专利名称：一种检测水样双酚a的酶联免疫试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及检验检疫，特别涉及ー种用于检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
双酚A，中文名称2，2-双(4-羟基苯基)丙烷，英文名称
2,2-bis (4-hydroxyphenyl) propane 或 Bisphenol A (简称为 BPA),易溶于醇、丙酮、こ醚、ニ氯甲烷、苯及稀碱液等，微溶于四氯化碳，几乎不溶于水。BPA是重要的有机化工原料，苯酚和丙酮的重要衍生物，主要用于生产聚碳酸酷、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等多种高分子材料。也可用于生产增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳定剂、橡胶防老齐IJ、农药、涂料等精细化工产品。BPA在生产生活中几乎无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到及食品包装的内里，都 有它的身影。每年全世界生产2700万吨含有BPA的塑料。但BPA也能导致内分泌失调，威胁着胎儿和儿童的健康。BPA是制造包括婴儿奶瓶、水瓶、其他食品和饮料容器等坚硬和透明聚碳酸酯塑料的关键物质。癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与BPA有夫。国内外市售婴儿用聚碳酸酯塑料奶瓶在沸水下检出双酚A析出，可能会危害婴儿的健康；桶装水因为其便利而在人们日常生活普及，已有文献报道在桶装水中检出的双酚A，长期摄入含有双酚A的饮用水会影响健康；而事实上研究表明长期暴露在食品包装物上的双酚A剂量水平要比实验室里双酚A致动物癌变的剂量水平高的多。由于欧盟认为含双酚A奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止含生产化学物质双酚A(BPA)的婴儿奶瓶。随着人们对食品安全意识的提高，由于双酚A在环境中的广泛存在及其危害性。为保障食品安全，开发出快速、有效并能够适应现场检测需要的双酚A残留的检测手段显得尤为重要。目前现有技术中对双酚A的測定多采用色谱法，但该方法中所用的仪器造价昂贵且耗时较长，样品前处理复杂，而且不能用于现场检测，使其应用范围受到一定的限制。与之相比，ELISA技术在大量样品的现场快速筛选方面有着无可比拟的独特优势。但是目前国内实际应用的检测双酚A的ELISA试剂盒很少，主要依赖进ロ。因此，本课题致力于研究制备效价高，亲和性好，特异性强的抗体，用于建立BPA免疫分析检测的产品和使用方法。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供ー种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够适合大量样本筛查的试剂盒，以及利用其检测水样中双酚A含量的检测方法。本发明提供的酶联免疫试剂盒用于水样双酚A的检测，要能够做到操作简便、费用低廉、灵敏度高并且能够进行现场监控，还适合大量样本筛查。为了达到上述发明目的，本发明提供的技术的原理和技术方案如下
一、本发明的检测原理为
先在酶标板上固定一定量的双酹A偶联抗原,加入样本溶液或双酹A标准品溶液后,接着加入一定量的双酚A特异性抗体，使待测抗原和固定抗原竞争性地与溶液中游离的双酚A特异性抗体结合，充分洗涤未反应的抗体和抗原，再加入一定量的酶标ニ抗(抗抗体)进行放大作用，充分洗涤后，加底物显色液显色。结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的抗体越少，酶标ニ抗的量就越少，显色越浅，两者呈负相关。此实验的条件是固定抗原限量，抗体定量，酶标ニ抗限量。固定抗原与待测抗原和抗体结合的位点相同，竞争性地与抗体结合。ニ、本发明的技术方案为
本发明一方面提供了ー种用于检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒，它含有
(I)包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；
(2)双酚A标准品溶液；
(3)双酚A特异性抗体；
(4)底物显色液；
(5)終止液;
(6)浓缩洗涤液；
(7)酶标ニ抗溶液。
在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述包被抗原为双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物。通过Friedel-Crafts烧基化反应在双酹A上引入羧基,制得能够与蛋白质偶联的双酚A半抗原，再将其与N-羟基丁ニ酰亚胺和N，N’ - ニ环己基碳ニ亚胺混合后反应，与蛋白质偶联制备双酚A完全抗原，
在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，双酚A特异性抗体为兔抗双酚A的多克隆抗体，用双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物作为免疫原通过免疫兔制得。在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述的洗涤液为O. 05%的吐温-20 (TWEEN-20)磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为I :I)，显色剂A液为过氧化氢，显色剂B液为四甲基联苯胺溶液。在本发明检测水样中双酚A的酶联免疫试剂盒中，所述的酶标ニ抗的标记酶为辣根过氧化物酶。为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一歩包括双酚A-BSA包被的96孔酶标板、双酚A标准溶液、底物显色液、浓缩洗涤液、終止液。另ー方面，本发明还提供了ー种检测样品中双酚A含量的方法，包括步骤
