专利名称：鉴别经典prrs和hprrs的胶体金快速诊断试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，属于ー种新的快速、特异诊断方法，主要用于临床猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病、PRRS)与高致病性猪蓝耳病(HPRRS)的鉴别诊断及流行病学调查；应用于畜牧兽医学领域。
背景技术：
猪蓝耳病即猪繁通与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS),是由猪繁通与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的ー种传染病。本病于1987年首先爆发于美国，随后迅速传到世界各地，现已成为危害规模化养猪生产的重要疫病之一。而2001年至今，我国毎年都有部分地区不同程度的受到猪“高热病”的危害，经ー系列的研究表明，引起“高热病”的最主要病原为变异的高致病性的PRRSV。PRRSV属套式病毒目，动脉炎病毒科,动脉炎病毒属,单股正链有囊膜的RNA病毒,病毒粒子呈球形或卵圆形，直径为45 65nm,含有2(T35nm的核衣壳,呈二十面体对称,外绕ー脂质双层膜，表面有纤突，较小且不清楚。在我国分离的毒株属于北美洲型，如VR2332株。经测序表明，与经典毒株相比，病原的序列变化主要是在Nsp2区缺失了 30个氨基酸，并且致死率明显高于经典毒。可见，Nsp2中30个氨基酸的缺失与否，成为鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。目前猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测主要采用的技术方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFA)、病毒分离、RT-PCR、荧光RT-PCR、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、血清中和(SVN)试验等。比较快速准确的技术是ELISA和荧光RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测成本昂贵，不便于实时和快速鉴别诊断经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病。这些限制了猪蓝耳病的预防控制，因此研制出ー种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的ー种新型的免疫标记技木。胶体金是由氯金酸(HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸櫞酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用形成ー种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团牢固結合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的ー些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，基于二者的差异，利用免疫学抗原抗体能够特异性结合原理，胶体金标记经典PRRS特有抗原后与待检样品中相应抗体结合，这种抗原抗体复合物被检测线上的SPA (葡萄球菌蛋白A)截留而出现颜色反应，肉眼可见，则可判断是经典猪蓝耳病；其方法具有简单、快速、敏感和特异性好等特点；并且价格低廉，适用于基层或临床鉴别诊断经典猪蓝耳病及高致病性猪蓝耳病。
本发明的技术方案是这样实现的ー种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在干试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的经典PRRSV特有抗原；硝酸纤维素膜上分别包被有SPA构成的检测线T线和抗经典PRRS单克隆抗体2B9构成的质控线C线。所述的结合垫上包被的胶体金标记PRRS特有抗原，其制备方法如下(I)将公司合成好的PRRS Nsp2区30个氨基酸即经典PRRS特有抗原，用该抗原标记胶体金，制备金标抗原，用O. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按IOOug抗体/毫升胶体金加入经典PRRS特有抗原，磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置I小吋。4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4 °C备用。(2)将结合垫浸泡于封闭液即2%BSA、0. 5%吐温一 20、2· 5%蔗糖、O. 05%叠氮钠、
O.OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗原均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。所述的硝酸纤维素膜上包被有SPA构成的检测线T线，其中SPA有可与任何IgG的Fe段结合的特点。将SPA稀释到50 — lOOug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫端约5mm。所述的抗经典PRRS单克隆抗体2B9构成的质控线C线是用包被缓冲液将抗经典PRRS单克隆抗体2B9稀释到50 — lOOug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm ;两线距离5 — 8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗原结合，以此检验试纸条的有效性。