专利名称：一种氯胺酮胶体金唾液检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物检测领域，具体涉及一种氯胺酮胶体金唾液检测试剂盒。
背景技术：
氯胺酮(Ketamine,KET )是苯环己哌唳(N-1-phenycyclohexy-piperidine,PCP)的衍生物，医学上作为外科手术麻醉剂，黑市上俗称“K粉”、“K仔”。近年来在娱乐场所滥用日趋严重。是我国目前的主要的新型毒品之一。目前，我国列入管制的麻醉药品有120多种，精神药品有130多种。研究表明，在服用氯胺酮后都会出现“去人格化”、“去真实感”、人体形象改变、梦境、幻觉以及恶心呕吐，大剂量服用，会出现意识模糊、身体呈木僵状，呼吸抑制，甚至出现四肢抽搐以及呼吸停止等现象；长期使用氯胺酮可造成记忆缺失、认知功能损害和精神病。人体服用的氯胺酮有70% -90%在肝内代谢并经尿液排出，其在体内的代谢较快，清除半衰期约为2. 5小时，一般在吸食后2-4小时内即可被检出。目前对氯胺酮快速检测的方法和仪器较多，主要依靠气相色谱、高效液相色谱、质谱和毛细管电泳等进行检测，但存在仪器昂贵、检测时间长，需要专业技术人员操作的缺点。胶体金免疫层析技术是目前较为成熟的技术方法，其原理是将氯胺酮-BSA结合物包被在硝酸纤维薄膜上，在玻璃纤维上包被胶体金标记的特异性抗体。在检测时，如样本中没有氯胺酮或其代谢产物存在，胶体金标记的特异性抗体与膜区抗原结合形成两条红线(一条反应线T，一条质控线C)，表明检测结果为阴性；如样本中存在氯胺酮或其代谢产物，而且浓度高于检测水平(1000ng/ml)时，毒品分子就与胶体金标记的抗体竞争结合，从而阻止胶体金标记的抗体与膜区抗原结合，使其对应的红色反应线消失，仅出现一条红色的质控线，表明检测结果为阳性。尽管以胶体金免疫层析技术为原理生产的的氯胺酮检测试剂盒(胶体金法)已经得到了较为广泛的临床应用，但其检测标本为尿液，目前国内外尚未有研制和生产以人体唾液作为检测样本的氯胺酮唾液检测试剂盒。现有的尿液试剂盒在其使用过程中存在如下不足之处(I)样本采集不卫生，为很多样本采集者和检测者难以接受；(2)隐私权问题，SP性隐蔽取尿，女性尿检时需要女性人员监督；(3)新兵、公务员、特殊从业人员(飞行员、驾驶员、高空作业者等)体检，受试者易在标本采集中掺假制造假阴性；(4)而取尿时需有专用场所，而且必须一对一进行监督取尿，很不方便，不适用于驾驶员路旁筛查和娱乐场所突击抽查；(5)在实际使用过程中，易发生与美沙酮、美沙芬等药物交叉问题，从而导致错检和误检。
实用新型内容(一 )要解决的技术问题本实用新型要解决的技术问题是如何方便快捷地检测人类唾液中的氯胺酮。( 二 )技术方案为了解决上述技术问题，本实用新型提供一种氯胺酮唾液检测试纸条，其包含以下部分反应支持物5上依次相互搭接粘贴的上样垫I、金标垫2、反应膜3和吸水垫4 ;反应膜3上间隔设置有平行的反应线和质控线，反应线设置在反应膜3上邻近上样垫一端1，而质控线设置在远离上样垫I的一端；所述的反应线是包被有与载体蛋白偶联的氯胺酮的条带，所述的质控线是包被有二抗IgG的条带。进一步的技术方案是，该试纸条反应线和质控线的条带形状为条形或线形。本实用新型还提供了一种氯胺酮唾液检测试剂盒，包含检测试纸和卡套8，其中该检测试纸包含以下部分反应支持物5上依次相互搭接粘贴的上样垫I、金标垫2、反应膜3和吸水垫4 ;反应膜3上间隔设置有平行的反应线和质控线，反应线设置在反应膜3上邻近上样垫一端I，而质控线设置在远离上样垫I的一端；所述的反应线是包被有与载体蛋白偶联的氯胺酮的条带，所述的质控线是包被有二抗IgG的条带；检测试纸容纳于卡套8内，且该卡套8设置有与该检测试纸上反应线和质控线相对应的观察窗7。 进一步的技术方案是，该卡套对应检测试纸的上样垫I开设有加样孔6。进一步的技术方案是，该试剂盒还包括一个唾液收集拭子。