的光子和二次电子(SEs)均可被收集入大的立体角中，优选大于π/4球面度，更优选大于η/2球面度，甚至更优选大于π球面度，提供其中光和SE立体角空间上分离并且互相干扰的检测器系统以前不能达到的效率(和产生的较高信噪比)。优选使二次电子检测器位于带电粒子束离开图3、4Α和4Β中镜314的点的下方。除了这些高效光检测系统之外，一些实施方案中提出光信号的统计(随机)噪声问题。这种噪声源于本发明的成像模式利用由于高能带电粒子(电子或者离子)束对单个FMs例如GFPs的选择性破坏对每个FM进行定位。破坏单个FM导致来自样品的总光发射的增量损耗，例如如果总共10000个FMs中一个FM被破坏，那么所发射的光将减少大约
0.01%。为了检测光发射的这种少量减少，在该示例中，像素滞留时间内由于光发射中的波动而产生的随机噪声的平均值基本上不大于O. 01%是有必要的。现有技术中已经描述了对于较少量FMs的类似方法，如转让于本发明的受让人的美国专利号7，317，515。在所有这些情况下，可以定位的FMs数量受到限制。 由于样品中来自标记物(如GFPs、有机染料、或量子点)的突光发射而产生光学信号中这种改进的信噪比的益处被本发明的另一方面进一步放大，所述另一些方面是图像处理方法，其使得能够确定FM破坏事件的时间(以及因而其位置)，即使在原始成像信号中随机噪声非常大的情况下。作为可表达标签的荧光标记物图I显示目标蛋白质(PoI) 102的示意图100，其中绿色荧光蛋白(GFP) 104通过接头肽110附着于其上。通常GFP的直径106为3nm，长度108为4nm，此处省略GFP104 “ β -桶，，(“ β -barrel”)结构的细节。一般来讲，如所显示，PoI 102将大于GFP 104。使用可表达标签中一个重要的考虑因素是标签不干扰PoI 102在细胞内的适当功能，无论该功能是代谢性的、转运、结构性的等。因此，常常用短肽接头110使非常刚性的GFP 104附着于PoI 102上，使GFP 104能够在半径114的孤112周围摇摆，如所显示的。注意的是，半径114决定能够确定GFP 104位置的最大精确度，因为GFP 104自由地占据环112上的任何位置。因此，可能将GFP 104的位置确定在5至Snm内对于本发明中以及现有技术中任何位点确定方法来说均是足够的，所述现有技术例如描述于转让于本发明的受让人且通过引用并入本文的美国专利号7，317，515中。对于报告基因的重组连接基因方法是熟知的，例如对于来源于水螅虫类水母种维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的多种“绿色突光蛋白”(GFPs)形式。自从最初于1950s发现GFPs以来，已经开发了几种遗传变体，其具有改进的荧光谱，发射范围从蓝光跨越至黄光，具有简化的光谱吸收分布。GFPs是相对小的圆柱体(“β_桶”，直径为3nm，长度为4nm)，其包含238个氨基酸(26. 9kDa)，显示对可远离水母的物种的全部细胞机制基本上是“惰性的”。因此，GFPs的使用在生物学群落中被广泛认可。尤其重要的是，对GFPs作为可表达标记物的广泛认可使得本发明潜在地在目前的GFP定位方法不够精确的应用中对生物群落极其有用。在下面对三个实施方案的操作的描述中，GFPs应当理解为包括多种GFP变体，其表示在被测生物学样品中同时表达的多种重组报告基因。类似地，三个实施方案中的光检测器应当理解为包括独立运行并且并行的多个检测器，其中每个对来自样品中多种GFP类型内的特定GFP类型的光进行检测。 本发明可以用于成像视场内存在较少量(10至数百个)GFPs的情况以及存在很多(直至至少10000个)GFPs的情况中。本发明的改进的图像处理方法可以用于这两种情况中。每个GFP变体具有其自己独特的光谱吸收和发射特征。一个示例是针对最初的“野生型”GFPs (WtGFP)，其在395nm下具有吸收峰，在509nm下具有发射峰。