替考拉宁发酵液单位的hplc快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法，是将替考拉宁发酵液加碱处理后，经过超声与两次离心，取澄清液过一次性滤膜后上机检测分析；高效液相色谱仪的主要配置为反相C18柱，检测器为紫外检测器；所用流动相为乙酸铵溶液-乙腈缓冲液进行梯度洗脱，在277nm条件下进行数据采集分析。本发明的检测方法简便快捷，灵敏度高，准确性好。
【专利说明】替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于检测方法【技术领域】，具体而言，涉及一种替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法。
【背景技术】
[0002]替考拉宁属于糖肽类抗生素，对革兰氏阳性菌具有强大的抗菌活性，临床上常用于严重的革兰氏阳性菌感染，对金葡菌的作用常优于糖肽类抗生素万古霉素，因此替考拉宁的生产与研发日益受到重视。最早替考拉宁是国外Parenti等从一株游动放线菌A.teichomyceticus nov.sp.发酵得到的,该菌种即现在常用的ATCC31121 ;国内研究主要有稀有放线菌 SIIA92-363、A.teichomyceticus 98-1-227 及其 SIIA 05-03-136，该三株菌的发酵液中均可分离到替考拉宁。研究发现该药物是一组复杂的化合物，由5个结构很相近的TA2+ TA2_2、TA2_3、TA2_4和TA2_5组成。第6个活性物质是TA3+该化合物不存在于发酵液中，但在提取和纯化中均有微量存在。
[0003]随着发酵技术的日益提高，替考拉宁发酵液单位的检测分析在生产与研发中也日益突出。目前常用的发酵液单位检测是高效液相色谱法(HPLC)，相对于生物检测或其他方法，HPLC法具有快速分析、定量准确等优点，所以应用也日益广泛。目前常用的HPLC法为2001年第十四版日本药典(JP XIV)规定的检测方法，具体为:流动相A:15%乙腈-磷酸二氢钠溶液(0.025mol/L),B:70%乙腈-磷酸二氢钠溶液(0.025mol/L)，两相均用lmol/LNaOH溶液调节pH至6.0，梯度洗脱，流速为1.8mL/min。该方法缺点在于:每个样品分析时间为60min，不便于快速检测；流速较高，长时间使用会导致色谱柱柱压升高，增大泵损耗，损坏色谱柱，影响分析的准确度与灵敏度。
【发明内容】
[0004]鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于缩短HPLC法检测替考拉宁发酵液单位的分析时间，同时提高高效液相色谱柱的分离效果与使用寿命，从而提供一种快速检测替考拉宁发酵液单位的方法。
[0005]为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得如下技术方案:
[0006]一种替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法，包括如下步骤:取替考拉宁发酵液，用NaOH溶液调节pH至碱性，超声0.2-lh后离心1_3次，取上清液，过0.22 y m滤膜后进行HPLC检测，检测条件为:
[0007](I)色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相C18柱；
[0008](2)检测器:紫外检测器；
[0009](3)检测波长:入=277nm ；
[0010](4)流动相:A:0.01mol/L乙酸铵溶液，B:90%乙腈水溶液，过滤超声后使用，梯度洗脱；极性有机溶剂的浓度为连续性递增，Omin至17min由5%递增至50%, 17min至25min由50%递减至5% ；[0011](5)流速:1.0mL/min ；
[0012](6)柱温:25 °C;
[0013](7)进样体积:20 ii L。
[0014]优选地，所述替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法，包括如下步骤:取替考拉宁发酵液，用NaOH溶液调节pH至8-12,超声30min后置于离心管中，于IOOOOrpm下离心IOmin,取上清液置于另一离心管中，于IOOOOrpm下离心IOmin,取上清液,过0.22 y m滤膜，按所述检测条件进行HPLC检测。
[0015]进一步优选地，上述对替考拉宁发酵液进行前处理过程中，采用浓度为10% NaOH溶液调节替考拉宁发酵液的pH至10。
[0016]利用本发明的方法对替考拉宁发酵液进行检测后，替考拉宁浓度计算方法为:用替考拉宁标准品配成一定梯度浓度的标准液，20 y L体积进样，以A25个组分峰面积之和-浓度作线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中替考拉宁的峰面积计算发酵液中替考拉宁的含量。
[0017]与现有技术相比，本发明的检测方法简便快捷，灵敏度高，准确性好。经试验，线性范围为0.25?5.0mg/mL范围内，相关系数均在0.999以上。样品检测专一性强，各项方法学指标均可满足发酵液中替考拉宁的检测需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1替考拉宁标准品色谱图；
[0019]图2实施例1的发酵液样品色谱图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实验对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0021]1、样品处理方法