所述试纸条的检测方法是待检样品中抗经典PRRS特有抗体先和胶体金标记的PRRS特有抗原结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有经典PRRS特有抗体，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的捕获SPA，就会形成金标抗原一特有抗体ー捕获SPA复合物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线；没有和PRRS特有抗体结合的金标抗原则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果；若样品中无抗经典PRRS特有抗体，样品中的其他抗体到达检测线时遇到捕获SPA即使会被截留，但由于未形成金标抗原一特有抗体ー捕获SPA复合物，仍不会产生肉眼可见的颜色反应，而未与抗体结合的经典PRRS特有抗原通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀，即判为阴性結果。本发明的积极效果是I、具有生物安全性，其所使用的金标抗原为公司合成的经典PRRSV Nsp2区30个氨基酸，检测线处的捕获物为葡萄球菌蛋白A，质控线处为抗经典PRRS单抗，均为蛋白或多肽，不含PRRSV，因此不存在散毒的危险。2、特异性強，胶体金试纸条金标抗原为特异性较好的抗原，仅与经典PRRS特有抗体发生特异性反应，而与高致病性PRRS的抗体无特异性反应，因此提高了检测的敏感性和特异性。3、生产成本低，质控线的单抗可由相应的杂交瘤细胞系通过注射Balb/c小鼠腹腔，诱生腹水，通过辛酸一硫酸铵纯化而大量获得。4、其可快速检测即10 - 15分钟；不需特殊仪器设备，可用于现场操作；操作筒单，一歩完成，无需专业人员操作；检测成本低；储存方便。
图I本发明试纸条的结构模式图。图2本发明试纸条结果判定示意图。
具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 实施例I免疫原的制备
Nsp2中30个氨基酸的缺失与否，成为鉴别高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病的重要指标。本实验通过公司合成方法合成作为抗原的PRRS Nsp2区30个氨基酸并与BSA载体偶联，制备免疫原。实施例2抗经典PRRS单克隆抗体的制备
I、动物免疫选择6 — 8周龄健康Balb/c小鼠，将弗氏完全佐剂乳化的免疫原，每只小鼠腹腔注射50 μ g左右，14d后以弗氏不完全佐剂乳化免疫原蛋白腹腔注射100 μ g，最后一次加强免疫时，直接腹腔注射100 μ g纯化的免疫原蛋白，融合前3 4d尾静脉注射SOyg纯化的免疫原蛋白。2、细胞融合取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内，以300g离心lOmin，弃去上清,振荡细胞,使两种细胞尽量混合均匀,然后45s内缓慢滴加预热的PEG溶液，再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合，静置后再以1000 r/min离心10 min，弃去上清后加入HAT培养基，使细胞悬浮并混匀，加入适量饲养细胞，于96孔培养板培养，第IOd换液并开始检测筛选。3、阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化阳性克隆的筛选采用间接ELISA，用合成的抗原蛋白包被，并以骨髄瘤细胞上清作为阴性对照进行平行筛选。对所获阳性杂交瘤细胞的培养上清通过连续三次细胞克隆，最终获得ー株杂交瘤细胞株2B9。4、腹水的制备0.5 mL的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，7d后注入IO6个杂交瘤细胞于小鼠腹腔，7 10 d后，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将收集好的腹水置370C 24h，随后置4°C过夜，第二天将腹水离心，上清56°C灭活30min即可。5、单克隆抗体的纯化用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水，调至pH4. 5，缓慢滴加3. 3%的正辛酸，搅拌30 min,离心取上清，加入1/10体积的10倍PBS，调至pH7. 4，4°C预冷后，用45%饱和硫酸铵沉淀，离心后取沉淀，用PBS稀释后移入透析袋，在50倍体积PBS中透析，透析期间多次换液，透析结束后，紫外分光光度计280 nm測定蛋白浓度并分装冻存。6、抗经典PRRS单克隆抗体的特性鉴定
(I)腹水效价测定间接ELISA方法測定，细胞培养上清与腹水分别从10倍和100倍开始做梯度稀释，同时分别以SP2/0细胞培养上清和腹水做同等稀释度作为阴性对照。通过检测得知2B9单抗的腹水效价为IX 106。
(2)经典PRRS单克隆抗体的Ig亚类鉴定按鼠mAb Ig亚类检测试剂盒的说明书进行。具体方法是将纯化的单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔 οομ L，37°C孵育I h，洗涤后每孔加入1000倍稀释的抗体亚类试剂100 μ L，37°C孵育I h，洗涤3遍。然后加入羊抗鼠IgG酶标ニ杭，37°C孵育I h，洗涤后加入底物显色，确定单克隆抗体的亚类分别为IgG2a。
(3)杂交瘤细胞株染色体的分析采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析,结果显示2B9杂交瘤细胞的染色体数目为101条。(4)经典PRRS单克隆抗体特异性鉴定将所获单克隆抗体分别与猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、猪流感病毒进行间接ELISA试验，检测所得知制备的2B9单克隆抗体与其它病毒抗原均无交叉反应性。实施例3胶体金、金标抗原的制备 I、胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释为O. 01%,加热煮沸，按每IOOml O. 01%氯金酸加入2ml 1%柠檬酸钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温补足水分。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。2、胶体金标记经典PRRS特有抗原的制备
