专利名称：一种快速免标记检测硫离子的方法
技术领域：
本发明涉及一种硫离子的检测方法，特别涉及一种快速免标记检测硫离子的方法。
背景技术：
地下水(特别是温泉水)及生活污水，通常含有硫化物，如硫磺泉等。当大量生活污水排入水系或下水道，由于含硫有机物受微生物作用而分解出硫化物，所释出的硫化氢是造成管道维修工人丧命的主要祸魁。某些工业废水如石油炼制、人造纤维、印刷、制革、造气、选矿和造纸等废水中，亦可发现含硫化物。水中的硫化物容易逸散于空气中，产生臭味，且毒性很大。它可与人体细胞色素、 氧化酶以及该类物质中的二硫键作用，影响细胞氧化过程，造成细胞组织缺氧，危及人的生命。水中硫化氢可消耗水中的氧气，并致水生生物死亡。硫化氢除自身能腐蚀金属外，还可以被污水中的微生物氧化成硫酸，进而腐蚀下水道等。因此，硫化物是水体污染的一项重要指标。国标规定硫化物浓度低于I mg/L。水中存在的硫化物，包括溶解性的H2S、HS' S2_，存在于悬浮物中的可溶性硫化物、 酸可溶性金属硫化物，以及未电离的有机，无机类硫化物。当用絮凝和沉淀法把悬浮固体除去之后，剩余的为溶解的硫化物。通常所测定的水中硫化物系指溶解的H2S和S2^以及酸溶性金属硫化物。对硫化物的检测能加强环境污染防治工作，及时排查阴离子污染物及环境隐患， 解决危害群众健康和生态环境的突出问题，对环境和社会的可持续发展做出贡献；有利于督促企业做好职业健康监护工作、开展日常检测评价工作、规范职业病危害告知制度等方面开展职业病防治的监督管理工作，对劳动者接触危害因素造成的职业病损害做到早预防、早发现和早处理，切实防止群体性职业病危害事件的发生；将有利于国家对食品、化妆品及高危行业等企业实施更为科学和有效的监管，对提高产品质量和扩大产品出口范围、 对企业和社会健康发展都具有重要的意义。硫化物的检测方法有较多报道，属于仪器检测方法的，有离子色谱法、间接原子吸收分光光度法、库仑滴定法、离子选择电极法、极谱法、电流滴定法、电位滴定法、冷原子荧光法、离子交换高压液相色谱法、阳极溶出伏安法、流动注射法等。近年来，原子光谱与ICP 技术的联用，提高了检测的灵敏度，拓宽了检测的线性范围，而ICP-MS使检测更加灵敏，数据分析更加方便。但是，此类仪器较为昂贵，在大多数实验室中的推广应用因此受到限制。 除光谱法外，以亚甲蓝小分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，但尚有灵敏度低的不足之处，检测的可靠性和准确性也不足。分子生物学技术的快速发展，为利用生物大分子 (蛋白质、DNA等)的特异性检测各种靶物质提供了有利条件。最近，四川大学的XiaoDan等利用S2_与Pb0/Si02纳米颗粒的特异性作用，设计了一种新型生物传感方法，通过检测S2_与 Pb0/Si02高亲和性的相互作用后产生的荧光变化实现对S2_的特异性检测。该方法具有较高的特异性，可排除实际样品体系中大多数离子的干扰，检测限可以达到1.38X10_7 mol/L。但Pb0/Si02纳米颗粒合成复杂耗时，检测成本仍然较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便可行的硫离子浓度检测方法。本发明所采取的技术方案是
一种快速免标记检测硫离子的方法，包括如下步骤
1)将随机互补双链DNA序列溶解，得到DNA溶液；
2)在DNA溶液中加入还原剂，混合均匀，之后加入二价铜离子，混匀；
3)避光还原反应得到含有铜纳米颗粒的随机DNA双链，该DNA双链为检测用DNA链；
4)将标准浓度的硫离子溶液与检测用DNA链混合，避光反应，测量检测用DNA链的荧光值，得到标准曲线；
5)将待测样本液与检测用DNA链混合，避光反应，检测其荧光值，计算得到硫离子浓度。优选的，还原剂是维生素C或其盐中的至少一种。优选的，随机互补双链DNA序列的长度不小于10 bp。优选的，随机互补双链DNA序列的长度为15 35 bp。优选的，二价铜离子源自硫酸铜、乙酸铜和硝酸铜中的至少一种。本发明的有益效果是
本发明的检测原理是随机双链DNA在340 nm激发光下没有荧光，当加入二价铜离子和抗坏血酸钠的时候,能够在双链DNA上形成突光铜纳米颗粒,340 nm激发光下于585 nm 处会有荧光。当再加入硫离子的时候，随着硫离子浓度的增加，585 nm处的荧光会逐渐降低，并与硫离子的浓度呈很好的线性相关性，从而达到免标记荧光快速检测硫离子的目的。本发明的检测方法，无需对样品进行复杂的前处理，待测样品可以是环境水样，临床样本，或经过离心，过滤等简单处理的样品。检测过程操作简单。本发明的检测方法，特异性好，不易受其他金属离子的影响，检测精度高，灵敏度高，检测限低达200 nM。
