专利名称：疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测用试剂盒，具体涉及一种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备。
背景技术：
痕疾(Malaria)是由热带、亚热带的一种蚊盯咬传播痕原虫而引起的，不同的痕原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。本病主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。疟疾于夏秋季发病较多，在热带及亚热带地区一年四季都可以发病，并且容易流行。在亚洲和非洲地区疟疾仍然是威胁和危害人们健康最为严重的寄生虫疾病之一。目前，全球仍有I. 2亿疟疾患者，带虫者约3亿， 非洲每年还有百万儿童死于疟疾。富组蛋白(HRP-II)是恶性疟原虫消化血红蛋白后形成的代谢产物，由血液期无性体和早期配子体合成，含有大量组氨酸，具有种特异性，由于是水溶性抗原其可在疟疾患者的血浆、尿、全血中检测到，是诊断恶性虐的理想靶位；疟原虫乳酸脱氢酶(PLDH)是疟原虫体内代谢酶，红内期疟原虫无性期和配子体期均有表达，其物理生化、免疫学特性、酶催化作用等与人体红细胞和其他许多微生物的乳酸脱氢酶差异性大，可以作为免疫诊断的靶抗原。目前诊断疟疾的金标准仍是传统的血膜染色镜检法，且作为疟疾确诊最重要的标准。该法是用普通手动移片和对焦的生物显微镜，镜检人员常因眼睛疲劳而导致读片准确性降低、工作效率低。以纳米胶体金为标记物的免疫层析技术发展很成熟，但现有的疟疾检测试剂盒采用的单克隆抗体只能检测一种抗原，或者是将几种抗体简单结合于检测区，增加了生产的复杂度。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种含双特异性单克隆抗体的疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，实现疟疾(Malaria)的灵敏、特异、快速的检测。本发明首先提供了一种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。较佳的，所述胶体金标记的HRPII-pLDH双特异性单克隆抗体中，胶体金为粒径 39-42nm的球形颗粒。本发明的另一方面，提供了这种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤I)用两步还原法制备平均粒径为39_42nm的胶体金；
2)采用步骤I制得的胶体金标记HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体获得免疫胶体金;3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；4)在硝酸纤维素膜的检测线喷点抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体的混合液，在质控线上喷点羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。步骤I)所述两步还原法制备平均粒径为39_42nm的胶体金具体包括下列步骤a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为O. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为I : (8-9)，超声振荡2-3 分钟后冷却至室温，既制得14 16nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比I : (I. 9-2. O)加入4. 0-4. 5 °C的O. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0-4. 50C的抗坏血酸与PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮) 的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为(25-26) 1，加入的 PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为I : (2. 0-2. I)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液。两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为O. 01-0. 02mol/L。步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/S。步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为 O. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 O. 137-0. 139g/L。步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。步骤2)所述HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体是以疟原虫富组氨酸蛋白 II(HRP-II)和乳酸脱氢酶(P⑶H)重组蛋白为免疫抗原，利用杂交瘤技术制得HRP II-pLDH 双特异性单克隆抗体。进一步的，所述HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体是由下列途径获得以疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脱氢酶(P⑶H)重组蛋白为免疫抗原获得免疫动物脾细胞后，利用杂交瘤技术先筛选获得分泌抗HRP-II单抗的阳性杂交瘤细胞株，而后将分泌抗 HRP-II单抗的阳性杂交瘤细胞株再与血清pGDH高滴度的所述免疫动物脾细胞融合后筛选获得同时分泌抗HRP-II和P⑶H抗体的杂交-杂交瘤细胞株，将所述同时分泌抗HRP-II和 PGDH抗体的杂交-杂交瘤细胞株规模化培养后经分离纯化制得。
