专利名称：锌离子作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用及其测定方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，主要是 ー种在治疗糖尿病方面上的锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的应用及其测定方法。
背景技术：
根据《糖尿病医学》Diabate Medicine，10，688 (1993)报道，a -葡萄糖苷酶抑制剂可抑制存在于小肠微绒毛的a-葡萄糖苷酶，延缓碳水化合物的吸收，延迟双糖、低聚糖、多糖的吸收，延迟并减低餐后血糖升高，可作为ー种新型的糖尿病治疗药物。a-葡萄糖苷酶抑制剂对改善高血糖症状和高血糖所致的肥胖症、糖尿病等各种疾病很有用。目前临床常用的a-葡萄糖苷酶抑制剂为阿卡波糖(Acarbose,拜唐苹)或其类似物，是由微生物发酵制得的，可竞争性抑制多种a-葡萄糖苷酶(如蔗糖酶、麦芽糖酶、淀粉葡萄糖苷酶等)的活性，对糖尿病有很好的疗效，但长期使用可能会出现胃肠胀气、腹痛、腹泻等消化道副反应，且制药成本较高。因此，寻找更为安全高效的a-葡萄糖苷酶抑制剂成为研究热点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的应用及其測定方法，其作用同阿卡波糖类似，且具有来源丰富、廉价、易于制备和容易摄取等特点。本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的应用为=Zn2+通过抑制酶活性从而减缓或抑制碳水化合物的消化吸收，可作为II型糖尿病的治疗药物。锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的測定方法为I)配制0. 6mM (毫摩尔/升)醋酸锌，用50mMこ磺酸(pH 6. 5)缓冲液逐级稀释成不同浓度，a -葡萄糖苷酶用50mM磷酸缓冲液(pH7. 4)配制成3 y M a -葡萄糖苷酶液；2)将不同浓度的醋酸锌30 y L与等体积的a -葡萄糖苷酶液混合，设置不含醋酸锌的30 y L缓冲液与等体积的a -葡萄糖苷酶混合作为空白対照，以上体系25°C保温3hr后测定酶活力。作为优选，用上述50mM磷酸缓冲液(pH7. 4)配制IOmM pNPG溶液，取600 u L分别与上述等体积的醋酸锌溶液和こ磺酸缓冲液(空白对照)混合，作为测定a -葡萄糖苷酶活性的底物体系。所述的a-葡萄糖苷酶抑制剂的活力測定方法为先将ImL预热至37°C的含不同浓度Zn2+的pNPG底物置于比色皿中，加入5 ii L对应Zn2+浓度的a -葡萄糖苷酶溶液，迅速混合，通过岛津公司UV-1800紫外可见分光光度计检测400nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度V值，从而表征酶活性的大小，其測定温度为37°C。本发明的有益效果为锌离子对a-葡萄糖苷酶具有强效的抑制作用，锌离子可成为II型糖尿病治疗的有效的作用物质。
图I是Zn2+对a -葡萄糖苷酶的抑制影响图；图2是V和[E]的关系图；图3 是 Lineweaver-Burk 双倒数图；图4是根据图3求得的Slope值对Zn2+浓度作图；图5是Zn2+抑制a -葡萄糖苷酶的时间过程图；图6是根据图5进行的时间过程半对数曲线分析图；图7是Zn2+对a-葡萄糖苷酶内源荧光的影响图； 图8是a -葡萄糖苷酶内源荧光最大荧光强度处波长随Zn2+浓度变化图；图9是a -葡萄糖苷酶ANS结合的最大荧光强度随Zn2+浓度变化图；图10是a -葡萄糖苷酶的序列比对图；图11是a -葡萄糖苷酶的计算机结构模拟图；图12是a -葡萄糖苷酶与Zn2+作用的初始结构图；图13是a -葡萄糖苷酶与Zn2+的分子动力学模拟图；图14是a -葡萄糖苷酶与Zn2+结合的结构模拟图。
具体实施例方式下面将结合附图对本发明做详细的介绍锌离子(Zn2+)是很多酶催化作用的辅助因子，同时担任转录因子的作用和突触传导的底物。Zn2+对于机体的正常生长、免疫功能和伤ロ愈合等均有作用。因此，Zn2+是生物体必须的营养因子，在机体的代谢和疾病抵抗中起重要作用。鉴于Zn2+对细胞作用的重要性，在饮食中需含有足够量的锌以维护机体健康。另ー方面，Zn2+在某些条件下还具有抑制酶活性的功能。本发明的目的在于提供Zn2+的新用途，即作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的新应用。本发明所用的Zn2+,来源于醋酸锌ニ水合物，其英文名称为Zinc acetatedihydrate，分子式为Zn(CH3COO)2 2H20，分子量219. 51，为白色单斜片状晶体，易溶于水，
其化学结构式如下所示
H3CT、0* Zn2+ 21^0