图I是本发明检测方法的原理图2和3是本发明检测方法的表征图4是不同阴离子与含纳米铜离子的随机DNA双链反应的荧光值比较图。
具体实施例方式一种快速免标记检测硫离子的方法，包括如下步骤
1)将随机互补双链DNA序列溶解，得到DNA溶液；
2)在DNA溶液中加入还原剂，混合均匀，之后加入二价铜离子，混匀；
3)避光还原反应10分钟后得到含有铜纳米颗粒的随机DNA双链，该DNA双链为检测用DNA链；
4)将标准浓度的硫离子溶液与检测用DNA链混合，避光反应，测量检测用DNA链的荧光值，得到标准曲线；
5)将待测样本液与检测用DNA链混合，避光反应，检测其荧光值，计算得到硫离子浓度。优选的，还原剂是维生素C或其盐中的至少一种。当然，根据本说明书的教导，本领域的技术人员也可以采用其他的还原剂，只要该还原剂可以将二价铜离子还原为铜原子即可。优选的，随机互补双链DNA序列的长度不小于10 bp,更佳的，随机互补双链DNA序列的长度为15 35 bp。只要该段随机序列可以容纳纳米铜颗粒即可。过长的DNA双链合成较为困难，故其序列也不宜过长，避免增加成本。优选的，二价铜离子源自硫酸铜、乙酸铜和硝酸铜中的至少一种。本发明的检测原理如图I所示。实施例I
基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒用于硫离子的免标记检测的步骤如
下
1)用含有150mM乙酸钠，50mM乙酸镁的3-(N-吗啉)丙磺酸钠盐(MOPS)缓冲溶液(10 mM, pH=7. 5)溶解随机互补的双链DNA，随机采用的DNA的序列是5’-TACTCATACGC TCATACGTTCATCACGACTACACA-3’(SEQ ID NO :1)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)， 500 nM的两条随机互补DNA混合均匀，在90°C水浴反应10分钟，再缓慢降至室温，得到500 nM随机互补双链DNA溶液；
2)在500μ L 500 ηΜ的互补双链DNA中加入I mM的抗坏血酸钠，充分混匀，再加入 100 μ M的乙酸铜，充分混匀，室温避光反应约10分钟，即得到基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒；
3)向上一步骤制得的溶液中加入不同浓度的硫离子，室温避光反应5分钟后用荧光分光光度计(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA)) 检测溶液的荧光强度，荧光检测的激发峰是340 nm，发射峰是585 nm。其荧光检测结果如图2和3所示。从图2可以看出，基于随机双链DNA为模板合成的荧光铜纳米颗粒具有很好的荧光特征。其激发峰为340 nm,发射峰为585 nm。其中在585 nm处的发射峰峰值用来后续监测加入不同浓度的硫离子后荧光强度变化情况。从图3可以看出，硫离子的浓度与585 nm处的荧光强度响应具有很好的相关性， 对硫离子检测的线性范围为20 O. 2 μ M ;该方法对硫离子的检测限为200 ηΜ。实施例2
为了考察基于随机双链DNA为模板合成的荧光铜纳米颗粒用于免标记检测硫离子的特异性，按如下步骤进行了选择性实验
I) 用含有150 mM乙酸钠，50 mM乙酸镁的3_(Ν_吗啉)丙磺酸钠盐(MOPS) 缓冲溶液(10 mM, pH=7. 5)溶解随机互补的双链DNA，随机采用的DNA的序列是 5’-ATGAACGTATGAGCG-3’(SEQ ID NO 2)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)。500 ηΜ的两条随机互补DNA混合均匀，在90°C水浴反应10分钟，再缓慢降至室温，得到500 ηΜ 随机互补双链DNA溶液；2)在500μ L浓度为500 ηΜ的互补双链DNA中加入I mM的抗坏血酸钠，充分混匀， 再加入100 μ M的硫酸铜，充分混匀，室温避光反应约10分钟，即得到基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒；
