专利名称：胶乳增强免疫比浊法测定人甲胎蛋白含量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液(包括血清和羊水)中甲胎蛋白含量的试剂盒，属于医学免疫体外诊断领域。
背景技术：
甲胎蛋白(a-fetoprotein,或AFP),分子量为68kD,是一条多肽链糖蛋白，由590个氨基酸组成，含糖量4%。甲胎蛋白的基因位于常染色体的4qll q22区域，基因约有20kb长，含15个外显子，14个内含子，与血清白蛋白、维生素D结合蛋白为同一家族，与白蛋白有50%的氨基酸相同，等电点4. 7 4. 8，电泳时位于白蛋白与α -球蛋白之间。在胎儿发育过程中，肝脏是合成甲胎蛋白的主要场所，其次是卵黄囊，来自内胚层的胃肠道粘膜也可以合成少量的甲胎蛋白。人体胚胎的第6周开始合成，12 14周合成达到高峰，血清的浓度为I 3mg/mL，以后逐渐降低，出生时血清浓度约为19 100 μ g/mL，一年后,血清浓度降至正常水平,约为5. 8ng/mL。正常人血清中甲胎蛋白含量极少，低于20ng/ml。但在原发性肝癌、肝炎、肝硬化及卵黄囊肿瘤等患者中，甲胎蛋白会有不同程度的升高，有的甚至升高上千倍以上；孕期母体的血清或羊水中甲胎蛋白也高于正常人，因受胎儿血中高浓度甲胎蛋白波动影响，不同孕期甲胎蛋白浓度有规律的变化。甲胎蛋白作为一种肿瘤标志物，其含量变化与多种疾病有关，包括肝细胞癌、卵黄囊肿瘤、非内胚层胃肠道癌、生殖细胞癌等。甲胎蛋白在临床诊断上主要用于以下三方面I.肝细胞癌早期诊断，高危人群的筛查、分期及预后的诊断、疗效检测；2.卵黄囊肿瘤早期诊断，且与治疗效果相关，其上升与下降可反映内胚窦瘤的生长状况、病情进展与缓解；3.产科检查筛查神经管缺陷、非整倍体的实验室标志物。甲胎蛋白的检测方法较多，传统的包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、时间分辨荧光(TRFIA)、化学发光(CLIA)免疫分析方法等。其中，化学发光方法的灵敏度和线性都较高，检测范围可以达到I 1000ng/mL，但试剂成本相对较高且配套的大型仪器比较昂贵。酶联免疫法应用较普遍，但该方法为非均相免疫检测系统，其优点在于通过使用过量的固定化抗体和标记抗体，实现高灵敏度和较高水平的精确性；缺点在于测定过程中需要进行洗涤分离步骤，耗时长，缺少单位测试运行时间；自动化程度不高，批间差和重复性相对较大；针对不同的步骤需要配备多种专门的设备，一定程度上增加了产品的成本。近年来 ，由于不断增长的检测数量，临床上迫切需要一种更为简便、快速的方法取代传统的检测方法。胶乳增强免疫比浊法检测甲胎蛋白是基于均相免疫分析测定系统的一种方法，在普通的生化分析仪上即可完成反应全程，可实现快速、高高通量样本的检测。由于甲胎蛋白在正常人体内含量相对较低，利用胶乳增强免疫比浊均相免疫分析测定时，一般采用较高的样本量来弥补此法灵敏度低的缺陷；但灵敏度得以提高的同时又将面临高的样本量引入的干扰物质，如类风湿因子、补体等，造成的非特异性反应。为克服高样本引入的非特异性反应，现在市售的胶乳比浊法检测甲胎蛋白试剂盒通常采取用多克隆抗体IgG酶切得到的F(ab) ’ 2包被胶乳颗粒，在一定程度上降低了非特异性反应。但F(ab)’ 2需要由IgG经酶切纯化后方可使用，酶切制备工艺中会损失一部分抗体且对抗体活性也有一定程度影响，更重要的是试剂制备过程进一步复杂对控制试剂批间差设置了不可逾越的障碍。试剂批间差的主要影响因素由原来单纯的交联工艺控制，扩大到酶切纯化抗体工艺控制。该法不仅推高了试剂成本，批间差较大，并且开瓶后稳定性较差，从而限制了此类试剂在临床上的推广。IgY类抗体是一类来源禽类，如鸡、鸭、鹅等体内产生的主要抗体形式。研究证实，来源于禽类的抗体(IgY)与哺乳动物产生的抗体(主要为IgG)相差较大。IgY不能激活人体补体系统，不与类风湿因子或Fe受体相结合，能有效避免在免疫检测过程中产生假性结果，保证了试剂的较高特异性。同时，在遗传上与人类进化关系差别较大的禽类产生的抗体具有比哺乳动物多克隆抗体更高亲和性，此类抗体效价高用量相对降低，试剂成本方面也 有一定优势。综上，若将IgY抗体应用于胶乳增强免疫比浊法，代替F(ab) ’2来检测人体甲胎蛋白的含量，不仅保证了试剂的特异性也简化了生产工艺，便于控制试剂批间差，还可以有效降低成本，临床推广具有显著的优势。随着蛋白分离纯化技术手段不断发展，IgY的分离纯化技术也趋于完善。