较优的，所述HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体的制备过程如下以疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脱氢酶(P⑶H)重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠。取免疫BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞株SP2/0，用50%聚乙二醇融合， HAT培养基选择培养出杂交瘤细胞。以纯化的HRP-II为抗原，间接ELISA法初筛分泌抗 HRP-II抗体的杂交瘤细胞，有限稀释法克隆化培养获得稳定分泌抗HRP-II单抗的阳性杂交瘤细胞株。阳性杂交瘤细胞株在与血清PGDH高滴度的免疫BALB/c小鼠脾细胞用50%聚乙二醇(PEG)融合，HAT培养基选择培养出杂交瘤细胞，分别用纯化的HRP-II，pGDH为抗原， 间接ELISA法筛选同时分泌抗HRP-II和pGDH抗体的杂交-杂交瘤细胞，有限稀释法克隆化培养获得稳定分泌抗HRP-II和pGDH双特异性单克隆抗体阳性的杂交-杂交瘤细胞株， 规模化培养后经分离纯化制得HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体。步骤2)所述胶体金标记HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体可采用常规方法标记。具体的，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤I.用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，获得OD54tl值为I. O 2. O的免疫胶体金溶液；II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸， 干燥，制得免疫胶体金纸片。较佳的，步骤I所述喷金缓冲液的组分为8 12v% I. OM Tris液、O. 2 O. 4w/ 乂％聚乙二醇20000、0· 15 O. 25界八％牛血清白蛋白，O. I O. 3w/v%脱脂牛奶、O. 25 O. 35w/v%酪蛋白，和O. 02 O. 08w/v%叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5 ±O. 05，余量为水。最优的，步骤I中喷金缓冲液配方为10v% I. OM Tris液、O. 3w/v %聚乙二醇 20000、0· 2w/v%牛血清白蛋白，0. 2w/v%脱脂牛奶、O. 3w/v%酪蛋白，和O. 05w/v%叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5±O. 05，余量为水。较佳的，步骤II所述预处理液的组分包括0. 5 O. 8v% Tween-20,12 18w/ v%鹿糖,溶剂为水。最优的，步骤II中预处理液配方为0.7% Tween-20,16w/v%鹿糖,余量为水。较佳的，步骤II中，用预处理液浸泡玻璃纤维纸时，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸26 Imm X 220mm ;用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸时，每26 Imm X 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。步骤4)中，抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体的重量比为 O. 8-1. 2:1。最佳为 1:1。本发明中，Wt %为重量百分比，V %指体积百分比；w/v%指重量体积百分比，Iw/ v%即为IOOml溶液中含lg。所述抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体，可市购或采用常规方法分别以HRP II和pLDH为免疫原，采用杂交瘤技术制得。本发明的试剂盒除试剂条外，还可包括其他例如放置试剂条的盒盖、盒座，加样用缓冲液等等。本发明的疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的工作原理，即是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术，通过竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的疟原虫抗原。
使用时，在加样区滴加1-2滴(约50-80 μ I)全血或血清，再滴加2_3滴缓冲液 (可以为生理盐水、磷酸缓冲液或硼酸缓冲液)，在滴加样品后20分钟后判读结果。如果血液中含有疟原虫HRP II和/或pLDH，其将与固定在玻璃纤维素膜上的HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体胶体金复合物结合形成HRP II和/或pLDH抗原-HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体-胶体金复合物，通过毛细作用层析至硝酸纤维素膜，与硝酸纤维素膜上检测线上的HRP II或pLDH单克隆抗体以及质控线上的抗抗体结合，捕获到胶体金颗粒而呈现两条红色色带，为阳性结果。如果尿样中没有疟原虫HRP II和pLDH抗原，则玻璃纤维素膜上的HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体_胶体金复合物仅与质控线上的羊抗鼠IgG结合，质控线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，为阴性结果。阴性在结果观察窗口内出现一条色带。即质控线(C线)位置出现一条红色线条。表样品中无痕原虫抗原存在。阳性在结果观察窗口内出现两条色带。即检测区(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条，表示样品中有疟原虫抗原存在。无效质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。 C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。本发明的有益效果(I)本发明的试剂盒，将HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体包被于免疫胶体金纸片上，特异性强，即能同时检测两种抗原，又没有增加生产操作的复杂度。(2)本发明在制备胶体金检测试剂盒时，采用了两步还原法制备胶体金分子，使得到的胶体金分子呈大小均一的约40nm球形颗粒，比之已公开的技术，虽然增加了一个操作步骤，但由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定，这保证了标记步骤的可控性、降低了试剂盒的批间差异。(3)免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方的预处理液对玻璃纤维膜进行预处理并选配合适的喷金缓冲液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。(4)本发明制备的检测试剂盒具有灵敏度高；特异性强；操作简单便省时，十分适合现场使用。
