专利名称：牛奶中土霉素残留elisa检测方法
技术领域：
本发明涉及牛奶药物残留检测技术领域，具体是牛奶中土霉素残留ELISA检测方法。
背景技术：
兽药残留，即“兽药在动物源性食品中的残留”的简称，指的是动物产物中任何可食部分所含兽药的母体化合物及(或)其代谢物，以及与兽药相关的杂质的残留。近几年，我国畜产品开始进入国际市场，但由于药物残留超标而被贸易国家退货、销毁，甚至中断贸易往来，造成了极大的经济损失和影响。动物性食品中抗生素的严重残留是极为普遍的问题，已经对人类健康构成了潜在的危害，从而受到国内外的普遍关注。 土霉素(Oxytetracycline, OTC)是20世纪40年代发现的四环素族成员，别名地霉素、5-羟基四环素、地灵霉素、氧四环素等，为广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌、立克次氏体等均有抑菌作用，主要是通过阻止氨酰tRNA与细菌30S核糖体的末端结合来抑制细菌蛋白质合成。在临床应用上土霉素被广泛用于治疗奶牛乳房炎、子宫内膜炎，并常常被用作饲料药物添加剂，用于防治肠道感染和促进畜禽生长。土霉素具有免疫抑制影响，当长期摄入含有低剂量残留土霉素的牛奶或奶制品，土霉素在人体内不断地蓄积，当其浓度达到一定剂量时，能导致人体各种器官(胃、肠、肝脏)或组织的病变。土霉素易与人体内的钙结合，易在骨骼和牙齿中沉积，导致骨质疏松，牙齿发育不良等，最明显的残留毒性是诱导产生耐药菌株。依据我国食品质量安全的规定，土霉素残留是畜产品的必检项目之一。常见的土霉素残留检测方法主要是微生物检测法、仪器分析检测法和免疫检测法，其中微生物检测法不易筛选到特别专一敏感的菌株，易受到其他抗菌药物的影响。近年来随着高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)以及LC-MS等联用技术的飞速发展，仪器分析检测法很大程度上提高了分析的灵敏度和分辨率，拓宽了药物残留分析范围，但这种技术一般需要昂贵的仪器设备、大量复杂的前处理、较长的分析周期和对技术人员的技术水平有较高要求等，限制了其使用范围，不适合大量样品的快速检测和对药物残留的及时监控。而免疫检测法具有检测成本低，检测时间短，操作程序简便且可以同时检测多个样品，特异性高等特点，酶联免疫吸附测定法正逐渐广泛应用于药物的残留检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，该方法采用酶联免疫吸附检测试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度，操作方法简单，能够批量、快速检测牛奶中土霉素的残留。本发明所提供的牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，通过以下步骤实现
(I)土霉素免疫原和包被抗原的合成、鉴定
采用重氮法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂(Ο-tolidine)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(OTC-tolidine-BSA);再用相同方法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂(Ο-tolidine)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被抗原(OTC-tolidine-OVA);将BSA、OVA、0TC、Ο-tolidine和偶联产物，于波长190 400nm下进行紫外扫描鉴定；同时也对合成免疫原以及载体蛋白BSA做SDS-PAGE电泳实验进行鉴定；
(2)单克隆抗体的制备
取50 100μ g步 骤(I)所得的免疫原与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化，常规免疫方法免疫Balb/C小鼠，取出抗血清效价4000以上的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，具体操作依ClonaCellTM-HY Hybridoma Cloning Kit说明进行45ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化，建立能稳定分泌抗OTC的杂交瘤细胞株，获得抗OTC单克隆抗体；
(3)OTC间接竞争性ELISA检测
1)包被抗原①每孔加100μ L1000X稀释的包被抗原0TC-0VA ；
②37°C孵育2h，后洗涤液洗涤2次，扣干；
2)封闭③每孔加入150 μ L的封闭液；
④37°C孵育2h，后洗涤液洗涤3次，扣干；
3)加样⑤每孔加入50 μ L待测样品，50 μ LI万X稀释的单抗；
⑥37°C孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；
4)酶标二抗⑦每孔加入100μ L5000X稀释的羊抗鼠IgG =HRP酶标二抗；
⑧37°C孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；
5)显色反应⑨每孔加入100μ L底物反应液，37°C避光反应20min ；
6)终止⑩每孔加入50 μ L终止液终止反应，5min后测OD值。
图I为间接竞争ELISA标准曲线图
图2为以牛奶为基质的间接竞争ELISA标准曲线图 与现有传统检测技术相比，其优点和积极效果表现在
