专利名称：一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法
技术领域：
一种快速高效检测食品中抗生素环丙沙星的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，主要用于食品中环丙沙星含量的检测。
背景技术：
食品安全检测作为保障食品安全的重要手段，发挥着越来越重要的作用，食品安全检测技术的发展方向呈现两个趋势一是实验室检测向设备日趋完善、痕量分析发展；另一个是向现场检测速测化，仪器便携化方向发展。食品安全检测中备受关注的检测物主要包括微生物及其毒素，重金属以及农兽药残留等项目。研发高通量、快速、灵敏的农兽药检测试剂可谓当务之急。
目前农兽药残留的检测手段主要有理化分析法、微生物法、免疫法。其中免疫学检测是农兽药残留检测的发展方向，它可以做到快速和特异性。酶联免疫吸附方法(ELISA法)已经逐步成为食品中农兽药残留检测的一种重要方法；国家兽药安全评价中心的初步调查，国内使用ELISA试剂盒作为兽药残留筛选的检测样本数量远远超过微生物方法和理化分析方法。免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性，以及测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。虽然农兽药残留分析的方法虽然有很多，但是利用免疫学技术进行分析是特异性最好、检测时间最短的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效快速检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，主要用于食品检测行业中环丙沙星含量的检测。本发明的技术方案是该检测环丙沙星的试剂盒是由96微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，酶标记的环丙沙星抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用I %明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用O. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有O. 07% O. 1%吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。所述的环丙沙星酶标抗原，是用EDC法以辣根过氧化物酶(HRP)与CPLX合成酶标抗原(CPLX-HRP)，并利用紫外分光光度计进行鉴定。所述的环丙沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为O. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶,环丙沙星浓度分别为0ug/L, lug/L,2. 5ug/L, 10ug/L, 200ug/L。所述的抗环丙沙星包被抗体为多克隆抗体，它们均是用环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的环丙沙星半抗原是将环丙沙星和EDC法作用得到的；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。一种用所述的试剂盒检测环丙沙星的方法，它是取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗 涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(0D值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。本发明优选的检测环丙沙星的方法是取包被有抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤I次，加入IOOul环丙沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50ul酶标环丙沙星抗原，震荡混匀，37°C孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37°C孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(0D值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。本发明所述的样品处理是根据猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这些样品选择优化的前处理方法，包括样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈10ml，充分振荡混匀5分钟，4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50°C氮气吹干。加Iml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS，振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取I. 5ml左右下层液于离心管中备用。本发明的有益效果该试剂盒结构简单，组成成分少、使用方便、廉价、灵敏度高，其中前处理时间为O. 5小时以内；检测时间为O. 5小时。酶联免疫检测试剂盒的全面评估而本方法可以用O. 5小时结束试验。其中前处理时间为O. 5小时。优于质谱等方法的处理时间。酶联免疫检测试剂盒的结果6. I. I标准曲线绘制:(I)竞争法测不同浓度诺氟沙星标准品溶液(O 1000ug/L)，初步确定线性范围I 200ug/L
权利要求
1.一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于它由带有微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，环丙沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用I %明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用O.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有O. 07% O. 1%吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求I所述的检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星酶标抗原，是用EDC法以辣根过氧化物酶(HRP)与CPLX合成酶标抗原(CPLX-HRP)，并利用紫外分光光度计进行鉴定。
3.根据权利要求I所述的检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的环丙沙星标准品，是从干粉中稀释得到，稀释液为O. 15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，共6瓶，环丙沙星浓度分别为0ug/L, lug/L, 2. 5ug/L, 10ug/L, 200ug/L。
4.根据权利要求I所述的检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的抗环丙沙星包被抗体为多克隆抗体，它们均是用环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；所述的环丙沙星半抗原是将环丙沙星和EDC法作用得到的；所述的载体蛋白为匙孔蓝蛋白。
5.一种用权利要求I所述的试剂盒检测环丙沙星的方法，其特征是取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(OD值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
6.根据权利要求5所述的检测环丙沙星的方法，其特征在于它是取包被有抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，用洗涤液洗涤I次，加入IOOul环丙沙星标准品和处理好的样品到各自的微孔中，同时加入50ul酶标环丙沙星抗原，震荡混匀，37°C孵育10分钟左右，洗涤液洗涤三次，加50ul显色液A和50ul显色液B，37°C孵育15分钟后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值(0D值)，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
7.根据权利要求5或6所述的检测环丙沙星的方法，其特征在于所述的样品处理是根据猪肉、猪肝、虾、鱼、甲鱼、鸡肉、鸡蛋这些样品选择优化的前处理方法，包括样品切碎、研磨后各称取5g样本于50ml离心管中，再加入乙腈IOml,充分振荡混勻5分钟,4500转离心5分钟。取上清液2ml于15ml离心管中50°C氮气吹干。加Iml正己烷，振荡10秒，再加入2mlPBS,振荡2分钟，4500转离心5分钟，去除上层有机相，取I. 5ml左右下层液于离心管中备用。
全文摘要
一种检测环丙沙星的酶联免疫试剂盒及检测方法，所述的试剂盒由带有微孔的包被板，环丙沙星标准品，抗环丙沙星的包被抗体，环丙沙星酶标抗原，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液组成；所述的包被板配置有采用1％明胶作为封闭液，抗体的稀释液选用0.15mol/L的磷酸盐缓冲溶液，所述的浓缩洗涤液为含有0.07％～0.1％吐温的Tris-HCL缓冲溶液，显色液A为柠檬酸和柠檬酸钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯胺和二甲基亚砜、含甘油的溶液，所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液；检测方法是取包被抗环丙沙星-KLH抗体的微孔包被板，加入环丙沙星标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入酶标的环丙沙星抗原，震荡反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，避光放置后加终止液，在450nm-630nm处测量吸光值，对照标准曲线计算样品中的环丙沙星含量。
文档编号G01N33/543GK102707045SQ20121013737
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者孟凡国, 李海龙, 欧文斌, 胡卫江, 蒋哲, 顾兰兰, 马凤花 申请人:嘉兴博泰生物科技发展有限公司, 浙江清华长三角研究院