由于wtGFP在475nm下具有不期望的第二吸收峰，努力开发了改进类型，例如S65T突变，其在484nm下具有吸收峰，在507nm下具有发射峰，无第二吸收峰。使用GFPs作为可表达标签的一个关键方面是其可在样品中大量存在，使得有必要进行本发明的有效光检测和成像处理。荧光标记物在带电粒子系统中的成像方法图2是32 X 32的X-Y扫描光栅200的示意图，其展示了含有GFPs的像素208和不含GFPs的像素206。快速扫描轴202是沿X方向，而慢速扫描轴204是沿Y方向。对于正常的光栅扫描，首先使束位于左上方，接着沿顶部行移动至右上方。接着，束“折回”至左侧并且向下移动一行，随后再次水平扫描至右侧。重复该过程，直至使所有的32X32 = 1024个像素成像。在此处的示例中，白色像素206表示不含GFP的那些，而黑色像素208含有单 个GFP。假设GFP密度足够低，使得可以应用泊松(Poisson)统计法,而且我们可以近似认为无像素含有多于一个的GFP。由于GFPs是表示特定目标蛋白质(PoI)在细胞内(或者细胞切片内)的位置的可表达标签，GFPs的分布将常常是非一致的，表示PoIs的非一致分布，这是因为其适当功能所需的细胞内位置。下面提出了三种示例性系统配置，第一种配置可以应用于厚的样品，且收集来自样品前表面的所有信号(即以SEM模式运行)；第二种配置具有用于电子和光的检测器光学器件，其位于样品下方(即以TEM或者STEM模式运行)；并且第三种配置具有位于样品上方和下方的联合检测器系统，以提供对样品内被激发的FMs所发射光的最大可能收集效率。第一个实施方案-位于样品上方的检测器光学器件图3是本发明的第一个实施方案300的示意图，其包括位于样品306上方的检测器光学器件。样品306可以包括包含由与目标基因连接的基因表达的荧光标记物或者包含选择性地附着于特定的细胞内组分的无机标记物的生物学样品。样品306还可以包括包含染料或者其他无机标记物例如量子点(其被功能化以使得能够选择性地附着于特定的细胞内组分)的生物学样品。样品306处于限定样品平面的样品位点处的样品台上。带电粒子柱302例如电子束柱或者聚焦离子束柱产生带电粒子束304，其通过柱302聚焦于样品306表面的位置308处。束中的电子通常具有1，OOOeV至25，OOOeV的能量。离子通常具有5，OOOeV至5，OOOeV的能量。配置可以包含磁性线圈、静电多极或者磁性线圈和静电多极二者组合的X-Y束偏转器310，以使束304在样品306的表面上来回移动，通常如图2中以X-Y光栅模式进行成像。在本发明的本第一个实施方案300中，假设样品306足够厚，以阻止束304穿透样品306，因此收集样品表面上方的所有成像信号(光和带电粒子)，如所显示。抛物面镜314位于偏转器310和样品306之间。镜314中的孔312使得束304穿过向下至样品306。镜314下面是屏蔽平板316，通常其偏置为与样品306相等的电压。为了达到对光的最大收集效率，配置镜314，以在位置308处对向最大可能的立体角，优选大于Ji球面度。接着将收集位置308处由荧光标记物(FMs)发射的最大可能量的光，并传送通过分束器326，接着通过滤色器372，最后到达检测器360，这使得光学信号中可达到的信噪比最大化。
荧光标记物(FMs)通过来自激光器322的光324被激发，其向上发射，首先反射出分束器326，接着被抛物面镜314反射并聚焦于样品306表面上的位置308处。需要注意的是，最大可能地将来自FMs的发射的光传送通过分束器326是理想的，以增加到达检测器360的光量。如果分束器326的传送是50%，那么来自位置308的信号光327的一半将到达检测器360，且来自激光器322的激发光324的一半将到达位置308。因此，为了使来自激光器322的3mW聚焦于位置308上将需要6mW的激光输出324 (忽略其他反射损耗)。