一种使用bodipy类荧光染料测定微藻油脂含量的方法
【专利摘要】本发明是一种使用BODIPY类荧光染料快速测定微藻油脂含量的方法。本发明解决了现有技术测定微藻油脂含量所需样品大、成本高以及藻类自身荧光干扰的技术问题。本发明方法：将待测藻液通过稀释或离心浓缩，调整OD值至0.15左右，与终浓度为0.05μg/ml-1μg/ml的BODIPY荧光染料和终浓度为0%-40%的DMSO混合后，在25℃-60℃温度范围内，避光染色10min，选择400-600nm作为激发波长，测定在发射波长450-700nm之间的荧光强度，荧光强度与藻细胞中油脂含量呈正相关，可用于进行相对或绝对定量。本发明方法适用于绿藻门、红藻门、金藻门、黄藻门、褐藻门、隐藻门、硅藻门、甲藻门等单细胞藻类进行油脂含量的快速高通量测定。
【专利说明】一种使用BODIPY类荧光染料测定微藻油脂含量的方法
【技术领域】
[0001]具体说是一种使用BODIPY类荧光染料测定微藻中油脂含量的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着石油资源日趋紧张，生物能源尤其是微藻生物能源得到了越来越多的关注和发展。作为目前液体燃料最适宜的替代物，生物柴油是众多可替代能源中最有可能率先大规模应用的产品。作为生物圈最大生物量之一的微藻，具有快速生长和光合固定二氧化碳双重优势，是具有很高应用前景的生物柴油生产生物。微藻生物技术的开发，将为我国提供新的能源途径。
[0003]但在世界范围内，海洋微藻能源研究及应用尚处于起步阶段，存在的突出问题是成本过高，理论和现实差距大，许多关键技术有待突破，就前期的研究来看，如何选取适合的藻种是关键。但是目前生长快的微藻藻种通常含油量只有10%?20%，体积小于10微米的细胞也不易于收获，而含油量大于60%的藻种生长速度较慢，因此需要开展工程藻种的良种优化，选育细胞生长快、含油量高和易于收获的藻种。所以快速测定微藻油脂含量成为迫在眉睫的工作，也是其他各项后续工作的前提。
[0004]重量法是最为常用的微藻油脂测定方法，但是所需样品量大，样品处理与提取过程耗时长，不能满足微藻油脂研究和生产的检测要求。于是出现了使用尼罗红荧光染料来分析油脂含量的方法，但是尼罗红的发射光在590-640nm附近，与很多藻的自身叶绿素荧光相互干扰。该染料本身的特异性问题，造成检测的不准确性。急需一种更为广泛适用的能够避免藻类自身荧光干扰的荧光染料。
[0005]BODIPY是一类近红外的短波长的荧光染料，常见的有B0DIPY493/503、B0DIPY500/510、B0DIPY505/515、B0DIPY530/550、B0DIPY558/568，它们大多可以避开大部分藻自身叶绿素荧光的干扰，目前已有人在流式细胞仪中使用该染料进行筛选，但是使用该方法受到仪器的限制，因为该仪器对藻体的大小要求较高，过大或过小的藻都无法进行检测，不能广泛应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种适应性更为广泛的荧光染料快速测定微藻油脂含量的方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为:
[0008]一种使用BODIPY类荧光染料测定微藻油脂含量的方法，是使用BODIPY类荧光染料在荧光分光光度计中对待筛的藻种的油脂含量进行检测，快速筛选出油脂含量较高的微藻。
[0009]使用BODIPY类荧光染料对藻类油脂进行染色，使用荧光分光光度计进行微藻油脂含量的测定。
[0010]将待测藻液通过稀释或离心浓缩，调整OD值至0.15左右，与终浓度为0.05 μ g/ml-1 μ g/ml的BODIPY荧光染料和终浓度为0%_40%的DMSO混合后，避光染色5_15min，在荧光分光光度计上，选择400-600nm作为激发波长，测定在发射波长450_700nm之间的荧光强度，荧光强度与藻细胞中油脂含量呈正相关，并得到油脂含量与荧光强度的计算公式为:y=0.0037χ-0.5521。
[0011]所述的BODIPY类荧光染料的浓度0.05 μ g/ml-1 μ g/ml。
[0012]BODIPY类荧光染料的溶剂为体积分数为0.05%-40%DMS0水溶液。
[0013]所述的BODIPY类荧光染料对藻类油脂的染色温度为25_60°C。
[0014]所述藻为绿藻门、红藻门、金藻门、黄藻门、褐藻门、隐藻门、硅藻门、或甲藻门等单细胞藻类中的一种或二种以上。
[0015]同时根据藻的不同油脂含量和相应的荧光强度的相关性，制定标准曲线，再测定该藻种时可以直接根据荧光强度在标准曲线中获得油脂含量。
[0016]本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0017]1.解决了藻类自身叶绿素荧光的干扰；
[0018]2.检测快速、高通量:所述荧光分光光度计测定样品油脂含量可在比色皿和孔板内进行，真正实现了快速、高通量的检测；