[0022]取一定量的发酵液，用浓度为10% NaOH溶液调节pH至10，超声30min后置于离心管中，于IOOOOrpm下离心lOmin，取上清液置于另一 IOmL离心管中，于IOOOOrpm下离心IOmin,取上清液，过0.22 ii m滤膜后上机检测。
[0023]2、色谱条件
[0024](I)色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相C18柱；
[0025](2)检测器:紫外检测器；
[0026](3)检测波长:入=277nm ；
[0027](4)流动相:A:0.0lmol/L乙酸铵溶液，B:90%乙腈水溶液，过滤超声后使用，梯度洗脱；极性有机溶剂的浓度为连续性递增，Omin至17min由5%递增至50%, 17min至25min由50%递减至5% ；
[0028](5)流速:1.0mL/min ；
[0029](6)柱温:25°C ;
[0030](7)进样体积:20 ii L
[0031]3、标准品储备液
[0032]精密称取IOOmg替考拉宁标准品置于IOmi容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，配制成浓度为10mg/ml的标准储备液，置于4°C冰箱中备用。
[0033]4、标准曲线
[0034]用50%乙醇将3下的标准品储备液稀释至0.25,0.5、1.0,2.0,5.0mg/mL，取各浓度下20 y L体积进样，以A25个组分峰面积之和-浓度作线性回归，得出线性回归方程，利用该方程和样品中替考拉宁的峰面积计算发酵液中替考拉宁的含量。
[0035]5、精密度
[0036]将1.0mg/mL的替考拉宁标准品溶液连续进样5次，每次进样20 U L，按照2下的色谱条件进行测定，记录峰面积，计算精密度。
[0037]6、重复性试验
[0038]取同一批发酵液，按照I中的样品处理方法处理得到5个样品，进样并按照2下的色谱条件进行测定，计算相对标准偏差，比较重现性。
[0039]7、加样回收率试验
[0040]在已知含量的发酵液中，分别精密加入替考拉宁标准品，使其浓度为1.0、2.0、
4.0mg/mL各3份，按照I下的样品处理方法处理，按照2下的色谱条件测定，计算回收率。
[0041]8、稳定性试验
[0042]取1.0mg/ml的替考拉宁标准品溶液室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24h下进样，每次进样20 u L，按照2下的色谱条件进行测定，查看样品溶液在24h内的稳定性。
[0043]9、样品测定
[0044]取移种后培养IOOh的发酵液于锥形瓶中，按照I下的样品处理方法进行处理，按照2下的色谱条件进行测定，计算药物峰面积，带入相应的标准曲线方程中，经计算得出替考拉宁的浓度。
[0045]10、结果分析
[0046]按照4下的方法制备标准曲线，以A2 5个组分峰面积之和-浓度作线性回归，得出线性回归方程Y = 2596000X+1200 (Y为峰面积，X为药物浓度mg/mL)，线性相关系数为R2=0.9999，可见替考拉宁在0.25?5.0mg/mL浓度范围内线性良好。
[0047]精密度试验5次进样后按照峰面积计算相对标准偏差为1.1 %，表明该方法精密度较好；重复性试验5次进样后按照峰面积计算相对标准偏差为1.5%，表明该方法重现性好；经加样后测定回收率，经过峰面积计算得到替考拉宁回收率为99.3%，表明该方法真实性较高；在稳定性试验中，经过检测后，根据峰面积计算相对标准偏差为0.9%，表明该样品标准液在室温条件下放置24h比较稳定。
[0048]取移种后培养IOOh的发酵液处理后上机检测，计算出峰面积后代入线性回归方程，测得浓度为1.3mg/mL。
[0049]由以上试验结果可以看出，该方法准确度高精密度好，回收率、线性关系、稳定性试验等指标均能满足常规发酵液中替考拉宁的快速检测。
【权利要求】
1.一种替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法，其特征在于:取替考拉宁发酵液，用NaOH溶液调节pH至碱性，超声0.2-lh后离心1_3次，取上清液，过0.22 y m滤膜后进行HPLC检测，检测条件为: (1)色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相C18柱； (2)检测器:紫外检测器； (3)检测波长:入=277nm； (4)流动相:A:0.01mol/L乙酸铵溶液，B:90 %乙腈水溶液，过滤超声后使用，梯度洗脱；极性有机溶剂的浓度为连续性递增，Omin至17min由5%递增至50%, 17min至25min由50%递减至5% ；
(5)流速:1.0mL/min ； (6)柱温:25°C； (7)进样体积:20iiL。
2.根据权利要求1所述的替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法，其特征在于:取替考拉宁发酵液，用NaOH溶液调节pH至8-12,超声30min后置于离心管中，于1000Orpm下离心lOmin，取上清液置于另一离心管中，于1000Orpm下离心lOmin，取上清液，过0.22 u m滤膜，按所述检测条件进行HPLC检测。
3.根据权利要去2所述的替考拉宁发酵液单位的HPLC快速检测方法，其特征在于:用浓度为10% NaOH溶液调节替考拉宁`发酵液的pH至10。
【文档编号】G01N30/02GK103776913SQ201210442647
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月25日 优先权日:2012年10月25日
【发明者】赵志全, 王军, 李娜 申请人:鲁南新时代生物技术有限公司