但目前将其应用到临床检测试剂盒的并不多见，经分析可能原因主要有以下几点抗体方面，国内抗体发展比较缓慢目前尚处于初级阶段，常规商业化抗体多依赖进口，IgY的生产商基本上没有；国外，主要以欧美为主，抗体技术已经很成熟，可以大量供应高质量抗体，但IgY目前市场份额较少，供应的厂家较少且供应量有限，售价较高多应用于科研，不适于作为试剂制造的生产原料；目前，市售甲胎蛋白检测试剂盒主方法较多，以化学发光法、酶联免疫、放射免疫为主，胶乳增强法应用于甲胎蛋白检测发展较慢市场份额有限，与市场投入不够有关。因此，目前仍需要能有效降低成本且可应用于临床检测的试剂盒。本发明使用的IgY抗体为亲和纯化自制而得，纯度和效价均满足胶乳法原料的要求，成本优势突出。因此，本发明胶乳增强免疫比浊法检测甲胎蛋白试剂盒突出优点在于特异性较高的鸡抗人甲胎蛋白多克隆抗体的使用能有效的降低试剂成本，同时又能具备灵敏度高、均一稳定使用简便，批间差易于控制适合产业化等特点，具有良好的市场应用前景。
发明内容
本发明提供一种胶乳增强免疫比浊法测定人体体液(包括血清和羊水)中甲胎蛋白含量的试剂盒，所述甲胎蛋白试剂盒包括(I)甲胎蛋白Rl试剂；(2)甲胎蛋白R2试剂；
(3)甲胎蛋白校准品。为实现上述目的，本发明的技术方案包括(I)甲胎蛋白Rl试剂，是一种为试剂盒提供适当反应环境、使抗原保持天然构象、并控制反应达到终点的时间和速率的试剂，包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液。(2)甲胎蛋白R2试剂，是一种含有抗人甲胎蛋白的多克隆抗体包被胶乳颗粒的均一的乳白色液体，包含抗人甲胎蛋白多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性齐U、防腐剂及缓冲液。(3)甲胎蛋白校准品，用来与样本比较进行结果计算，包含防腐齐U、电解质、稳定齐U、甲胎蛋白抗原及缓冲液。在本发明的一实施方案中，胶乳免疫比浊法测定人体体液(包括血清和羊水)中甲胎蛋白含量的试剂盒包括甲胎蛋白Rl试剂、甲胎蛋白R2试剂和甲胎蛋白校准品，其中所述甲胎蛋白Rl试剂包含物质占其质量百分比为0. 1% 5.0%电解质、2% 6%促凝剂、O. I % I %稳定剂、O. I % 1.0%表面活性剂、O. 05% O. 1%防腐剂及口117 9、缓冲液浓度范围为10 lOOmmol/L的缓冲液。所述甲胎蛋白R2试剂包含抗人甲胎蛋白的多克隆抗体包被胶乳颗粒，胶乳颗粒直径范围为100 300nm，浓度为O. 5 5mg/mL。此外，还包含占其质量百分比为0. 1% 5.0%电解质、O. 5% 5%稳定剂、O. I % I. O %表面活性剂、O. 05 % O. I %防腐剂及PH7 9、缓冲液浓度范围为10 lOOmmol/L的缓冲液。所述甲胎蛋白校准品包含占其质量百分比为0.01% 1.0%防腐剂、0. I % 5. 0%电解质、0. 05% 5. 0%稳定剂、O 250ng/mL甲胎蛋白抗原及溶解在预处理的人血清基质中、pH 6. 5 8. O、浓度为10 100mmol/L的缓冲物质。本发明所用的多克隆抗体，可选自鸡、鸭、鹅等禽类产生的IgY类抗体。此类抗体与哺乳动物产生的抗体(主要为IgG类)有较大差异，与哺乳动物的IgG类抗体相比，IgY具有以下优势能有效的避免人体体液样本中补体、类风湿因子或Fe受体的干扰，保证试剂较高的特异性；同时，在遗传上与人类进化关系差别较大的禽类能够产生具有比哺乳动物多克隆抗体更高的亲和性的抗体，此类抗体效价高用量相对降低，试剂成本方面也有一定优势。本发明所用IgY类抗体，优选鸡IgY抗体，可自制或购买。本发明的一实施方案中，所述鸡抗人甲胎蛋白多克隆抗体，是通过使用人甲胎蛋白抗原亲和纯化而获得。制备抗体的方法包括用纯化抗原免疫一定数量的母鸡，收集并从其卵黄中分离IgY组分，再用自制的亲和纯化分离柱纯化特异的抗人甲胎蛋白的IgY抗体。本发明所用的胶乳颗粒，直径范围为100 300nm，浓度为0. 5 5mg/mL。本发明所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳，其表面修饰有功能团，功能团可以是羧基、氨基、羟基、酰肼、氯甲基的一种。在本发明的一实施方案中，所用胶乳颗粒优选表面修饰羧基，直径在150 250nm,优选 200nm。本发明所用的包被抗体到胶乳颗粒表面的方法为化学交联法，该方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的，所用的化学交联剂选自炭化亚胺(EDAC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、酰肼、异氰酸酯或其组合；交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，MES、M0PS0、M0PS、HEPES、磷酸盐缓冲液，pH在6. O 8. O之间。