[0019]3.需要样品量与成本低:与传统测油脂含量的重量法相比，重量法每次至少需要IOOmg冻干藻粉来测量以保证结果准确度，而本方法只需几微升的藻液，极大的降低了检测所用的样品量；如果以此方法为基础进行藻种筛选，就无需为了获得藻粉而进行的培养、收获、冻干等一系列的时间和经济成本，很大程度的降低了油脂含量测定来筛选微藻的成本；
[0020]4.克服了流式细胞仪操作不能普遍适用所有藻种的缺点。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为金藻荧光强度与油脂含量的标准曲线。
[0022]【具体实施方式】:下面通过具体实施例对本发明方法和结果进行说明。
[0023]藻种:
[0024]海水藻:亚心形四月藻(Tetraselmis subcordiformis)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、巴夫藻(Pavlova viridis)、新月藻(Nitzschiaclosterium)、紫球藻(Porphyridium cruentum)、淡 /JC 衣 藻(Chlamyclomonasreinhartii)、多糖小球藻(Chlorella sacchrarophila)；
[0025]培养基:不同的微藻使用不同的培养基
[0026]康维方培养基:培养亚心形四月藻使用的培养基。
[0027]最终浓度为:NaN03100mg/L，NaH2PO4.2Η2020.0mg/L, EDTA_Na245.0mg/L,H3B0333.6mgL, MnCl2 *4H200.36mg/L, FeCl3 *6H201.3mgL, ZnCl20.21mg/L, CoCl2 *6H200.20mg/L, (NH4)4Mo7O24 *4H200.09mg/L, CuSO4 *5H200.20mg/L, KN03lg/L, KH2PO40.05g/L,Tris0.81g/L, CH3COOH0.346g/L。
[0028]f/2培养基:培养湛江等鞭金藻、紫球藻和巴夫藻使用的培养基。
[0029]最终浓度为:NaN0375mg/L,NaH2PO4.2H205mg/L, VitaminB120.5 μ g/L,Biotin0.5 μ g/L, vitamin B10.lmg/L, FeCl3.6H203.16mg/L, Na2EDTA.2H204.36mg/L,CuSO4.5Η209.8 μ g/L, Na2MoO4.2Η206.3 μ g/L, ZnSO4.7Η2022 μ g/L, CoCl2.6Η2012 μ g/L,MnCl2.4Η200.18mg/L。
[0030]f/2+硅酸钠培养基:培养新月藻使用的培养基。
[0031]最终浓度为:NaN0375mg/L，NaH2PO4.2H205mg/L, Na2Si0330
[0032]mg/L, VitaminB120.5 μ g/L, Biotin0.5 μ g/L, vitamin B10.lmg/L,FeCl3.6H203.16mg/L, Na2EDTA.2H204.36mg/L, CuSO4.5H209.8 μ g/L, Na2MoO4.2H206.3 μ g/L, ZnSO4.7H2022 μ g/L, CoCl2.6H2012 μ g/L, MnCl2.4H200.18mg/L。
[0033]SE培养基:培养多糖小球藻的培养基。
[0034]最终浓度为:NaN030.25g/L, K2HPO4.3Η200.075g/L, MgSO4.7Η200.075g/L,CaCl2.2H200.025g/L, KH2PO40.175g/L, NaCl0.025g/L, FeCl3.6H200.005g/L, Fe-EDTAImL,H3B032.86mg/L ；MnCl2.4H201.86mg/L ；ZnS04.7H200.22mg/L ；Na2Mo04 2H200.39mg/L ；CuSO4.5H200.08mg/L ；Co (NO3)2.6H200.05mg/L ;示蛋白胨=IgL0
[0035]TAP培养基:培养淡水衣藻的培养基。
[0036]最终浓度为:NH4C10.375g/L ；MgS04.7Η200.I g/L ；CaCl2.2H20
[0037]0.05g/L ；K2HPO40.108g/L ；KH2PO40.054g/L ；EDTA-Na20.2g/L ；ZnS04.7H200.22g/L ；H3B030.0 5 7g/L ；MnCl2.4H200.1012g/L ；CoCl2.6H200.0322g/L ；CuSO4.5H200.0314g/L ；(NH4)6Mo7O24.4H200.022g/L ；FeS04.7H200.998g/L ；Tris2.42g/L ;冰乙酸 lmL。
[0038]培养条件:七株藻的培养条件相同。
