专利名称：免疫测定试剂、生物传感器和检测分析物的方法
技术领域：
本公开内容涉及免疫测定试剂、生物传感器、和测定(assay)分析物的方法，其可使用鱼精蛋白以高度灵敏的方式测定样品中存在的分析物。
背景技术：
生物化学结合测定广泛用于确定生物样品中包含的分析物的存在和浓度。这样的测定基于结合配偶体(binding partners)的原理。所关心的分析物与分析物结合剂(例如对所述分析物的抗体或对所述分析物的受体)结合，且所述分析物和所述分析物结合剂因此称作“结合配偶体”。当所述结合配偶体之一结合至固相时，所述测定称作“非均相测定”。这样的非均相测定包括例如夹层法、间接法和竞争法，所有术语都是本领域容易理解的。测定的灵敏度典型地是指当与在缺乏分析物的情况下得到的信号读取相比时在通过测定产生的信号中产生统计学显著变化的分析物的最小质量。增加的灵敏度是期望的，因为其容许检测更小量的分析物以及分析物的总体更高精度的测量。非特异性结合是指在具有固相的非均相测定体系中结合配偶体的非特异性相互作用。非特异性结合经常降低非均相测定的灵敏度，且因此期望减少这样的非特异性结合。仍需要容许以高度灵敏的方式检测分析物的免疫测定试剂、生物传感器和测定方法。
发明内容
本文中所公开的提供用于分析物的高度灵敏的检测的免疫测定试剂，其中所述免疫测定试剂包括(a)包括所述分析物和纤维蛋白原(血纤蛋白原，fibrinogen)的样品、及
(b)鱼精蛋白。所公开的还提供生物传感器，其包括:(a)基底，对分析物特异性的捕获抗体固定至所述基底；(b)免疫测定试剂，其包括⑴包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及( )鱼精蛋白；和(C)对所述分析物特异性的检测抗体。所公开的进一步提供测定分析物的高度灵敏的方法，包括:制备包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(ii)鱼精蛋白的免疫测定试剂；向所述免疫测定试剂添加检测抗体以提供检测抗体-分析物复合物(complex);将所述检测抗体-分析物复合物与固定在基底上的捕获抗体接触以提供检测抗体-分析物-捕获抗体复合物；和检测所述分析物。所公开的进一步提供用于检测分析物的方法，包括:制备包括(i)包括所述分析物和纤维蛋白原的样品、 及(ii)鱼精蛋白的免疫测定试剂；将所述免疫测定试剂与固定在基底上的捕获抗体接触以提供捕获抗体-分析物复合物；将所述捕获抗体-分析物复合物与检测抗体接触以提供捕获抗体-分析物-检测抗体复合物；和检测所述分析物。
以下参照附图进一步详细地描述示例性实施方式。可理解，为了清楚可已放大所述附图的各方面:图1是金染色(gold staining)测定的示意图；和图2是酶联免疫吸附测定的示意图。
具体实施例方式本文提供的是包括(a)包括所关心的分析物和纤维蛋白原的样品、及(b)鱼精蛋白的免疫测定试剂、以及使用所述试剂检测分析物的方法。不希望受任何特定理论或作用机理束缚，据信在样品例如血液样品中纤维蛋白原的存在降低基于结合配偶体的分析物检测方法的灵敏度和/或特异性(specificity)。进一步据信对于这样的测定的非特异性结合、或其它干扰模式可通过如下减少:在检测前将所述样品与鱼精蛋白组合以提供免疫测定试剂。更具体地，据信改善的性能是由于鱼精蛋白与所述样品中存在的纤维蛋白原的静电相互作用，由此显著改善所述分析物的测定的灵敏度和再现性。根据所公开的一个方面，所述分析物为肌钙蛋白I，且所公开的提供测定肌钙蛋白I的高度灵敏的方法。在本说明书中，术语“肌钙蛋白I(Tnl)”是指与肌钙蛋白T和肌钙蛋白C 一起通常存在于肌肉组织中的蛋白质。肌钙蛋白I调节肌动蛋白和肌球蛋白的钙依赖性相互作用。肌钙蛋白I的的三种同种型已被鉴别:慢缩(Slow-twitch)骨骼肌亚型肌钙蛋白1、快缩(fast-twitch)骨骼肌亚型 肌钙蛋白I和心肌肌钙蛋白I。当与其它肌钙蛋白比较时，心肌肌钙蛋白I在N-末端具有31个额外的氨基酸残基且为心肌中存在的唯一肌钙蛋白亚型。临床研究已证明，心肌肌钙蛋白I (cTnl)是在急性心肌梗塞(AMI)后4_6小时在血流中可检测的且之后保持升高数天(参见Mair等，Clin.Chem., 41 (9):1266-1272(1995);和 Larue 等，Clin.Chem.，39 (6):972_979 (1993))。因此，cTnl 升高覆盖肌酸激酶-MB (CK-MB)和乳酸脱氢酶两者的诊断窗口(diagnostic window)(参见Bodor,J.Clin.1mmunoassay, 17(1):40-44 (1994))。