如果可以获得充足的激光功率，可优选使分束器326的传送增加(因而减少反射性)例如至80%。接着来自位置308的80%的光(再次忽略反射损耗)将穿过分束器326，而来自激光器322的光324的仅20%将到达位置308，因此为了使3mW聚焦于位置308，将需要15mW的激光输出功率324(12mW将穿过分束器326，在位于分束器326上方的束流收集器(未显不)中被吸收)。在本实施方案中，来自激光322的光被镜314反射至样品306的顶部表面， 即光在被镜314反射前不首先穿过样品306，且来自光源的光最初从样品上方照射样品。类似地，由样品306内的荧光标记物发射的光通过样品306的顶部表面发射，被位于样品306上方的镜314收集，并反射至光检测器360，而不如美国专利号7，317，515中所述完全通过样品306并在镜反面被收集。抛物面镜314的第二个功能是提供可以经电偏置的导体，以提供阻止二次电子碰撞镜314的电场，其通过使由于初级带电粒子束304的碰撞而从位置308处发射的二次电子(SEs) 322反射进行。这更加详细地显示于图4A和4B中。通过施加数百伏负电势至(导电的)镜表面，使SEs 322偏转。需要注意的是，SEs不以与光328相同的方式反射，因为SEs通过由施加至镜314或者其他导体的电压所产生的静电场反射，且该静电场延伸至抛物面镜314的整个体积(对于镜314的等轴视图参见图4B)。SEs 322向检测器320偏转并被显示位于样品306侧面的检测器320收集。因此，光和二次电子均从位置308被高效收集，因为光和SEs的收集立体角之间没有冲突。优选使孔312的大小保持在最小，以使光反射的损耗和对使二次电子偏转的静电场的任何扰乱均减少。抛物面镜314的焦点大约位于样品306表面上的位置308处，因此从位置308附近发射的光将聚焦入大致平行的光束328中，其指向图3右侧。尽管优选由导电镜产生引导SEs离开镜的电场,然而可以由与镜分离的导体产生电场。还可以对带电粒子检测器320的入口施加电偏置。系统控制器362通过电缆370与柱302、通过电缆368与X-Y偏转器310、通过电缆366与镜314、通过电缆376与屏蔽板316、通过电缆378与样品306、通过电缆380与SE检测器320以及通过电缆374与激光器322电连接。系统控制器362利用在监视器(未显示)上显现图像通过X-Y偏转器310调节束304的扫描，以及进行下面描述的图像处理运算，以确定样品表面上FMs的位置。通常带电粒子束必须在真空中行进，因此真空壳334包含柱302的出口、X_Y偏转器310、镜314、屏蔽板316和样品306，如所显示。通常使光学仪器尽可能地位于真空外面容易得多，因此视口 356使得来自激光器322的光327 (反射离开分束器326)穿入壳334，而使位置308处由FMs发射的光能够穿出壳334，通过分束器326，接着通过滤色器372并进入检测器360。滤色器372用于使能够穿入检测器360的激光激发光324的量减少。由于激发光常常具有比来自FMs的发射光短的波长，因此有可能调整滤色器372的通频带，以传送来自FMs的大部分光，同时阻断大部分激光。在一些情况下，检测器360内可发生额外的光过滤。电穿通器(Electrical feedthrough) 354使得电缆366、368和370穿入和穿出壳334，而穿通器352使得电缆376、378和380穿入和穿出壳334。用于高效收集光和二次电子的检测器光学器件图4A是利用SIMION射线跟踪(ray-tracing)程序产生的侧视图400,其显示图3中的检测器光学器件的光和二次电子轨迹。可以看到初级束304向下穿过抛物面镜314中的孔312通过。束304碰撞位置308处的样品306诱导发射二次电子332为余弦(朗伯定律(Lambert Law))分布。屏蔽板316和样品306 —般具有由系统控制器362施加相等的电压(参见图3)。