[0039]温度(25± I) °C,光暗时间比14h:1Oh,日光灯作光源。初培养于3L锥形瓶中，光强为(50±5) ymol/m2/s，培养至指数期接种使用。培养均在600ml柱状管式反应器中完成(直径5cm，长度42cm的玻璃管)，培养体积为500ml，光强(200± 10) μ mol/m2/s, 2%C02，通气速率0.8vvm，接种初始密度200X 104cel 1/ml。
[0040]实施例1:
[0041]选用了亚心形四月藻(Tetraselmissubcordiformis)考察DMSO浓度对突光染料染色效果的影响。
[0042]通过测定OD值来监测亚心形四月藻细胞生长状况，待藻细胞生长到稳定期后的第3天，测定OD值后，将OD稀释至0.15 ;分别向96孔板中加入5 μ L稀释后的藻液，3 μ L的BODIPY染料，292 μ L DMSO水溶液，共300 μ L体系，室温，避光染色lOmin。选择470nm作为激发波长，测定在发射波长515nm的荧光强度。每个样品有8个重复。
[0043]在不同的DMSO的体积分数条件下对藻细胞进行染色，读取荧光强度，考察了 DMSO浓度为0.05%-40%时的荧光强度。
[0044]实施例2:
[0045]选用了新月藻(Nitzschia closterium)考察突光染料浓度对染色效果的影响。
[0046]通过测定OD值来监测新月藻细胞生长状况，待藻细胞生长到稳定期后的第3天，测定OD值后，将OD稀释至0.15 ;分别向96孔板中加入5 μ L稀释后的藻液，3 μ L的BODIPY染料，292 μ LDMSO水溶液，共300 μ L体系，室温，避光染色lOmin。选择470nm作为激发波长，测定在发射波长515nm的荧光强度。每个样品有8个重复。
[0047]在不同的BODIPY最终质量浓度条件下对藻细胞进行染色，读取荧光强度，分别考察了 BODIPY浓度为0.05 μ g/ml-1.00 μ g/ml、时的荧光强度。[0048]实施例3:
[0049]选用了紫球藻(Porphyridium cruentum)考察染色温度对染色效果的影响。
[0050]通过测定OD值来监测紫球藻细胞生长状况，待藻细胞生长到稳定期后的第3天，测定OD值后，将OD稀释至0.15 ;分别向96孔板中加入5 μ L稀释后的藻液，3 μ L的BODIPY染料，292 μ LDMSO水溶液，共300 μ L体系，室温，避光染色lOmin。选择470nm作为激发波长，测定在发射波长515nm的荧光强度。每个样品有8个重复。
[0051]在不同的温度下对藻细胞进行染色，读取荧光强度，分别考察了温度为250C _60°C时的荧光强度。
[0052]实施例4:
[0053]选用了湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)考察不同中性脂含量与突光强度的相关性。
[0054]通过测定OD值来监测金藻细胞生长状况，在整个培养过程中，每天测定OD值、荧光强度、干重和油脂含量。
[0055]将OD稀释至0.15，加入BODIPY荧光染料，室温，避光染色lOmin。选择470nm作为激发波长，测定在发射波长515nm的荧光强度。
[0056]通过重量法对每天取的藻样进行油脂含量的测定。具体方法如下:称取IOOmg藻粉，加入2mL正己烷进行总脂的提取，提取三遍，合并三次的提取液，氮气吹扫，待样品溶剂挥发至小于0.5ml左右，将其烘干后称重即可测得油脂占干重百分比。
[0057]根据荧光强度与对应的油脂含量测定值制定标准曲线，并找出相关的区域。得到油脂含量与荧光强度的计算公式:
[0058]y=0.0037x-0.5521，R2=0.9832，线性相关的区域为油脂含量在10%_30%之内的样
品O
[0059]再测定相同培养条件的该藻种的荧光值，上述相同条件下测得金藻荧光值为3439.528，即可直接通过上述公式计算获得油脂含量的数值为11.9%，进而再对此份金藻的藻粉通过重量法进行油脂含量的测定，测定值为11.8%，故此公式可用于通过测定荧光值而得到油脂含量。
[0060]实施例5:
[0061]选用了淡水衣藻(Chlamyclomonas reinhartii)验证不同油脂含量与突光强度的计算公式的适用性。
[0062]将藻液OD稀释至0.15，加入BODIPY荧光染料，室温，避光染色lOmin。选择470nm作为激发波长，测定在发射波长515nm的荧光强度。
[0063]根据测得的荧光强度4590.559，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521 计算油脂含量为 16.4%。
[0064]通过重量法测得的此份淡水衣藻的油脂的含量为15.6%
[0065]实施例6:
[0066]本实施例与实施例5不同的是:所用的实验藻种为多糖小球藻(Chlorellasacchrarophila)，所述的DMSO水溶液的浓度为0.5%，其他步骤和参数与具体实施例5相同。
[0067]根据测得的荧光强度2064.978，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521计算油脂含量为7.1%。