Cl)实用性好该检测方法最低检测限量为87. 33ng/mL，达到了国家的检测标准。(2)简便性传统OTC分析检测相对费力、费时、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不能用于现场检测，且对实验室的仪器化程度和人员素质要求较高，不能满足农产品贸易对快速、简便、准确、大量检测的需求。而本发明提供的土霉素ELISA检测方法具有操作简单、快速、分析成本低、分析容量大、安全可靠等优点，一般不需贵重仪器，可大量简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广，特别适用于大批量样本检测和现场监测。(3)准确性高土霉素ELISA检测方法准确度较高，重复性较好(批内和批间的变异系数分别为8. 858%和7. 816%)，抗体特异性识别土霉素，对其抗生素几乎不识别。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不用来限制本发明。实施例I试剂盒操作及结果计算
待测样品经前处理后，用PBST定容备用。用PBS稀释标准OTC浓度分别为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1600ng/mL、3200ng/mL,然后按步骤
(3)建立的间接竞争ELISA程序进行检测。酶标仪读取OD49tl值，以标准品浓度的常用对数(IogCfeiiPp)为横坐标，以A#/Atl为纵坐标，绘制土霉素标准曲线，如图I。C标准帛为标准品的浓度，A0为零标准的OD49tl值，A标为各浓度标准品OD49tl值。根据曲线的回归方程y = -48. 383x + 188. 17 (R2 = O. 9706)，可以求出对应样品的浓度，土霉素最小检测限约为87. 33 ng/mL。实施例2试剂盒特异性实验
将系列稀释的四环素、金霉素、强力霉素、链霉素、青霉素和土霉素标准品按(3)建立的间接竞争ELISA程序进行检测，以各个零标准的OD值为100%，用下式公式计算抗体对这些抗生素的交叉反应性；交叉反应率愈小，则抗体土霉素的特异性愈强，反之则抗体的特异性差。其交叉反应率可用下面公式计算
交叉反应率=IC50 (土霉素)/IC5tl (供试物)XlOO %
从表I中可以看出，所制备的试剂盒的特异性较好，对土霉素具有较好的特异性，其它抗生素交叉反应率大部分均在O. I %以下，仅和其结构类似物四环素和金霉素有交叉反应，主要是因为土霉素和四环素、金霉素同属四环素类药物，它们的分子结构骨架部分相同所引起的。表I单抗与其他抗菌药物的交叉反应
权利要求
1.一种牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)土霉素免疫原和包被抗原的合成、鉴定采用重氮法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂(O-tolidine)与牛血清白蛋白 (BSA)偶联得到免疫原(OTC-tolidine-BSA);再用相同方法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂(O-tolidine)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被抗原(OTC-tolidine-OVA);将BSA、 OVA、OTC、O-tolidine和偶联产物，于波长190 400nm下进行紫外扫描鉴定；同时也对合成免疫原以及载体蛋白BSA做SDS-PAGE电泳实验进行鉴定；(2)单克隆抗体的制备取50 100μ g步骤(I)所得的免疫原与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化，常规免疫方法免疫Balb/C小鼠，取出抗血清效价4000以上的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0 融合，具体操作依ClonaCellTM-HY Hybridoma Cloning Kit说明进行j5ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化，建立能稳定分泌抗OTC的杂交瘤细胞株，获得抗OTC单克隆抗体；(3)OTC间接竞争性ELISA检测1)包被抗原①每孔加100μ L1000X稀释的包被抗原0TC-0VA ；②37°C孵育2h，后洗涤液洗涤2次，扣干；2)封闭③每孔加入150 μ L的封闭液；④37°C孵育2h，后洗涤液洗涤3次，扣干；3)加样⑤每孔加入50 μ L待测样品，50 μ LI万X稀释的单抗；⑥37°C孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；4)酶标二抗⑦每孔加入100μ L5000X稀释的羊抗鼠IgG =HRP酶标二抗；⑧37°C孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；5)显色反应⑨每孔加入100μ L底物反应液，37°C避光反应20min ；6)终止⑩每孔加入50 μ L终止液终止反应，5min后测OD值。
全文摘要
一种牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，该方法采用酶联免疫吸附检测试剂盒，通过土霉素免疫原和包被抗原的合成、鉴定、单克隆抗体的制备、OTC间接竞争性ELISA检测等步骤实现，该方法具有操作简单、快速、分析成本低、分析容量大、安全可靠等优点，一般不需贵重仪器，可大量简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专业技术水平要求不高，容易普及和推广，特别适用于大批量样本检测和现场监测。
文档编号G01N33/04GK102707023SQ201210197199
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者周伟胜, 赵先晟, 雷晓宁, 魏学良 申请人:西南大学