』JS醋酸锌ニ水合物为商品化物质，可以从试剂公司直接购买到。本发明所用a-葡萄糖苷酶的英文名称为Alpha-glucosidase，来源于酿酒酵母，为冻干粉末，购于Sigma公司。为了更好的理解本发明的实质，下面详细说明Zn2+作为a-葡萄糖苷酶抑制剂使用的机理。I. a -葡萄糖苷酶活性测定方法a -葡萄糖苷酶可催化底物对硝基苯-a _D_批喃葡糖苷(p_Nitrophenyla -D-glucopyranosid e, pNPG)形成 4_ 硝基酌'(^i-Nitrophenol, pNP),而 pNP 在 400nm 波长处有最大吸收峰。因此通过测定酶催化反应体系的A4tltl随时间的增长直线，该直线的斜率即为a -葡萄糖苷酶的活力。即以PNPG为底物通过分光光度法在波长400nm处测定pNP的产生速度来计算a -葡萄糖苷酶活力的大小。具体測定方法为在ImL用50mM磷酸缓冲液(PH7.4)配制的5mM pNPG底物体系中，加入5 y L a -葡萄糖苷酶溶液，迅速混匀，通过岛津公司UV-1800紫外可见分光光度计检测400nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度v值，从而表征酶活性的大小。測定温度为37°C。2. Zn2+对a -葡萄糖苷酶抑制作用的測定配制0. 6mM (毫摩尔/升)醋酸 锌，用50mM 2_(N_吗啡啉)こ磺酸(MES)缓冲液(pH 6. 5)逐级稀释成不同浓度。将不同浓度的醋酸锌30 UL与等体积的a-葡萄糖苷酶液混合，25°C保温3hr后测定酶活力。测定时a -葡萄糖苷酶终浓度为I. 5 u M(微摩尔/升)，底物pNPG浓度为5mM，底物中含相应浓度抑制剂醋酸锌。Zn2+浓度与a -葡萄糖苷酶活力的关系如图I所示。由图I可知a-葡萄糖苷酶活力被Zn2+以浓度依赖的方式显著地抑制，酶活力下降一半时Zn2+的浓度(IC5tl)为0. 056±0. 006mM(n=3);当Zn2+浓度高于0. 3mM时，酪氨酸酶被完全抑制。3. Zn2+对a -葡萄糖苷酶的抑制为可逆的抑制作用为了判断Zn2+介导的抑制作用是否为可逆反应，在反应体系中，加入不同浓度的醋酸锌，当底物PNPG浓度不变时，改变a -葡萄糖苷酶的加入量，測定a -葡萄糖苷酶催化底物氧化的活力随酶量的关系。结果如图2所示v值代表在400nm波长处每分钟吸光值的变化，[E]代表a-葡萄糖苷酶的浓度，Zn2+浓度分别为0 (▼)、(). 03 ( A ),0. 045 (■)和0. 06mM( )，体系中pNPG的终浓度为5mM。图中直线均经过坐标轴原点，直线的斜率随着加入Zn2+浓度的增大而下降，证实Zn2+对a -葡萄糖苷酶的抑制作用是ー个可逆过程。4. Zn2+对a -葡萄糖苷酶的抛物线-混合型抑制分析为评估Zn2+对a -葡萄糖苷酶抑制的类型，用Lineweaver-Burk双倒数法作图。混合型抑制动力学分析的Lineweaver-Burk方程如公式I所示
权利要求
1.锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。
2.一种锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的測定方法，其特征在干 1)、配制0.6mM毫摩尔/升的醋酸锌，用50mMこ磺酸pH为6. 5的缓冲液逐级稀释成不同浓度，a -葡萄糖苷酶用50mM、pH7. 4的磷酸缓冲液配制成3 y M a -葡萄糖苷酶液； 2)、将不同浓度的醋酸锌30y L与等体积的a -葡萄糖苷酶液混合，设置不含醋酸锌的30uL缓冲液与等体积的a -葡萄糖苷酶混合作为空白対照，以上体系25°C保温3hr后测定酶活力。
3.根据权利要求I所述的锌离子作为a-葡萄糖苷酶抑制剂的測定方法，其特征在于用上述50mM、pH7. 4的磷酸缓冲液配制IOmM pNPG溶液，取600 u L分别与上述等体积的醋酸锌溶液和こ磺酸缓冲液空白对照混合，作为测定a-葡萄糖苷酶活性的底物体系。
4.根据权利要求2或3所述的a-葡萄糖苷酶抑制剂的測定方法，其特征在于活力测定方法步骤如下先将ImL预热至37°C的含不同浓度Zn2+的pNPG底物置于比色皿中，加入5V- L对应Zn2+浓度的a -葡萄糖苷酶溶液,迅速混合,通过紫外可见分光光度计检测400nm处每分钟吸光值变化来指示反应速度V值，从而表征酶活性的大小，其測定温度为37°C。
全文摘要
本发明涉及一种锌离子作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用及其测定方法，1)配制0.6mM(毫摩尔/升)醋酸锌，用50mM乙磺酸(pH 6.5)缓冲液逐级稀释成不同浓度，α-葡萄糖苷酶用50mM磷酸缓冲液(pH7.4)配制成3μMα-葡萄糖苷酶液；2)将不同浓度的醋酸锌30μL与等体积的α-葡萄糖苷酶液混合，设置不含醋酸锌的30μL缓冲液与等体积的α-葡萄糖苷酶混合作为空白对照，以上体系25℃保温3hr后测定酶活力。本发明的有益效果为锌离子对α-葡萄糖苷酶具有强效的抑制作用，锌离子可成为II型糖尿病治疗的有效的作用物质。
文档编号G01N21/31GK102861002SQ20121037643
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者尹尚军, 斯越秀, 钱国英, 朴龙斗 申请人:浙江万里学院