对传导性镜表面314施加数百伏的负偏置，以排斥(O至50eV) 二次电子332，如所显示。这种反射不同于反光反射出镜314的光反射，因此SEs被收集到位于样品306侧面的检测器320上。位置308处的收集立体角非常大，优选在该配置中大于π球面度，提供良好信噪比的SE图像。由样品306中的荧光标记物(FMs)发射的光还发射为余弦分布，其中大部分指向镜314，如所显示。由于样品306上的位置308是抛物面镜314的焦点，镜314反射出的光328 —般平行穿至图4Α的右侧。将理解的是，镜314的益处可以 用于其他应用中，在所述应用中，光指向样品或者由带电粒子束系统中的样品检测。将从镜314受益的这些系统包括收集对于光学显微镜的光(与带电粒子束同轴)的系统，例如描述于授予Rasmussen的美国专利号6，373，070 “用于带有聚焦离子束的同轴光学显微镜的方法设备”中的系统和收集来自由带电粒子束或发光引起的光致发光的光的系统。图4B是图4A中检测器光学器件的剖面等轴视图，其也利用SMION产生。此外，分束器326显示于右侧较低处。可以看到SE 332的椭圆形模式碰撞检测器320，因此检测器320的面积不需要过大，较小的检测器面积可使检测器带宽增加(至少对于固态检测器)，且因而一般是优选的。第二个实施方案-位于样品下方的检测器光学器件图5是本发明的第二个实施方案500的示意图，其包含位于样品506下方的检测器光学器件。带电粒子柱502例如电子束柱或者聚焦离子束柱产生带电粒子束504，其通过柱502聚焦于样品506表面上的位置508处。束504通常包含能量在大约50keV至300keV的电子。配置可以包含磁性线圈、静电多极或者磁性线圈和静电多极二者组合的X-Y束偏转器510，以使束504在样品506的表面上来回移动，通常以X-Y光栅模式进行成像。在本发明的第二个实施方案500中，假设样品506足够薄，以允许束504穿透样品506，因此收集样品表面下方的所有成像信号(光和带电粒子)，如所显示。抛物面镜580位于样品506的下面。镜580中的孔582使得所传送的带电粒子束584在穿过样品506后向下行进。束584可通常包含来自初级束504的未散射粒子、弹性散射粒子、非弹性散射粒子、二次电子和/或离子，以及样品506中经弹性和非弹性散射的粒子。穿过孔582后，束584进入检测器586，所述检测器586可包含能量过滤器，以区分上面提到的多种类型的所传送粒子，以及可能地平行运行的多个检测器。为了达到最大的光收集效率，配置镜580，以对向位置508处最大可能的立体角(通常> π球面度)。因此，位置508处由荧光标记物(FMs)发射的最大可能的光量将被收集并传送通过分束器596，接着通过滤色器598，最终到达光检测器590，这使得光学信号中可达到的信噪比最大化。FMs通过来自激光器522的光594被激发，其向上发射，首先反射出分束器596，接着被抛物面镜580反射并聚焦，在位置508处穿过样品506。需要注意的是，最大可能地将光传送通过分束器596是理想的，以增加到达检测器590的光量，此处应用与上面图3中相同的传送百分比考虑。重要的是，使孔582的大小保持在最小，以减少光反射损耗，同时保持足够大以能够容纳束584中弹性散射的电子。抛物面580的焦点大约位于样品506上的位置508处，因此从位置508附近发射的光将聚焦入大致平行的光束587中，其指向图右侧。系统控制器562通过电缆570与柱502、通过电缆568与X-Y偏转器510、通过电缆566与样品506、通过电缆574与激光器522、通过电缆564与检测器590以及通过电缆588与检测器586电连接。系统控制器562利用在监视器(未显示)上显现图像通过X-Y偏转器510调节束504的扫描，以及进行下面描述的图像处理运算，以确定样品表面上FMs的位置。通常带电粒子束必须在真空中行进，因此真空壳534包含柱502的 出口、X_Y偏转器510、样品506、镜580和检测器586，如所显示。