图I :胶体金透射电镜2 :疟原虫抗体胶体金检测试剂盒试剂条示意图I :滤样纸2 :免疫胶体金纸3 :免疫硝酸纤维素膜4 :吸水纸5 :检测线(T线)6 :质控线(C线)
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的保护范围。实施例I试剂盒的制备
I.材料I. IBalb/c小鼠30只,6-8周龄,公司自己饲养；I. 2试剂来源羊抗鼠IgG多克隆抗体、HRP-11-pLDH重组蛋白购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)，抗HRP-II单克隆抗体和抗pLDH单克隆抗体(可参考现有文献报道制备，如郝文波，李明等。抗恶性疟原虫重组HRP-II单克隆抗体的制备与鉴定[J]。中国寄生虫病防治杂志，2000，13(3) :165-168 ;汪俊云，包意芳，杨玥涛， 汤林华，恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备。中国寄生虫学与寄生虫病杂志， 2005，4 等)硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸购自德国赛多利斯公司(SART0RIUS)2 方法2. I胶体金的制备用柠檬酸钠-抗坏血酸两步还原法制备粒径40nm的胶体金a)第一次还原氯金酸溶液将6ml O. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml O. 016mol/L柠檬酸三钠水溶液。 25KHZ超声振荡2分钟后冷却至室温，既制得约15nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液取第一步制得的胶体金原核溶液26ml，并放置于4°C 水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4. (TC的O. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4. (TC的含O. 018mol/L的抗坏血酸与O. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应I小时，溶液呈透明的酒红色，既制得40nm粒径的胶体金溶液。制得的胶体金采用紫外分光光度计扫描有单一吸收峰，峰形窄，Xmax约为 525nm，采用透射电镜观察，如图I所示，粒径范围约为40nm，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。2. 2双特异性单克隆抗体的制备2. 2. ISDS-PAGE凝胶电泳法鉴定HRP-II-HpaA重组蛋白2. 2. 2动物免疫与小鼠血清效价测定(I)动物免疫 免疫6-8周龄雌性SPF级Balb/c小鼠10只，将HRP_II-p⑶H抗原用生理盐水配成 200ug/ml，与福氏完全佐剂等比例充分乳化混匀后，取Iml混悬液于腹部皮下注射免疫，每只小鼠注射Iml/次(分别含抗原IOOug和200ug)，各免疫5只，作为基础免疫(取免疫前的 Balb/c小鼠尾血作阴性对照)；共进行3次基础免疫，时间隔为两周；后两次基础免疫以同于剂量加福氏不完全佐剂进行注射；加强免疫在融合前三天进行，用纯化抗原100-150ug/ 只腹腔注射。(2)间接ELISA法测定小鼠血清效价2. 2. 3融合前准备融合前两周复苏骨髓瘤细胞(SP2/0)于完全培养液，37°C、5% C02及饱和湿度条件下培养，待细胞生长稳定后，以终浓度为20ug/ml 8-氮杂鸟嘌呤完全培养两周，筛选次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型细胞，进行扩增培养。取Balb/c小鼠,麻醉后拔除眼球放血处死,用75%酒精浸泡5min,消毒小鼠体表。 用注射器抽取5ml无血清培养液注入腹腔2-3min，用吸管吸取巨噬细胞悬液，将腹腔巨噬细胞接种于96孔培养板，每孔O. Iml含2*105细胞。
2. 2. 4制备脾细胞悬液I，于加强免疫后的3-4天，用间接ELISA法测定小鼠血清产生抗体的效价，选择高效价者免疫小鼠，麻醉后摘除眼球放血，分离血清用于阳性对照；拉颈处死小鼠，用75%酒精浸泡3-5min，摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，脾脏移入盛有5ml无血清培养液的培养皿中。2. 2. 5细胞融合a.取小鼠脾细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞数为1*108;骨髓瘤细胞(SP2/0) 悬液进行计数，调整细胞数为1*107。b.将调整细胞数后的小鼠脾细胞悬液和骨髓瘤细胞在离心管中混匀成糊状，离心去上清，缓慢加入50% PEG溶液，完成细胞融合。c.接种于含有饲养细胞的96孔培养板，每孔lOOul。放入37°C、5% C02孵箱培养。2. 2. 6间接ELISA法筛选阳性克隆以HRP II为抗原间接ELISA法初筛克隆化培养后第14天，细胞集落长至1/4孔大，用ELISA法检测有无HRP II抗体分泌。重复检测I次，将阳性且为单克隆的孔进行第二次克隆化培养，方法同第一次克隆化培养。在联系进行多次克隆化培养，直至100%的克隆化分泌特异性抗体为止。扩大培养特异性抗体。2. 2. 7. HRP II杂交瘤细胞与小鼠脾细胞的融合取抗pGDH血清滴度最高的小鼠，分离小鼠脾细胞，并进行计数，调整细胞数为 1*108 ;收集对数生长期的上述杂交瘤细胞，并进行计数，调整细胞数1*107。用Iml 50% PEG 溶液，进行细胞融合，离心弃上清重悬浮于40ml HAT培养液中。接种于含有饲养细胞的96 孔培养板上，每孔lOOul。放入37°C、5% C02孵箱培养。分别用纯化的HRP-II，p⑶H为抗原，间接ELISA法筛选同时分泌抗HRP-II和pGDH抗体的杂交-杂交瘤细胞，有限稀释法克隆化培养获得稳定分泌抗HRP-II和pGDH双特异性单克隆抗体阳性的杂交-杂交瘤细胞株。2. 2. 8抗HRP II和p⑶H双特异性单克隆抗体的大量制备和特性鉴定(I)制备小鼠腹水和双特异性单克隆抗体的纯化①腹水制备a.