进一步的研究已表明，cTnl 具有比 CK-MB 高的对心肌损伤的临床特异性(参见Adams等,Circulation, 88 (I): 101-106 (1993);和Apple等，Clin.Chim.Acta237:59-66 (1995))。由于其心脏特异性和灵敏度，cTnl已用作在诊断具有不稳定心绞痛和非-ST段抬高急性冠状动脉综合征(ACS)的病人中的可靠标志(marker)。具有ACS的病人的先前临床研究已显示，cTnl值的较小增加提供关于死亡的短期和长期风险的预后(prognostic)信息(参见 Lindahl 等，J.Am.Coll.Cardiol., 38: 1497-1498, (2001) ；Venge 等，Am.J.Cardiol.,89: 1035-1041(2002) ；Galvani 等，Circulation,95 =2053-2059(1997)；Antman 等，1^^叫.]\]\^(1.,335:1342-1349(1996) ；0ttani 等，Am.Heart J., 40:917-927(2000);和 Heidenreich 等，J.Am.Coll.Cardiol.,38:478-485 (2001)) 最终，预后评估在鉴别最可能受益于特定治疗干预的病人中可为有用的。
但是，样品中包含的一些因素例如蛋白质、葡萄糖和离子可在TnI的免疫测定期间阻碍抗原-抗体结合。特别地，纤维蛋白原(其为以约1.5-4.0g/L的量存在于人血浆中的蛋白质)大大地阻碍抗原-抗体反应，特别是Tn1-抗体反应。因此，所公开的提供通过经由将样品与鱼精蛋白组合来除去样品中包含的纤维蛋白原而减少非特异性结合、且由此改善使用所述样品的TnI测定的灵敏度和再现性的方法。根据示例性实施方式，所公开的提供用于TnI的高度灵敏测定的免疫测定试剂。所述免疫测定试剂包括(a)包含TnI和纤维蛋白原的样品、及(b)鱼精蛋白。如所提及的，据信由于鱼精蛋白和样品中存在的纤维蛋白原的静电相互作用而产生鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。因此，免疫测定中的纤维蛋白原和鱼精蛋白可全部或部分地作为复合物存在于所述免疫测定试剂中。如本文中使用的术语“样品”是指宽范围的生物学物质以及由所述生物学物质诱导或提取的组合物。包含分析物的样品可为任何合适的样品，包括但不限于血液样品如血清样品或血浆样品。血浆是其中悬浮血细胞的血液的液体组分。例如，血浆可包含水，血浆蛋白质，月旨质，糖类，无机盐，和非蛋白质的氮化合物如尿素、氨基酸和尿酸。血浆可通过任何合适的方式(例如使用离心)与血液样品中的其它组分(例如血细胞)分离。血浆样品从包含抗凝血剂如肝素钠、柠檬酸钠、氟化钠和草酸钾或乙二胺四乙酸(EDTA)钾的血液管(采血管，blood tube)得到。在一个示例性实施方式中，使用血衆样品。 如本文中使用的术语“分析物”是指待测量的物质或化学成分。在一个示例性实施方式中，分析物为肌钙蛋白如肌钙蛋白I。在优选的实施方式中，分析物为心肌肌钙蛋白1。如本文中使用的术语“纤维蛋白原”是指存在于脊椎动物血浆和淋巴中且在血液凝固中起关键作用的因子。纤维蛋白原为具有约340，000道尔顿(340KDa)分子量的糖蛋白。在血浆中，纤维蛋白原典型地具有约1.5-4.0g/L的浓度。纤维蛋白原为包含经由二硫键彼此连接的两组三个不同链(α (Α)、β (V)、Y)的六聚物。这三个链的N-末端部分包含参与链的交联的半胱氨酸。C-末端部分包含约225个氨基酸残基的域(domain)，其可用作分子识别单元。如本文中使用的术语“鱼精蛋白”是指具有多个正离子的蛋白质，其具有+20的平均电荷量且由式I表示:式I
权利要求
1.关于分析物的高度灵敏的检测的免疫测定试剂，包括(a)包含所述分析物和纤维蛋白原的样品、及(b)鱼精蛋白，其中所述纤维蛋白原和鱼精蛋白可为鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物的部分。
2.权利要求1的试剂，其中所述分析物为肌钙蛋白I。
3.权利要求1的试剂,其中所述样品为血浆。
4.权利要求1的试剂，其中以约2纳克/毫升-约4毫克/毫升的量包含所述鱼精蛋白。
5.物传感器，包括: (a)基底，对分析物特异性的捕获抗体固定至所述基底； (b)根据权利要求1-4中任一项的免疫测定试剂；和 (C)与固定至所述基底的所述捕获抗体相同的检测抗体。