视口 556使得来自激光器522的光587 (反射出分束器596)穿入壳534，而使位置508处由FMs发射的光能够穿出壳534，通过分束器596，接着通过滤色器598并进入检测器590。如同图3中的第一个实施方案，滤色器598用于使能够穿入检测器590的激光激发光594的量减少。此处对分束器596应用与对图3中的分束器326相同的反射性考虑。电穿通器554使得电缆566、568和570穿入和穿出壳534，而穿通器552使得电缆588穿入和穿出壳534。第三个实施方案-位于样品上方和下方的检测器光学器件图6是本发明第三个实施方案600的不意图，其包含位于样品606上方和下方的检测器光学器件。带电粒子柱602例如电子束柱或者聚焦离子束柱产生带电粒子束604，其通过柱602聚焦于样品606表面上的位置608处。配置可包含磁性线圈、静电多极或者磁性线圈和静电多极二者组合的X-Y束偏转器610，以使束604在样品606的表面上来回移动，通常以X-Y光栅模式进行成像。在本发明的该第三个实施方案600中，假设样品606足够薄，以允许束604穿透样品606。为了达到较高的光收集效率，使两个抛物面镜614和680分别位于样品606的上方和下方。镜614中的孔612使得束604穿过样品606。镜680中的孔682使得所传送的带电粒子束684在穿过样品606后向下穿行。束684可通常包含来自初级束604的未散射粒子、弹性散射粒子、非弹性散射粒子、二次电子和/或尚子，以及样品606中经弹性和非弹性散射的粒子。穿过孔682后，束684进入检测器686，所述检测器686可以包含能量过滤器，以区分上面提到的多种类型的所传送粒子，以及可能地平行运行的多个检测器。对将由于初级束604的碰撞而从位置608发射的SEs 632收集入检测器620的考虑与图3、4Α和4Β中相同。为了达到最大的光收集效率，配置镜614和680 二者，以对向位置608处最大可能的立体角(对于镜614和680中每个镜，通常> 球面度，总共>2 球面度)。位置608处由荧光标记物(FMs)发射的最大可能量的向上发射光将被收集并传送通过分束器626，接着通过滤色器672，并进入检测器660，这使得光学信号中可达到的信噪比最大化。类似地，位置608处来自FMs的最大可能量的向下发射光将被收集并传送通过滤色器698，接着到达检测器690。FMs通过来自激光器622的光624被激发，其向上发射，首先反射出分束器626，接着被抛物面镜614反射并聚焦在位置608处样品606上。需要注意的是，最大可能地将光传送通过分束器626是理想的，以增加到达检测器660的光量，此处应用与上面图3和5中相同的传送百分比考虑。重要的是，使孔612和682的大小保持在最小，以减少光反射损耗。抛物面614和680的焦点大约位于样品606上的位置608处，因此从位置608附近发射的光将分别聚焦入大致平行的光束628和687中，其指向图的右侧。系统控制器662通过电缆670与柱602、通过电缆668与X-Y偏转器610、通过电缆666与镜614、通过电缆664与检测器660和690、通过电缆676与屏蔽板616、通过电缆678与样品606、通过电缆688与检测器686、以及通过电缆674与激光器622电连接。显示检测器690和660通过电缆699互相连接，但是可选的配置将具有单独的电缆到达系统控制器662。系统控制器662利用在监视器(未显示)上显现图像通过X-Y偏转器610调节束604的扫描，以及进行下面描述的图像处理运算，以确定样品表面上FMs的位置。通常带电粒子束必须在真空中行进，因此真空壳634包含柱602的出口、X_Y偏转器610、镜614、屏蔽板616、样品506、镜680和检测器686,如所显不。使光学仪器尽可能地 位于真空外面容易得多，因此视口 656使得来自激光器622的光624 (反射出分束器626)穿入壳634，而使位置608处来自FMs的向上发射的光能够穿出壳634，通过分束器626，接着通过滤色器672并进入检测器660。