用O. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按IOOug抗体/毫升胶体金加入经典PRRS特有抗原，磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置I小吋。4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4 °C备用。实施例4胶体金试纸条的组装如图I所示 I、样品垫I的制备
将样品垫I浸泡于封闭液(2%BSA、0. 5%吐温一 20、2. 5%蔗糖、O. 05%叠氮钠、O. OlMPBS)中30分钟，37°C烘干，封装。2、结合垫2的制备
将结合垫2浸泡于封闭液(2%BSA、O. 5%吐温一 20、2. 5%蔗糖、O. 05%叠氮钠、O. OIMPBS)中30分钟，37°C烘干。然后将制备好的金标抗原均匀铺在结合垫2上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。3、硝酸纤维膜3的制备
用包被缓冲液将SPA稀释到50 — lOOug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线T线6靠近结合垫2，距结合垫2端约5mm ;用包被缓冲液将抗经典PRRS单克隆抗体2B9稀释到50 一 100ug/ml，调整机器划线为C线，即为质控线C线7靠近吸收垫4，距吸收垫端约3mm。两线距离5 — 8mm，线应细致均匀，37°C烘干，备用。4、试纸条的组装
将硝酸纤维膜3、吸收垫4、结合垫2 (玻璃纤维)、样品垫I、支撑薄片5按图依次黏贴起来，切成3. 6mm宽的小条，即为胶体金试纸条。封存备用。实施例5胶体金试纸条的应用
I、本发明试纸条的使用方法如图2所示；
(I)样品制备临床采集待检猪血清用于检測。
(2)检测取出试纸条，室温平衡20分钟，打开包装取出试纸条，将样品垫浸入待检样品中，取出，平放，静置10 — 15分钟，判定結果。
(3)结果判定当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线C线7，没有出现肉眼可见的紫红色检测线，判为阴性，记为“一”;当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线C线7，同时出现肉眼可见的紫红色检测线T线6，判为阳性，记为“ + ” ;检测线T线6顔色深度与待检抗原量成正比，顔色越深说明待检抗原滴度越高，检测线T线6与质控线C线6顔色一致或接近时判为+ + + +，颜色介于+和+ + + +之间酌情判为++或+ + +。达到+及以上深度时，判为被检样品抗原为阳性。质控线C线7无条带则判为试纸条失效。2、试纸条的敏感性试验
免疫胶体金诊断试纸条敏感性试验结果显示，当经典PRRS阳性血清稀释至I :640吋，仍可见阳性結果。结果见表I。
权利要求
1.一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的经典PRRSV特有抗原；硝酸纤维素膜上分别包被有SPA构成的检测线T线和抗经典PRRS单克隆抗体2B9构成的质控线C线。
2.根据权利要求I所述的一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述的结合垫上包被的胶体金标记PRRS特有抗原，其制备方法如下将公司合成好的的PRRS Nsp2区30个氨基酸即经典PRRS特有抗原，用该抗原标记胶体金，制备金标抗原，用O. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按IOOug抗体/毫升胶体金加入经典PRRS特有抗原，磁力搅拌器混匀30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置I小时；4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4°C备用；将结合垫浸泡于封闭液即2%BSA、0. 5%吐温一 20、2. 5%蔗糖、O. 05%叠氮钠、O. OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗原均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。
3.根据权利要求I所述的一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述的硝酸纤维素膜上包被有SPA构成的检测线T线，其中SPA有可与任何IgG的Fe段结合的特点，将SPA稀释到50 - lOOug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫端约5mm。
4.根据权利要求I所述的一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述的质控线C线是用包被缓冲液将抗经典PRRS单克隆抗体2B9稀释到50 —lOOug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm ;两线距离5 —8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗原结合，以此检验试纸条的有效性。
全文摘要
本发明涉及一种鉴别经典PRRS和HPRRS的胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的经典PRRSV特有抗原；硝酸纤维素膜上分别包被有SPA构成的检测线T线和抗经典PRRS单克隆抗体2B9构成的质控线C线。其具有特异性强、灵敏度高、操作简单和诊断快速的显著优点，可用于鉴别经典猪蓝耳病病毒与高致病性猪蓝耳病病毒，并用于猪蓝耳病病毒的快速诊断。
文档编号G01N33/569GK102621319SQ20121006949
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者丁壮, 刘慧 , 姜翠翠, 朱利塞, 李想, 母连志, 韩明明, 黄志强 申请人:吉林大学