进一步的技术方案是，该试剂盒还包括一个能够卡合在卡套上的卡帽。进一步的技术方案是，反应线和质控线的条带形状为条形或线形。所述试剂盒中，所述载体蛋白优选为小牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵白蛋白(OVA)和/或血蓝蛋白(KLH)。所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。所述玻璃纤维膜中胶体标记的氯胺酮的单克隆抗体的pH值为8. 0 8. 5，胶体金和氯胺酮单克隆抗体的配比为2 12y g/ml胶体金。优选地，所述玻璃纤维膜中胶体金标记的氯胺酮的单克隆抗体的pH值为8. 2，胶体金和氯胺酮单克隆抗体的配比为g/ml胶体金。所述金标垫是将胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体加入脱脂奶粉，离心后取沉淀，沉淀用复溶液复溶后喷涂于玻璃纤维膜上制得。所述复溶液是由终浓度为0. 01 0. 2mol/lTris，l% 5%BSA*0. 01% 0. 2%络蛋白，I % -3%海藻糖或1% -5%蔗糖或0. I % -1% EDTA,0. 1% 2%曲拉通X-100或0. 1% 0.5%土温-20或0.01% 0.5% S9表面活性剂，0. 1% 1%柠檬酸钠，0. 1% 2% ￠-环糊精，0. 1% 1% PEG20000,0. 1 % 2%水解干络素，0. I % 2%氯化钠或0. 1% 2%氯化钾或0. 1% 2%氢氧化钠，0. 05% 0. 1%叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7.0 8. O。所述脱脂奶粉加入量为按质量比0. 5%。 1%。加入10%的脱脂奶粉。所述复溶液是按照原初始标记时所用胶体金溶液体积的40% 100%进行复溶的。所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗体的包被浓度为0. 2 I. Omg/ml，所述抗鼠IgG抗体的包被浓度为0. 2 I. Omg/ml o优选地，所述氯胺酮或抗氯胺酮多克隆抗体的包被浓度为0.4mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的包被浓度为0. 4mg/mlo所述包被浓度是由划膜液稀释获得的，划膜液是由终浓度为0. 01-0. 2mol/lTris,1% -3%海藻糖或1% -3%蔗糖或0. I % -1% EDTA,0. 05% -0. I %叠氮钠配制而成，HCl调节pH值为7. 2 7.8。本实用新型氯胺酮唾液检测试剂盒，还包括反应支持物(5)、上样垫(1)，所述反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的上样垫(I)、金标垫(2)、反应膜(3)和吸水垫(4)。所述上样垫含有上样垫处理液，处理液配方为0. 01 0. 2mol/LTris,0. I % 2 % 曲拉通 X-100 或 0. I % 0. 5 % 土温-20或0.01% 0.5% S9表面活性剂，0. 1% 2%柠檬酸钠，0. 1% 2%柠檬酸，0. 05% 0.2%聚乙烯吡咯烷酮，0. I % 2% 3-环糊精，0.1% 1%明胶，0.1% 2% a淀粉酶，0. 1% 1%氯化钠或0. 1% 1%氯化钾或0. 1% 1%氢氧化钠，0. 05% 0. 1%叠氮钠 配制而成，上述浓度均为配制处理液后的终浓度，HCl调节pH值为8. 0 9. O。所述上样垫为本实用新型试剂盒的加样区，反应膜为反应区。本领域技术人员可以根据需要，将本实用新型提供的试剂盒的加样区制作为实际检测中可接受的装置，以利于唾液的收集。