扩大培养阳性杂交-杂交瘤细胞按IO5个细胞/ml从96孔培养板、24孔培养板、6孔培养板、IOml培养瓶，逐步扩大培养。b.收集杂交-杂交瘤细胞IOOOg离心lOmin，收集杂交-杂交瘤，并用无血清培养液洗涤1-2次，尽量洗去杂蛋白，计数然后配成浓度为106/ml的细胞悬液。c.用IO6个细胞/只小鼠，无菌条件下腹腔内大量繁殖。10-15天后小鼠腹部胀大，腹腔内出现腹水,此时即可收集腹水,离心取上清。②饱和硫酸铵盐析法初步纯化抗体用50 %饱和硫酸铵和33 %饱和硫酸铵分级提取。③免疫吸附层析法纯化获得双特异性单克隆抗体。2. 3制备抗HRP II和p⑶H双特异性单克隆抗体_胶体金复合物2. 3. I将抗HRP II和P⑶H双特异性单克隆抗体用0. IM PH7. 2的磷酸盐缓冲液稀释成I. 2mg/ml的双特异性单克隆抗体溶液。2. 3. 2免疫胶体金溶液的配制向配置好的IOOOml的胶体金溶液中加入1/10倍胶体金体积的O. IM PH7. 2的磷酸盐缓冲液混匀。在搅拌下，再缓缓将I. 2mg/ml的双特异性克隆抗体溶液20ml加入其中(24 μ g单克隆抗体包被Iml胶体金)。室温反应10分钟并不时缓缓搅拌。2. 3. 3反应结束后，在上述反应液中加入1/50倍反应液总体积的5% BSA，使反应液中BSA的终浓度为O. I %。室温反应10分钟并不时缓缓搅拌。2. 3. 4用PH7. 2,0. OlM磷酸盐-O. 01 % BSA缓冲液在位清洗胶体金洗涤浓缩系统，
将系统清洗干净。2. 3. 5将反应结束后的免疫胶体金泵入胶体金洗涤浓缩系统中，洗涤纯化。纯化结束后，继续浓缩免疫胶体金复合物溶液至体积小于80ml，补充PH7. 2,0. OlM磷酸盐-O. 01% BSA缓冲液至最终体积80ml。2. 4免疫胶体金纸制备分别采用方法1、2、3制备。方法I 2. 4. I预处理液的制备准确称取7ml Tween-20,160g鹿糖，加纯化水定容至 IOOOml02. 4. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入100ml I. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脱脂牛奶，3. Og 酪蛋白溶液和O. 5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。2. 4. 3用喷金缓冲液稀释步骤3制备的免疫胶体金，至溶液OD540值为I. 2，获得免疫胶体金溶液。2. 4. 4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 26 Imm X 220mm,浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。方法2:2. 4. I预处理液的制备准确称取5ml Tween-20,180g鹿糖，加纯化水定容至 IOOOml02.4. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入120ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取2. Og聚乙二醇20000、I. 5g牛血清白蛋白，3. Og脱脂牛奶，2. 5g 酪蛋白溶液和O. 8g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。2. 4. 3用喷金缓冲液稀释步骤3)的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为I. 2，获得免疫胶体金溶液。2. 4. 4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 26 Imm X 220mm,浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。方法3:2. 4. I预处理液的制备准确称取8ml Tween-20,120g鹿糖，加纯化水定容至 IOOOml0
2. 4. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入80ml I. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取4. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，I. Og脱脂牛奶，3. 5g 酪蛋白溶液和O. 2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。2. 4. 3用喷金缓冲液稀释步骤3)的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为I. 2，获得免疫胶体金溶液。2. 4. 4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 26ImmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。2.5制备免疫硝酸纤维素膜2. 5. IC线溶液的配制:2.5. I. I根据需配制的C线溶液的量量取羊抗鼠IgG原液，将其用0.01M，PH7.2磷酸缓冲液稀释成2. 5mg/ml的羊抗鼠IgG抗体溶液。2. 5. I. 2在配制好的羊抗鼠IgG溶液中，加入1/150倍于其体积的上述O. 05M EDTA 溶液，使EDTA的终浓度为O. 33mM。2. 5. 2T线溶液的配制2. 5. 2. I配制批量为5ml，抗HRP-II单克隆抗体和抗pLDH单克隆抗体蛋白的终浓度均分别为2. Omg/ml。抗HRP-II单克隆抗体和抗pLDH单克隆抗体的重量比为I : I。2. 5. 2. 2在配制好的T线溶液中加入1/150倍于其体积的上述O. 05M EDTA溶液， 使EDTA的终浓度为O. 33mM。2. 5. 3.在硝酸纤维素膜的相应位置喷点C、T线。2. 5. 4将滤样纸、免疫胶体金纸、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸按图2所示依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为3 5mm的试剂条制得检测试剂条；2. 5. 5将检测试剂条进一步装入设有加样孔和观察窗的盒体，并装入塑料盒制得检测试剂盒。实施例2疟原虫抗体胶体金胶体金检测试剂盒的灵敏度实验检测方法I、取实施例I制得的疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。2、用加样吸管吸取样品，然后滴2滴(约50-80 μ I)样品到试剂盒的加样孔中，再滴加2滴生理盐水。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。3、观察结果在滴加样品后20分钟判读结果。检测样品配置HRP-II浓度为10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml的质控参考品作为样品。配置pLDH浓度为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml的质控参考品作为样品。检测结果