(1)样品前处理；
(2)用上述的试剂盒进行检測，向包被有双酚A抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗双酚A多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记ニ杭，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪測定吸光度值；
(3)分析检测結果。基于上述技术方案，本发明的试剂盒和检测方法与现有技术相比具有如下技术优点
I.本发明检测双酚A的试剂盒主要采有间接竞争酶联免疫測定法定性或定量样品中双酚A含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。2.本发明该试剂盒采用高特异性的双酚A多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差。3.本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点。
图I是本发明专利检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒中的双酚A的检测标准曲线图。
具体实施例方式下面我们结合附图和具体的实施例来对本发明的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒及其检测方法做进ー步的详细阐述，以求更为清楚明了地理解本发明的成分组成和エ作流程，但不能以此来限制本发明的保护范围。一、先进行双酚A完全抗原合成。 (I)半抗原的合成。组织反应装置，将250mL三ロ反应烧瓶放入带有冰浴的IL玻璃容器中，玻璃容器盛有冰-盐水混合液，带有数字温度计可随时读数，然后将玻璃容器置于磁力搅拌器中；向三ロ烧瓶中加入磁力搅拌子，插入回流冷凝管(上装无水CaCl2干燥管和尾气吸收装置)、插入滴液漏斗。再向三ロ烧瓶中加入50mL N，N’- ニ甲基甲酰胺、I. 335g (0.01 mol)无水A1C13 和 2.280g (O. Olmol) BPA，搅拌，冰浴冷却至(TC 以下，缓慢滴加 O. 945g (O. 01 mol)氯こ酸，滴加过程中保持温度在O 5°C，滴加完毕，在0°C反应3 h，再补加I. 335g无水A1C13，升温至60 70°C反应，使溶液沸腾，回流3h。反应结束后，冷却至室温，然后经离心、过滤、干燥得到白色固体，即为羧基化双酚A (半抗原)。(2)双酚A完全抗原的合成及纯化。采用DCC+NHS法合成双酚A完全抗原，具体步骤如下
I、将22mg半抗原(MW=228)溶于ImL N，N-ニ甲基甲酰胺，通过磁力搅拌的方式使其完全溶解成溶液。2、称取13. 3mg NHS和17. 4mg DCC加入上述溶液中，室温下磁力搅拌过夜，反应现象为搅拌过程中逐渐出现白色沉淀。3、将该溶液以2000r/min离心lOmin，弃沉淀，收集上清即为溶液A。4、称取5Omg BSA (Roche，200g)溶于 5mL O. OlM (ρΗ7· 4) PBS 中，为溶液 B。5、将溶液B预冷至约4°C。6、将溶液A利用200 μ L的移液枪逐滴加入到溶液B中，控制速度使其在3(T45min加完，加完后低温下继续搅拌3h生成反应混合液。反应现象为随着溶液A的滴入，溶液B逐渐出现浑浊。7、将反应混合液装入透析袋透析。8、在4°C下用O. OlM (pH7. 4) PBS透析两天，每天换液3次。9、收集透析后的浑池溶液,2000r/min离心IOmin,弃沉淀,收集上清溶液。ニ、双酚A多克隆抗体的制备。在免疫前一周取家兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照。采用合成的完全抗原双酚A-BSA对两只家兔进行免疫。为了获得针对半抗原双酚A质量良好的抗体，采用小剂量长程免疫方案
(I)免疫途径选用背部6点皮下注射，这6点分别为靠近淋巴结的腋下、背部、腹股沟各两侧。(2)初次免疫剂量为I. 2mg免疫原/只左右，约含半抗原90 μ g。取I. 5mL完全抗原(浓度为2mg/mL)与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后进行免疫。考虑到乳化过程中的损失以及免疫前因排除针头内空气的损失，所以完全抗原稍过量。(3)加强免疫采用弗氏不完全佐剂，剂量与首次免疫相同。初次免疫3周后进行第一次加强免疫，以后再次加强免疫，时间间隔同样为3周。第二次加强免疫后第10天左右采血，測定血清抗体效价。采用饱和硫酸铵盐析沉淀法纯化抗血清。获得的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒包括有如下组分
(1)包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；
(2)双酚A标准品溶液；
(3)双酚A特异性抗体；
(4)底物显色液；
(5)終止液;
(6)浓缩洗涤液；