本发明所述电解质选自无机盐类，氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁或其组合。优选氯化钠，浓度在0. 1% 5.0%之间。本发明所述稳定剂选自牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白(Fish skingelatin)、葡萄糖、果糖、甘露糖、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)或其组合。、
本发明所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠，优选PEG-6000，浓度在2 % 6 %之间。本发明所用的表面活性剂选自吐温系列、脂肪醇聚乙二醇醚类、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列或其组合，优选吐温20。本发明所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、ProClin系列、三嗪类有机化合物等，优选叠氮钠。
本发明所述甲胎蛋白校准品，包含含量在O 250ng/ml之间的甲胎蛋白，其中所述甲胎蛋白校准品I为不含甲胎蛋白的预处理人血清；甲胎蛋白校准品2、3、4为添加不同甲胎蛋白含量的预处理人血清。本发明所述甲胎蛋白校准品，其中所添加的甲胎蛋白选自自人体体液提取、纯化而得的天然甲胎蛋白，或自肝癌细胞株培养、纯化而得的甲胎蛋白，其纯度>95%。本发明试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测甲胎蛋白，其原理是利用化学交联法将特异的鸡抗人甲胎蛋白多克隆抗体包被到胶乳颗粒表面，当被测样本中有甲胎蛋白抗原时发生抗原抗体免疫反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，形成的复合物可与邻近的胶乳颗粒连接，最终交织成网状引起反应体系浊度的显著变化，保持反应体系中抗体过量时，此时反应后体系浊度的变化与甲胎蛋白的量成正比关系，根据甲胎蛋白校准曲线即可进行定量分析。在本发明中，人体体液样品中的甲胎蛋白与胶乳颗粒包被的鸡抗人甲胎蛋白多克隆抗体发生抗原抗体反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物，导致浊度上升，测定此浊度在570nm波长处的吸光度，对照校准曲线即可求出样本中甲胎蛋白的含量。相较于现有技术，本发明用化学交联法将特异性的鸡抗人甲胎蛋白IgY抗体包被到羧基修饰过的胶乳颗粒表面，并通过添加特殊的稳定剂和表面活性剂使胶乳颗粒形成均一稳定的悬浮液，实现均相免疫反应系统，使用简便快速，适应临床快速高通量筛查的要求；特异的IgY使用，是保证试剂盒特异性的根本，有效避免了临床样本中常见的补体、类风湿因子或Fe受体的干扰；较高的样本量，弥补胶乳增强免疫比浊法灵敏度低的不足，从而使得本发明试剂盒实现特异性强、灵敏度高、均一稳定使用简便的特点，批间差易于控制适合产业化，便于临床推广。
图I为本发明所制备试剂盒的灵敏度。图2为本发明所制备试剂盒的线性图。图3为本发明所制备试剂盒与化学发光方法试剂盒检测临床样本比对的相关性比较。
具体实施例方式实施例I :亲和纯化法制备鸡抗人甲胎蛋白多克隆抗体(IgY抗体)鸡抗人甲胎蛋白多克隆IgY抗体的制备每个免疫实验中使用8 10只母鸡，在免疫开始前，每只鸡收集一对卵。从这些卵中纯化的IgY作为对照IgY。将O. Img高度纯化的人甲胎蛋白抗原(来自Fitzgerald)溶解在pH 7. 8的磷酸盐缓冲液中，用弗氏完全佐剂乳化，并且注射到母鸡的胸肌中，每4周重复注射。在注射起始后10周，收集卵。将蛋黄从卵中分离，并且通过氯化铵沉淀，初步分离来自蛋黄的IgY组分。鸡抗人甲胎蛋白多克隆IgY抗体的纯化首先，制备亲和纯化所用的分离柱将IOmg高度纯化的人甲胎蛋白抗原固定在HITRAP NHS-活性 HP 柱(来自 Amersham Pharmacia Biotech)上；其次，上样及洗脱将初步分离的IgY组分在磷酸盐缓冲液中稀释至2mg/mL，将200mL的IgY抗体稀释液流过柱子，然后用50mL的磷酸盐缓冲液冲洗柱子；再用35mLPH3. 2的O. IM柠檬酸缓冲液洗脱对甲胎蛋白具有特异性亲和力的抗体；