位置608处来自FMs的向下发射的光通过视口 656穿出壳634，通过滤色器698，接着进入检测器690。如同图3和5中的第一个实施方案，滤色器672和698分别用于使能够穿入检测器660和690的激光激发光624的量减少。电穿通器654使得电缆666、668和670穿入和穿出壳334，而穿通器652使得电缆676、678、688和680穿入和穿出壳634。需要注意的是，在该双抛物面镜配置中，来自激光器622的光(穿过样品606但未被吸收)将反射出镜680，至检测器690，因此必须配置滤色器698，以抵抗高于图3和5中的情况的潜在高水平的激光照射。扫描场中较少量荧光标记物的成像图7是在对含有100个GFPs的扫描场进行光栅扫描的过程中信号704(每个像素所收集的光子数量)作为时间702函数的图700。扫描总时间是60s，其分布于512 X 512 (256k)像素中，像素滞留时间是229 μ S。曲线706表示对于被照射区域内所有未被破坏的GFPs，每个像素所收集的光子数量。在最左端，假设所有100个GFPs响应于激光激发而发射光。随着曲线706向右下方降落，被破坏的GFPs的数量从O逐渐增加至100，最终在60s光栅扫描结束时所有GFPs均被破坏。由于GFPs是随机定位的，从Os至60s，曲线706具有一些不规则但遵循总体降落。3mW的激光功率分布于样品处28 μ m2区域中，在该示例中，假设光栅具有该相同面积，因此在扫描结束时，无GFPs保持未被破坏。一般来讲，被照射区域可以大于光栅，因此在60s的扫描结束时一些GFPs会保持未被破坏。图8是显示图7中图表700初始阶段的特写图800，其显示总共100个GFPs中前8个GPFs的破坏。在被激光照射区域内对GFPs进行定位的最难点在初始阶段，此时发射的GFPs数量最大(并且已被破坏的GFPs数量最小)。这是因为发射光的未被破坏的GFPs数量最大时，从所有GFPs收集的全部光中的统计波动将最大(以像素滞留时间中收集的光子数量的平方根来计算)。利用表I中列出的假设条件制备图表700和800。曲线806表示从被照射区域中所有未被破坏的GFPs收集的光子平均数量，其作为扫描时间的函数，仅显示了前8秒，在此期间8个GFPs被带电粒子束(电子或者离子)攻击并破坏。这些破坏事件中的每个事件由信号的垂直下降表示，例如左上方的下降812。曲线806的上方是+3 σ曲线808 (长断线)，其表示高于平均信号水平806 3倍标准差的预期信号波动，这是相对不可能的事件。类似地，曲线806下方是-3 σ曲线810 (短断线)，其表示低于平均信号水平806 3倍标准差的预期信号波动，这也是相对不可能的事件。此处需要注意的关键之处是在突变(jump) 812处，其表示一个GFP的损失(由于破坏)，突变812左侧的曲线810正好位于突变812右侧的曲线808的上方，也就是说，极其不可能的是，在激光聚焦区域内仅有100个GFPs被照射(和从而发射)的情况下，从所有未被破坏的GFPs收集的光子数量所产生的内在统计信噪比使得难以检测单个GFP破坏事件。表I.用于图7和8中图表700和800的假设条件
成像总时间60.00s
图像尺寸512#像素/侧
总#像素262144
像素时间228.9us
基质处的激光功率O. 0030W = J/s
波长550.00
能量/光子Γ25eV = (J)
入射光子 /s8. 306E+15Tl
被照射区域的直径6700
被照射区域的面积28.27
GFP的直径Γ00iim
GFP 的面积 Γ07iml
入射光子 /s/GFP2.077E+09Tl
量子效率估测值 Γδ
收集效率估测值0Γ25
所收集的光子 /s/GFP2. 596E+08/s/GFP
所收集的光子/像素/GFP59410.21
#光子/像素/GFP中的统计波动243. 74