依次将上样垫、胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体玻璃纤维膜、包被有氯胺酮-BSA(或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)和抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫在反应支持物上进行组装；用切条机按纵向剪切，裁成宽度为4_的条状。得到检测试纸，将检测试纸置于卡套8内，该卡套8设置有与该检测试纸上反应线和质控线相对应的观察窗7，得到氯胺酮胶体金检测试剂盒。所述反应支持物优选PVC板；所述上样垫优选(玻璃纤维)；所述吸水垫优选吸水滤纸。本实用新型提供了所述氯胺酮胶体金检测试剂盒在检测氯胺酮中的应用。(三)有益效果本实用新型通过优化胶体金标抗体复溶液、划膜液配方，优化标记过程和包被过程的工艺参数，使唾液检测试纸条能够满足产品设计的性能指标要求；通过优化上样垫处理液配方，解决了唾液样本粘稠、含有多种干扰物质等阻碍因素。在本实用新型提供的复溶液配方中，与传统配方相比增加了 3 -环糊精、海藻糖和水解干络素等成分；在划膜液配方中增加了海藻糖成分；整个试剂盒反应系统中选用Tris-HCl缓冲系统替代了传统方法使用的磷酸缓冲液系统；在标记过程中，选用脱脂奶粉替代BSA作为稳定剂，能对氯胺酮单克隆抗体和氯金酸溶液的结合过程起到更好的保护。通过溶液的配方改进提高了本实用新型试剂盒的灵敏度，与现有的氯胺酮尿液试剂盒的最低检出量为1000ng/ml相比，而本实用新型的试剂盒的最低检出量为50ng/ml，灵敏度显著高于现有技术的检测试剂盒。本实用新型提供的氯胺酮胶体金检测试剂盒，以人体唾液为检测样本，可有效监测唾液中氯胺酮，特异性强，重复性好，灵敏度高，最低检出量达到50ng/ml，该试剂盒操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。
图I为本实用新型氯胺酮胶体金检测试纸条的正面示意图；图2为本实用新型氯胺酮胶体金检测试纸条的侧面示意图；其中，I :上样垫；2 金标垫，为含有胶体金标记氯胺酮单克隆抗体的玻璃纤维膜；3 :反应膜(包被氯胺酮单克隆抗体的检测条带；C :包被抗鼠IgG的质控条带)；4 :吸水垫；5 :反应支持物。[0039]图3为本实用新型氯胺酮胶体金检测试剂盒正面示意图；其中，6 :加样孔；7 :观察窗；8:卡套。图4为本实用新型试剂盒检测结果示意图；其中，6为加样区对应的加样孔，7为反应区对应的观察窗，图4A、4B、4C的反应区和加样区同图4D ；T为反应线，C为质控线；从左至右依次为图4A，阳性，C 一条线；图4B，阴性，C和T共两条线；图4C，无效，T 一条线；图4D，无效，C和T均没有显示条线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本实用新型的内容，但不应理解为对本实用新型的限制。在不背离本实用新型精神和实质的情况下，对本实用新型方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本实用新型的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若为特别说明，实施例中所用的试剂为市售。本实用新型中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液IOOml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在20°C时容量的比例本实用新型用到的试剂，其来源如下化学试剂(氯金酸、碳酸钾、Tris、海藻糖、蔗糖、EDTA、曲拉通X-100、土温20、S9、柠檬酸钠、柠檬酸、PEG20000、水解干络素、氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、叠氮钠、HCl、P -环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、a淀粉酶等)均外购于国药集团北京化学试剂公司，试剂级别为分析纯；脱脂奶粉外购于普通超市，品牌为完达山、光明；牛血清白蛋白(BSA)、络蛋白外购于Sigma公司、罗氏公司；氯胺酮的单克隆抗体外购于Medix、Aresta公司；氯胺酮-BSA(或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)外购于Medix公司、Aresta、杭州隆基公司、广州博肯公司；抗鼠IgG外购于杭州隆基公司、广州博肯公司；实施例I氯胺酮胶体金检测试剂盒(参见图1-3)I、胶体金的制备准确量取IOOmL的纯化水，放入圆底烧瓶中，加热、搅拌至沸腾。将2mL 1%氯金酸溶液加入到沸水中，继续加热、搅拌。当溶液再次沸腾时，准确量取2mLl. 0%柠檬酸三钠溶液快速加入到溶液中，继续煮沸。仔细观察溶液颜色，当溶液由黄色变成紫黑色，最后变成酒红色稳定后，开始计时，继续加热IOmin即可。待溶液温度恢复至室温后，停止搅拌，用纯化水恢复体积至IOOmL,放置在4°C条件下避光保存备用。2、氯胺酮单克隆抗体金标垫的制备2. I所需原料氯胺酮单克隆抗体；上述步骤I制得的胶体金溶液；1.0% K2CO3 ; 10%脱脂奶粉；复溶液；玻璃纤维。复溶液配方为按以下组分终浓度进行配制0. 01mol/L Tris，2% BSA，2%海藻糖，2%曲拉通X-100，0. 2% ￠-环糊精，0. 5%柠檬酸钠，0. 5% PEG20000，0. 2 %水解干络素，0. 1%氯化钠，0. 05%叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。具体配置方法为(以IOOml为例):取IOOml纯化水，依次加入0. OOlmol的Tris、2g BSA、2g海藻糖、0. 2g ￠-环糊精、0. 5g柠檬酸钠、0. 5gPEG20000、0. 2g解干络素，0. Ig氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100,均勻搅拌30min,后加入0. 05g叠氮钠均匀搅拌lOmin，用HCl调节pH值为7. 4，4°C条件下避光保存备用。2. 2胶体金-氯胺酮抗体标记过程氯胺酮抗体标记的过程(用2mL胶体金标记为例):取2mL制备好的胶体金溶液，用I. 0% K2C03调 pH值至8. 2后，移液器准确吸取5mg/mL氯胺酮单克隆抗体0. 8 ii L，缓慢加到胶体金溶液中，摇匀后静置30min。然后取10 y L的10%脱脂奶粉(终浓度质量比0. 5%0)逐滴加入溶液中，摇匀后静置30min。然后放入离心机，在12000rpm温度为4°C的条件下离心30min。完毕后，吸取上清液，弃掉，沉淀用复溶液按原初始标记时所用胶体金溶液体积的60 %复溶，混匀。2. 3胶体金标记物固相化把I. 25ml的复溶好的胶体金标记物喷涂于0. 6cmX30cm
的玻璃纤维上，370C，烘干4h。铝箔袋密封，室温保存备用。经实验确定，氯胺酮单克隆抗体胶体标记的其最佳结合pH值为8. 2，胶体金和抗体的配比为8 u g/ml胶体金。标记胶体金经复溶液处理后，按每平方厘米70 u I的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上。3、包被硝酸纤维素膜制备反应膜将氯胺酮-BSA (用于包被检测线T)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(用于包被质控线C)用划膜液分别稀释至0. 4mg/mL，然后分别加入到自动划膜仪的T杯和C杯中；调试自动划膜仪，喷液量设定为I. O ii L/cm,导轨速度8. Ocm/sec,喷嘴I与2间隔6mm。