3)向上一步骤所制得的溶液中加入不同的阴离子(硫离子的浓度为O. 3 μΜ； F—，Br-, Γ, IO4-, CIO:，C2H2CF, Ν03_，NO” N3, S032—，S2O82' C032—，HC03_，H2PO4' HPO42' B4O7' EDTA2—，SCN—浓度为50 μ M)，室温避光反应5分钟后用荧光分光光度计 (Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA))检测溶液的突光强度，荧光检测的激发峰是340 nm，发射峰是585 nm。检测结果如图4所示。从图4的检测结果可以看出，50 μΜ的Zn2+，Mg2+，Cd2+， Ni2+, Mn2+, Fe3+, Sn2+, Ca2+, Co2+, Hg2+, Ba2+对检测没有影响,只有当加入硫离子后才会淬灭荧光铜纳米颗粒的荧光，使荧光信号下降。这证明该方法对硫离子的荧光检测具有很好的特异性。实施例3
为了考察基于随机双链DNA为模板合成的荧光铜纳米颗粒用于实际样品中硫离子的免标记检测，按如下步骤进行了回收率实验
1)用含有150 mM乙酸钠，50 mM乙酸镁的3-(Ν-吗啉)丙磺酸钠盐(MOPS) 缓冲溶液(10mM，pH=7. 5)溶解随机互补的双链DNA，随机采用的DNA的序列是 5’ -AGTTGCAAGAAGATGACAGAGAAGT-3’ (SEQ ID NO 3)(由生工生物工程(上海)有限公司合成)。500 ηΜ的两条随机互补DNA混合均匀，在90°C水浴反应10分钟，再缓慢降至室温， 得到500 ηΜ随机互补双链DNA ；
2)在500μ L 500 ηΜ的互补双链DNA中加入I mM的抗坏血酸钠，充分混匀，再加入 100 μ M的硝酸铜，充分混匀，室温避光反应约10分钟，即得到基于随机双链DNA为模板形成的荧光铜纳米颗粒；
3)取3份河水样品用O. 2 μ m的滤膜过滤后添加不同浓度的硫离子(浓度分别为0.5，5，13 PM)，将上述4份实际样品加入到⑵中所制备的荧光铜纳米颗粒溶液中，室温避光反应5分钟后用突光分光光度计(Perkin-Elmer LS-55 Fluorescence Spectrometer (Perkin-Elmer, USA))检测溶液的突光强度。突光检测的激发峰是340 nm, 发射峰是585 nm。从表I的检测结果可以看出，河水实际样品中硫离子检测的回收率为98. 6-114%, 说明本发明所设计的硫离子检测方法能够满足实际样品检测的需要。
权利要求
1.一种快速免标记检测硫离子的方法，包括如下步骤1)将随机互补双链DNA序列溶解，得到DNA溶液；2)在DNA溶液中加入还原剂，混合均匀，之后加入二价铜离子，混匀；3)避光还原反应得到含有铜纳米颗粒的随机DNA双链，该DNA双链为检测用DNA链；4)将标准浓度的硫离子溶液与检测用DNA链混合，避光反应，测量检测用DNA链的荧光值，得到标准曲线；5)将待测样本液与检测用DNA链混合，避光反应，检测其荧光值，计算得到硫离子浓度。
2.根据权利要求I所述的快速免标记检测硫离子的方法，其特征在于还原剂是维生素C或其盐中的至少一种。
3.根据权利要求I所述的快速免标记检测硫离子的方法，其特征在于随机互补双链 DNA序列的长度不小于10 bp。
4.根据权利要求4所述的快速免标记检测硫离子的方法，其特征在于随机互补双链 DNA序列的长度为15 35 bp。
5.根据权利要求I所述的快速免标记检测硫离子的方法，其特征在于二价铜离子源自硫酸铜、乙酸铜和硝酸铜中的至少一种。
全文摘要
本发明公开了一种快速免标记检测硫离子的方法。二价铜离子在有还原剂存在的情况，在随机DNA双链中形成纳米铜颗粒，加入硫离子后会淬灭荧光铜纳米颗粒的荧光，并且硫离子浓度与荧光强度具有很好的相关性，从而达到检测硫离子的目的。该检测方法具有很好的灵敏度，检出限为200nM。该检测方法具有很好的特异性，其他离子对检测不产生影响，可用于实际样品检测，回收率为98.6-114%。本发明设计的对硫离子的检测方法操作简单，使用方便，灵敏度高，选择性高，无需特意的核酸序列和复杂的仪器，为实际样品中硫离子含量的快速检测提供了一种新的检测手段。
文档编号G01N21/64GK102608091SQ20121007799
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者刘杰, 曾令文, 陈俊华 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院