然后，透析纯化将上述洗脱的特异性抗甲胎蛋白抗体用磷酸盐缓冲液透析，并且使用具有30，000道尔顿的截留分子量的Amicon Centircon离心过滤装置浓缩至3mg/mL,即为亲和纯化的鸡抗人甲胎蛋白多克隆IgY抗体。实施例2 :制备甲胎蛋白R2试剂过程分三步抗体交联、胶乳清洗、胶乳悬浮抗体交联将O. 5mg上述制备的IgY抗体用5mL O. IM磷酸盐缓冲液(pH7. 8)稀释后，加入表面修饰羧基、直径200nm的聚苯乙烯胶乳溶液(来自Merck)，再加入5mg EDAC,在37°C反应6小时，加入O. 5mL O. IM的甘氨酸缓冲液(pH8. 5)搅拌Ih终止反应。胶乳清洗离心去掉上清以清除多余的抗体、交联剂及交联反应的副产物等,底部沉淀即为包被好的胶乳。用20mL的50mM的甘氨酸-NaOH缓冲液洗涤3次。胶乳悬浮将20mL同样的甘氨酸-NaOH缓冲液加入到上述沉淀，超声波处理4min，混匀得均一的乳白色胶乳悬浮液，即为R2试剂。其中，甘氨酸-NaOH缓冲液中含有O. 9%氯化钠、O. 5%EDTA、0. 8%BSA、0. 1%吐温20、O. I %叠氮钠，保证胶乳颗粒处于均一稳定的悬浮状态。实施例3 :制备甲胎蛋白Rl试剂在50mM pH7. 2的Tris-HCl缓冲液中，添加O. 9 %氯化钠、O. 2 %吐温20、5 %PEG-6000,0. 2% BSA,O. 5% EDTA、0. I %叠氮钠，搅拌均匀调节pH至8. 0，即为Rl试剂。实施例4 :制备甲胎蛋白校准品在pH7. 2、含有50mM Tris-HCl缓冲物的预处理人血清基质中，加入浓度分别为O、25、100、250ng/mL的甲胎蛋白抗原纯品(来自Fitzgerald)，搅拌均匀，作为甲胎蛋白多点校准品。此外，预处理的人血清基质中还包含O. 9%氯化钠、I % BSA、0. 75% EDTA、0. I %叠氮钠。实施例5 甲胎蛋白试剂盒的性能检测I.检测试剂盒的用法以日立7080生化分析仪为例测定波长为570nm，首先加入Rl试剂150 μ L，37度反应30秒；其后加入甲胎蛋白校准品20 μ L，再反应60秒；其后加入R2试剂75 μ L，测定反应第10秒、70秒的吸光度值(Α1、Α2)，计算吸光度差值Λ A = Α2-Α1。每管重复测定2次。将各校准品管2次测得的吸光度差值△ A为纵坐标，对应的浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线。取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，将其代入校准曲线，即可计算出待测样本中的甲胎蛋白的含量。
2.灵敏度检测以生理盐水为空白样本，稀释人血清样本，配制浓度分别为2、4、6、8、10ng/mL的样本，用上述甲胎蛋白R1、甲胎蛋白R2和甲胎蛋白校准品组成的试剂盒，按照I所述的方法测定10次，计算吸光度均值和标准差(SD)，以样本吸光度-2. 6SD大于空白吸光度+2. 6SD的样本浓度作为甲胎蛋白检测试剂盒的灵敏度范围，见图I。如下表I所示，本发明试剂盒的灵敏度能达到2ng/mL。表I.本发明试剂盒灵敏度检测
权利要求
1.一种胶乳增强免疫比浊法测定人甲胎蛋白含量的试剂盒，该试剂盒包括甲胎蛋白Rl试剂、甲胎蛋白R2试剂和甲胎蛋白校准品，其中 所述甲胎蛋白Rl试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液； 所述甲胎蛋白R2试剂包含抗人甲胎蛋白多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液； 所述甲胎蛋白校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、甲胎蛋白抗原及缓冲液。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其中抗人甲胎蛋白多克隆抗体可选自鸡、鸭、鹅等禽类的IgY抗体，优选鸡IgY抗体。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其中抗人甲胎蛋白多克隆抗体通过使用人甲胎蛋白抗原亲和纯化而获得。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其中胶乳颗粒为直径范围100 300nm、浓度为O.5 5mg/mL的聚苯乙烯胶乳颗粒，直径优选150 250nm,更优选200nm。