权利要求
1.一种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的 HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗HRP II特异性单克隆抗体和抗PLDH特异性单克隆抗体、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
2.如权利要求I所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的 HRPII-pLDH双特异性单克隆抗体中，胶体金为粒径39_42nm的球形颗粒。
3.如权利要求I或2所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；2)采用步骤I制得的胶体金标记HRPII-pLDH双特异性单克隆抗体获得免疫胶体金；3)采用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；4)在硝酸纤维素膜的检测线喷点抗HRPII特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体的混合液，在质控线上喷点羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。
4.如权利要求3所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤I) 所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为O. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为I : (8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与 HAuCIjK溶液体积比 I (I. 9-2. O)加入 4. 0-4. 5°C 的 O. 003-0. 004mol/L HAuCl4 水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0-4. 5°C的抗坏血酸与PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为(25-26) 1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为I : (2.0-2. I)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
5.如权利要求3所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤2) 所述HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体是以疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)和乳酸脱氢酶(P⑶H)重组蛋白为免疫抗原，利用杂交瘤技术制得的HRP II-pLDH双特异性单克隆抗体。
6.如权利要求3所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤3) 免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤I.用喷金缓冲液稀释步骤2)的免疫胶体金，获得OD54tl值为I.O 2. O的免疫胶体金溶液；II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，干燥， 制得免疫胶体金纸片。
7.如权利要求6所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤I所述喷金缓冲液的组分为8 12v% I. OM Tris液、02 O. 4￥八％聚乙二醇20000、0· 15 O.25界八％牛血清白蛋白，O. I O. 3w/v%脱脂牛奶、O. 25 O. 35w/v%酪蛋白，和O. 02 O.08w/v%叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 45-8. 55,余量为水。
8.如权利要求6或7所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤 II所述预处理液的组分包括0. 5 O. 8v% Tween-20,12 18w/v%鹿糖,溶剂为水。
9.如权利要求3所述疟原虫抗体胶体金检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤4) 中，抗HRP II特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体的重量比为O. 8-1. 2 I。
全文摘要
本发明涉及一种疟原虫抗体胶体金检测试剂盒及其制备。本发明的疟原虫抗体胶体金检测试剂包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的HRPⅡ-pLDH双特异性单克隆抗体，硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗HRPⅡ特异性单克隆抗体和抗pLDH特异性单克隆抗体、质控区(C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。本发明的疟原虫抗体胶体金检测试剂盒可实现疟疾(Malaria)的灵敏、特异、快速检测。
文档编号G01N33/558GK102590522SQ20121005842
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月7日 优先权日2012年3月7日
发明者张国华 申请人:上海凯创生物技术有限公司