被照射区域中的GFP数量100
权利要求
1.一种带电粒子系统，其包括 带电粒子光柱，其用于将带电粒子束引导至含有荧光标记物的样品上； 二次电子检测器，其用于收集带电粒子束撞击后由样品发射的二次电子； 光源，其用于激发样品中的荧光标记物； 光检测器，其用于检测由样品中的荧光标记物发射的荧光；和 电传导镜，配置所述镜以 将来自光源的光引导至包含带电粒子束与样品的碰撞点的样品区； 使由突光标记物发射的突光向光检测器反射；和 提供电场以使来自样品的二次电子偏转进入二次电子检测器。
2.权利要求I的系统，其中所述镜是抛物面镜，其用于使光聚焦到样品区域上和用于收集来自样品区域的光，其中焦点接近于带电粒子束的碰撞点。
3.权利要求I的系统，其进一步包括位于镜和光检测器之间的分束器，配置所述分束器以 将由镜反射的荧光传送进入光检测器；和 使来自光源的光向镜反射。
4.权利要求3的系统，其进一步包括位于分束器和光检测器之间的滤色器，其中调整所述滤色器的透射比，以大大阻断来自光源的光的传送，而使由标记物发射的荧光穿过。
5.权利要求I的系统，其中关于由样品发射的光和二次电子的立体收集角均大于π/2球面度。
6.权利要求I的系统，其中所述荧光标记物包括由与目标基因连接的基因所表达的荧光标记物或者包括选择性地附着于特定细胞内组分的无机突光标记物。
7.权利要求I的系统，其中所述光检测器包括多个检测器，配置所述多个检测器中的每个检测器以收集来自特定类型的荧光标记物的荧光。
8.权利要求I的系统，其中所述光检测器和镜位于样品上方，其进一步包括 位于样品下方的透射式电子检测器； 用于由样品中的标记物发射的荧光的第二光检测器；和 位于样品和透射式电子检测器之间的第二镜，所述第二镜具有接近于带电粒子束与样品的碰撞点定位的焦点，配置所述第二镜以使由标记物发射的荧光向第二光检测器反射。
9.一种带电粒子系统，其包括 带电粒子束源，其用于产生带电粒子； 带电粒子束光柱，其用于使来自带电粒子束源的带电粒子束聚焦于含有荧光标记物的样品上； 使样品保持于样品位点中的样品台，穿过样品位点的样品平面使空间分成包含带电粒子束源的样品平面上方的区域和样品平面下方的区域； 二次电子检测器，其用于收集由于带电粒子束与样品碰撞而由样品发射的二次电子，所述二次电子检测器位于样品平面的上方； 光源，其用于对样品中的荧光标记物进行照射，来自所述光源的光最初从样品上方照射样品； 光检测器，其用于检测由样品中的标记物发射的荧光；和位于样品平面上方的镜，配置所述镜以将来自光源的光引导至样品表面上，以使荧光标记物发突光，并且用于在光不完全穿过样品的情况下使由突光标记物发射的光偏转到光检测器上。
10.权利要求9的带电粒子束系统，其中所述镜包括电传导性抛物面镜。
11.权利要求10的带电粒子束系统，其中所述镜具有光的焦点，所述焦点的位置接近于带电粒子束与样品的碰撞点。
12.权利要求11的带电粒子束系统，其中配置所述镜以 使来自光源的光聚焦于样品上；和 使由突光标记物发射的突光向光检测器反射。
13.权利要求10的带电粒子束系统，其进一步包括具有孔的电极，带电粒子束穿过所述孔，并且配置所述电极以在电极和可配置以使来自样品的二次电子偏转进入二次电子检测器的电传导性抛物面镜之间提供电场。
14.权利要求13的带电粒子束系统，其中所述电极经偏置为大约样品的电势。
15.一种用于在带电粒子束系统中收集来自样品的带电粒子和光的装置，其包括 镜，其具有缺口以使带电粒子束穿过，配置所述镜以将来自样品的光反射至光检测器； 带电粒子检测器，其用于检测来自样品的粒子；和 导体，其经电偏置以在镜和样品之间提供电场，所述电场阻止来自样品的带电粒子碰撞镜并且将来自样品的带电粒子向带电粒子检测器偏转。
16.权利要求15的装置，其中所述带电粒子检测器位于带电粒子束离开镜的水平下方的平面中。
17.权利要求15的装置，其中所述镜的传导部分包括用于在镜和样品之间提供电场的导体。