6.权利要求5的生物传感器，其为基于质量的传感器、光学传感器、电传感器或磁传感器。
7.权利要求5的生物传感器，其中所述基底为选自硅晶片、玻璃基底、石英基底、金属基底、和塑料基底的至少一种。
8.测分析物的高度灵敏的方法，包括: 制备根据权利要求1-4中任一项的免疫测定试剂； 向所述免疫测定试剂添加检测抗体以产生检测抗体-分析物复合物； 将所述检测抗体-分析物复合物与捕获抗体结合，由此产生检测抗体-分析物-捕获抗体复合物；和 检测所述分析物。
9.权利要求8的方法，其中检测所述分析物包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、电-化学发光测定(ECL)、放射免疫测定(RIA)、固相RIA(SPRIA)、免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、或荧光激活细胞分类(FACS)。
10.权利要求8的方法，其中所述捕获抗体或检测抗体用萤光素酶、萤光素、马来酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、杂环氧化酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶标记。
11.权利要求8的方法，其中使用包括鱼精蛋白的免疫测定试剂的测定的灵敏度比没有鱼精蛋白的相同测定的大。
12.权利要求8的方法，进一步包括将对所述分析物特异性的捕获抗体固定至基底。
13.权利要求8的方法，其中所述捕获抗体和所述检测抗体相同。
14.权利要求8的方法，其中制备免疫测定试剂包括将包括分析物和纤维蛋白原的样品与鱼精蛋白组合以形成鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
15.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括在将所述免疫测定试剂与检测抗体接触之前，从所述免疫测定试剂除去所述鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
16.测分析物的高度灵敏的方法，包括: 制备根据权利要求1-4中任一项的免疫测定试剂； 将所述免疫测定试剂与捕获抗体接触以形成捕获抗体-分析物复合物； 将所述捕获抗体-分析物复合物与检测抗体接触以形成捕获抗体-分析物-检测抗体复合物；和 检测所述分析物。
17.权利要求16的方法，其中检测所述分析物包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、电-化学发光测定(ECL)、放射免疫测定(RIA)、固相RIA (SPRIA)、免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、或荧光激活细胞分类(FACS)。
18.权利要求16的方法，其中所述捕获抗体或检测抗体用萤光素酶、萤光素、马来酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶(AP)、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、杂环氧化酶、乳过氧化物酶或微过氧化物酶标记。
19.权利要求16的方法，其中使用包括鱼精蛋白的免疫测定试剂的测定的灵敏度比没有鱼精蛋白的相同测定的大。
20.权利要求16的方法，进一步包括将对所述分析物特异性的捕获抗体固定至基底。
21.权利要求16的方法，其中所述捕获抗体和所述检测抗体相同。
22.权利要求16的方法，其中制备免疫测定试剂包括将包括分析物和纤维蛋白原的样品与鱼精蛋白组合以形成鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
23.权利要求16的方法，其中所述方法进一步包括在将所述免疫测定试剂与捕获抗体接触之前，从所述免疫测定试 剂除去所述鱼精蛋白-纤维蛋白原复合物。
全文摘要
本发明提供使用鱼精蛋白测定在样品中存在的分析物的高度灵敏的方法、以及免疫测定试剂和生物传感器，其通过鱼精蛋白与样品中存在的纤维蛋白原的静电相互作用而减少非特异性结合。
文档编号G01N33/543GK103091496SQ20121027800
公开日2013年5月8日 申请日期2012年8月7日 优先权日2011年11月4日
发明者李埈炯, 李守*, 崔伦硕, 朴珍映, 徐慧净, 李贞男, 韩京燕 申请人:三星电子株式会社