[0068]通过重量法测得的此份淡水衣藻的油脂的含量为8.3%
[0069]实施例7:
[0070]本实施例与实施例6不同的是:所述的DMSO水溶液的浓度为20%，其他步骤和参数与具体实施例6相同。
[0071]根据测得的荧光强度2628.335，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521计算油脂含量为9.2%。
[0072]通过重量法测得的此份淡水衣藻的油脂的含量为10.6%
[0073]实施例8:
[0074]本实施例与实施例5不同的是:所用的实验藻种为巴夫藻(Pavlova viridis),所述的BODIPY荧光染料的浓度为0.05 μ g/ml，其他步骤和参数与具体实施例5相同。
[0075]将藻液OD稀释至0.15,加入,室温,避光染色lOmin。选择470nm作为激发波长，测定在发射波长515nm的荧光强度。
[0076]根据测得的荧光强度9193.625，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521 计算油脂含量 33.5%。
[0077]通过重量法测得的此份淡水衣藻的油脂的含量为35.1%
[0078]实施例9:
[0079]本实施例与实施例8不同的是=BODIPY浓度为0.5 μ g/ml，其他步骤和参数与具体实施例8相同。
[0080]根据测得的荧光强度8777.388，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521 计算油脂含量 31.9%。
[0081]通过重量法测得的此份淡水衣藻的油脂的含量为34.4%
[0082]实施例10:
[0083]本实施例与实施例5不同的是:所用的实验藻种为紫球藻(Porphyridiumcruentum),所述的染色温度为25°C,其他步骤和参数与具体实施例5相同。
[0084]根据测得的荧光强度1544.769，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521 计算油脂含量 5.2%。
[0085]通过重量法测得的此份紫球藻的油脂的含量为8.0%
[0086]实施例11:
[0087]本实施例与实施例10不同的是:所述的染色温度为40°C，其他步骤和参数与具体实施例10相同。
[0088]根据测得的荧光强度1915.002，通过之前得到的油脂含量与荧光强度的计算公式y=0.0037x-0.5521 计算油脂含量 6.5%。
[0089]通过重量法测得的此份紫球藻的油脂的含量为8.5%。
【权利要求】
1.一种使用BODIPY类荧光染料测定微藻油脂含量的方法，其特征在于:使用BODIPY类荧光染料在荧光分光光度计中对待筛的藻种的油脂含量进行检测，快速筛选出油脂含量高的微藻。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:使用BODIPY类荧光染料对藻类油脂进行染色，使用荧光分光光度计进行微藻油脂含量的测定。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于: 将待测藻液通过稀释或离心浓缩，调整OD值至0.15左右，与终浓度为0.05 yg/ml-1 μ g/ml的BODIPY荧光染料和终浓度为0%_40%的DMSO混合后，避光染色5_15min，在荧光分光光度计上，选择400-600nm作为激发波长，测定在发射波长450-700nm之间的荧光强度，荧光强度与藻细胞中油脂含量呈正相关，并得到油脂含量与荧光强度的计算公式为:y=0.0037χ-0.5521。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:所述的BODIPY类荧光染料的浓度0.05 μ g/ml-1μ g/ml。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:所述的BODIPY类荧光染料的溶剂为体积分数为0.05%-40%DMS0水溶液。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:所述的BODIPY类荧光染料对藻类油脂的染色温度为25-60°C。
7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述藻为绿藻门、红藻门、金藻门、黄藻门、褐藻门、隐藻门、硅藻门、或甲藻门等单细胞藻类中的一种或二种以上。
【文档编号】G01N21/64GK103808697SQ201210442558
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月8日 优先权日:2012年11月8日
【发明者】薛松, 刘亚男, 曹旭鹏 申请人:中国科学院大连化学物理研究所