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其中胶乳颗粒表面由功能团修饰，该功能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基，优选羧基。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其中抗体包被胶乳颗粒是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的，所用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼、异氰酸酯或其组合；交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，MES、MOPSO、MOPS、HEPES、磷酸盐缓冲液，pH在6. O 8. O之间。
7.根据权利要求I所述的试剂盒，该试剂盒包括甲胎蛋白Rl试剂、甲胎蛋白R2试剂和甲胎蛋白校准品，其中 所述甲胎蛋白Rl试剂包含占其质量百分比为0. 1% 5.0%电解质、2% 6%促凝剂、O. 1%~ 1%稳定剂、O. 1%~ 1.0%表面活性剂、O. 05% O. 1%防腐剂及pH7 9、浓度范围为10 lOOmmol/L的缓冲液； 所述甲胎蛋白R2试剂包含抗人甲胎蛋白的多克隆抗体包被胶乳颗粒，还包含占其质量百分比为0. I % 5.0%电解质、O. 5% 5%稳定剂、O. I % 1.0%表面活性剂、O.05% O. 1%防腐剂及pH7 9、浓度范围为10 100mmol/L的缓冲液； 所述甲胎蛋白校准品包含占其质量百分比为0. 01% I. O %防腐剂、0. I % 5.0%电解质、0. 05% 5. 0%稳定剂、O 250ng/ml甲胎蛋白抗原及溶解在预处理的人血清基质中、pH 6. 5 8. O、浓度为10 IOOmmoI/L的缓冲液。
8.根据权利要求I或7所述的试剂盒，其中所述电解质选自无机盐类，氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁或其组合，优选氯化钠。
9.根据权利要求I或7所述的试剂盒，其中所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白、葡萄糖、果糖、甘露糖、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠或其组合。
10.根据权利要求I或7所述的试剂盒，其中所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠，优选PEG-6000。
11.根据权利要求I或7所述的试剂盒，其中所述表面活性剂选自吐温系列、脂肪醇聚乙二醇醚类、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列或其组合，优选吐温20。
12.根据权利要求I或7所述的试剂盒，其中所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、ProClin系列、三嗪类有机化合物等，优选叠氮钠。
13.根据权利要求I或7所述的试剂盒，其中所述甲胎蛋白校准品中的甲胎蛋白选自自人体体液中提取、纯化而得的天然甲胎蛋白，或自肝癌细胞株培养、纯化而得的甲胎蛋白，纯度≥95%。
全文摘要
本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定人甲胎蛋白含量的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括甲胎蛋白R1试剂、甲胎蛋白R2试剂和甲胎蛋白校准品，其中甲胎蛋白R1试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；甲胎蛋白R2试剂包含抗人甲胎蛋白的多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；甲胎蛋白校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、甲胎蛋白抗原及缓冲液。本试剂盒特异性强、灵敏度高、均一稳定、快速简便，可用于各种生化分析仪。
文档编号G01N33/68GK102662061SQ20121011324
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者刘希, 徐丽, 高爱民 申请人:北京九强生物技术股份有限公司