18.权利要求16的装置，其中所述传导部分包括金属反射层。
19.一种用于对样品中的荧光标记物进行定位的方法，其包括步骤 用光照射样品，以激发荧光标记物，其中照射样品的光通过电传导性第一镜聚焦于样品上; 将带电粒子束以一种模式引导至样品表面上，其中带电粒子在小于由光照射的区域的区域中碰撞样品； 检测由荧光标记物发射的光，其中通过第一镜使来自样品的光向检测器反射，所述第一镜中具有开口以使带电粒子束穿过； 使带电粒子束以一种模式移动横穿样品表面，其中至少一些荧光标记物在被带电粒子束碰撞时减弱其荧光； 使由带电粒子束在样品上碰撞而产生的来自样品的带电粒子远离第一镜并向检测器偏转； 当检测到来自样品中的荧光标记物的全部光发射的减少时根据带电粒子束模式内的已知位点进行测定，以确定荧光标记物的位置。
20.权利要求19的方法，其进一步包括显示来源于带电粒子束的图像，所述图像包含荧光标记物的位置，其叠加于带电粒子束图像上。
21.权利要求19的方法，其中所述荧光标记物包括遗传表达的标记物。
22.权利要求21的方法，其中所述遗传表达的标记物包括绿色荧光蛋白。
23.权利要求19的方法，其中所述荧光标记物包括无机荧光标记物，其经功能化以能够选择性地附着于特定细胞内组分。
24.权利要求19的方法，其中所述带电粒子束包括电子束或者聚焦离子束。
25.权利要求19的方法,其中检测由突光标记物发射的光包括分开检测来自样品内多种类型的荧光标记物的光。
26.权利要求19的方法，其中所述带电粒子检测器位于与镜相同的样品一侧并且位于镜水平下方。
27.权利要求19的方法，其中使来自样品的带电粒子远离第一镜并向检测器偏转包括在镜上提供电偏置。
28.权利要求19的方法,其中通过位于与第一镜相对的样品侧的第二镜收集由样品发射的光。
29.权利要求20的方法，其中对所储存图像数据的处理包括下列步骤 使图像数据与平滑函数结合，以产生经平滑处理的图像数据； 使经平滑处理的图像数据与导函数结合，以产生导数图像数据； 确定导数图像数据中局部最小值的位置； 将最小值数值与预先确定的最大阈值数值相比较；和 如果局部最小值低于阈值数值，在图像上对应于带电粒子束位点的图像位点处显示指示符。
30.一种用于所储存图像数据的图像处理方法，其包括 将带电粒子束以一种模式引导横穿样品区域； 对由于带电粒子束的碰撞由样品发射的带电粒子进行检测，以形成带电粒子成像信号; 利用带电粒子成像信号形成带电粒子束图像； 对由所述样品区域发射的光进行检测，其中检测到的光信号的振幅随时间形成图像曲线. 利用平滑函数对图像曲线进行卷积，以产生经平滑处理的图像数据； 使经平滑处理的图像数据与导函数结合，以产生导数图像数据； 确定对应于导数图像数据中局部最小值的数值和对应于导数图像数据中局部最小值的带电粒子束的位置；和 将最小值数值与预先确定的最大阈值数值相比较；和 如果个体局部最小值数值低于阈值数值，在带电粒子束图像上显示指示符。
全文摘要
公开了一种用于对生物样品内的荧光标记物例如荧光蛋白或者量子点进行成像和定位的方法和系统。利用重组遗传技术使“报告”基因插入很多物种中是被广泛认可的。特别是绿色荧光蛋白(GFPs)和范围从蓝色至黄色的其经遗传修饰的变体易于剪接到很多基因组中的目标基因(GoIs)位点处，其中GFPs被表达，对于由GoIs编码的目标蛋白质(PoIs)的功能没有明显影响。生物学家的一个目标是细胞内PoIs的更精确定位。本发明是利用带电粒子束诱导的对GFPs的破坏使PoI定位更加快速和精确的方法和系统。提出了系统的多个实施方案以实施本方法，以及相对不受高统计噪声水平影响的图像处理方法。
文档编号G01N21/64GK102645423SQ201210056858
公开日2012年8月22日 申请日期2012年1月29日 优先权日2011年1月30日
发明者M·W·乌特劳特, N·W·帕克 申请人:Fei公司