(7)酶标ニ抗溶液。三、建立双酚A的ELISA检测方法。( I)包被抗原和抗体最佳浓度的确定。取包被抗原羧基化双酚A_0VA(5. 65mg/mL)，用包被缓冲液稀释1000倍，按照酶标板上A — G的方向进行纵向稀释，每行浓度相同，包被体积为100 μ L /孔，4°C过夜后洗涤，封闭液封闭。双酚A抗体从1:2000开始，再作2倍梯度稀释，按照酶标板上1_>6的方向进行横向稀释，每一列的稀释度相同，共6个梯度，抗体体积为50μ L /孔，接着加入羊抗兔ニ抗(推荐浓度1:5000)，37°C温育30min，洗涤3次，TMB显色lOmin，IM H2SO4终止反应，酶标仪测定其0D450nm。表I是双酚A方阵试验结果的试验结果，该实验结果表明包被抗原稀释2000，抗体稀释8000时，对应点正好位于线性区间的中间位置，变化梯度最大，而且吸光值
I.315>1. O,适合用于竞争实验。
权利要求
1.一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，酶联免疫试剂盒中含有(I)包被有双酚A-BSA包被抗原的96孔酶标板；(2)双酚A标准品溶液；(3)双酚A特异性抗体；(4)底物显色液；(5)終止液;(6)浓缩洗涤液；(7)酶标ニ抗溶液。
2.如权利要求I所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标板中包被的包被抗原为双酚A半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋；通过Friedel-Crafts烷基化反应在双酚A上引入羧基，制得能够与载体蛋白偶联的双酚A半抗原，再将其与N-羟基丁ニ酰亚胺和N，N’ - ニ环己基碳ニ亚胺混合后反应，与载体蛋白偶联制备双酹A完全抗原。
3.如权利要求I所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的双酚A标准品溶液的浓度分别为O μ g/L，O. I μ g/L, 0. 5 μ g/L, 1.0yg/L, 3. 0 μ g/L和10 μ g/L。
4.如权利要求I所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述双酚A特异性抗体为兔抗双酚A的多克隆抗体，用双酚A半抗原与牛血清蛋白的偶联物作为免疫原通过免疫兔制得。
5.如权利要求I所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为PH 7. 4，含有1%吐温20和O. 5%叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求I所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述的酶标ニ抗为羊抗兔IgG。
7.如权利要求I所述的检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，其特征在干，所述酶标ニ抗的酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液，终止液为2mol/L的硫酸。
8.一种样品中双酚A含量的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤第一歩，样品前处理对于较干净的水样可直接測定；对于悬浮物含量较高的包括水样在内的液态样品，取样品使用超滤膜过滤，或者离心处理；对于悬浮物含量很高的样品，先采用粗纤维素膜过滤，再使用细纤维素膜膜过滤；若样品中双酚A含量>20. O μ g/L，可用超纯水对样品进行适当稀释后再測定；若样品中双酚A含量〈O. 2μ g/L，采用固相萃取对样品进行适当浓缩再測定；第二步，用上述的酶联免疫试剂盒进行检测a.将试剂盒从冰箱取出，放置室温下平衡；b.将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释，试剂盒上每孔加入洗涤液即可注满；C.阴性孔和标准品孔分别加入双酚A标准品O μ g/L，O. I μ g/L, 0. 5 μ g/L,I. 0 μ g/L, 3. 0 μ g/L, 10. 0 μ g/L ;样品孔各加入待测样品；d.每孔同时各加入抗双酚A抗体和酶标ニ抗溶液；e.在反应环节，轻轻振摇混匀，室温下反应；f.在洗涤环节，甩掉板中液体，每孔加满洗涤液，放置后用カ甩掉洗涤液，共洗涤Γ5次；g.在显色环节，每孔加入底物A溶液后，再同时加入底物B溶液，轻轻振摇混匀，室温下显色；h.在終止环节，在每个微孔中加入終止液，终止显色反应，此时蓝色将迅速变为黄色；i.轻轻摇动微孔板測定各孔的吸光度； (3)分析检测結果以测定的双酚A标准品的吸光度平均值为纵坐标，以各标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线；将横坐标设置成对数坐标，对标准曲线进行对数拟合，得出方程A = aX InC + b，得出R2值，计算出各样品孔平均吸光度㈧对应的样品浓度q _pi s.」，其中，A —吸光度 ，a —斜率，C—双酹A浓度，b —截距，R2 —决定系数，Cs 一待测样品双酚A浓度。
全文摘要
发明提供了一种检测水样双酚A的酶联免疫试剂盒，它含有包被有包被原的酶标板，酶标二抗溶液，双酚A抗体溶液，双酚A标准品溶液，底物显色液，终止液和浓缩洗涤液；利用上述酶联免疫试剂盒检测对于悬浮物含量较高的水样双酚A的方法，先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒用于水样双酚A的检测，具有操作简便和灵敏度高的优点，并且制作费用低廉，能够进行现场监控且适合大量样本筛查。
文档编号G01N33/543GK102830227SQ20121034677
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者吴晓红, 缪文彬, 蒋伟, 朱洪坤, 陈相 申请人:上海出入境检验检疫局工业品与原材料检测技术中心