调试完成后，划膜包被，形成检测线(T线)和质控线(C线)，37°C，烘干4小时。待检验合格后铝箔袋密封，室温存放备用。划膜液配方为按以下组分终浓度进行配制0. lm0l/lTriS，2%海藻糖、0.4%EDTAjO. 05%叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为7.4。4、上样垫的制作上样垫处理液配制方法为按以下组分终浓度进行配制0. 03mOl/lTriS，2%曲拉通x-100，0. 5%柠檬酸钠，0. 2%柠檬酸，0. I %聚乙烯吡咯烷酮，0. 15% ￠-环糊精，0. 1%明胶，0.15% a淀粉酶，0.2%氯化钠，0.05%叠氮钠配制而成，用HCl调节pH值为8. O。具体配置方法为(以IOOml为例)取IOOml纯化水，边加热边加入0. Ig明胶后搅拌溶解，溶解后恢复体积和室温，依次加入0. 003mol的Tris、0. 5g柠檬酸钠、0. 2g柠檬酸、0. Ig的聚乙烯吡咯烷酮、0. 15g ￠-环糊精、0. 15ga淀粉酶、0. 2g氯化钠，常温搅拌溶解后按体积比加入2ml曲拉通X-100,均勻搅拌30min,后加入0. 05g叠氮钠均勻搅拌IOmin,用HCl调节pH值为8. O，2-8°C条件下避光保存备用。取上述上样垫处理液45ml，喷涂于25cmX 30cm的玻璃纤维上，37°C，烘干4h，得到上样垫。铝箔袋密封，室温保存备用。5、氯胺酮胶体金检测试剂盒组成反应支持物5 为 6. 5cm X 0. 4cm PCV 板；上样垫I为2cmX0. 4cm的玻璃纤维；0. 4cmX 0. 4cm的金标垫2含有胶体金标记的氯胺酮单抗玻璃纤维膜；[0073]I. 8cmX0. 4cm的硝酸纤维膜依次包被氯胺酮-BSA，羊抗鼠IgG，二者间隔6mm ；吸水垫4为2. 7cmX0. 4cm的吸水滤纸；按照由1_4的顺序依次组织。上样垫I为加样区，反应膜3为反应区。依次将上样垫I、胶体金标记的氯胺酮单克隆抗体玻璃纤维膜即金标垫2、包被有氯胺酮-BSA (或氯胺酮-OVA或氯胺酮-KLH)和抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜即反应膜3、吸水垫4在反应支持物5上进行组装；用切条机按纵向剪切，裁成宽度为4_的条状，得到检测试纸，将检测试纸置于卡套8内，该卡套8设置有与该检测试纸上反应线和质控线相对应的观察窗7，卡套8对应检测试纸的上样垫I处开设有加样孔6。得到氯胺酮胶体金检测试剂盒。即形成了氯胺酮检测试剂盒(胶体金法)。实施例2检测方法(参见图4)将待检标本唾液直接加入到实施例I制得的试剂盒加样孔6处或通过外加的唾液收集试子采集待测者唾液置于加样孔6中，样品液通过毛细作用沿膜前移，3-5分钟内判读结果，超出10分钟，结果无效。结果如果样本中含有氯胺酮(阳性)，则在质控线C处出现一条红色条带，反应线T处没有条带。如果样本中没有含氯胺酮(阴性)，则在质控线C处和反应线T处各有一条条带，共两条带。无论标本中是否含有氯胺酮，检测结果在“C”处都形成一条条带。此线是质控线，如果胶体金失效，此线就不会出现，说明试剂盒失效。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本实用新型要求保护的范围。
权利要求1.一种氯胺酮唾液检测试纸条，该试纸条中包含以下部分反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的上样垫(I)、金标垫(2)、反应膜(3)和吸水垫(4);反应膜(3)上间隔设置有平行的反应线和质控线，其特征在于，反应线设置在反应膜(3)上邻近上样垫一端(1)，而质控线设置在远离上样垫(I)的一端；所述的反应线是包被有与载体蛋白偶联的氯胺酮的条带，所述的质控线是包被有二抗IgG的条带。
2.如权利要求I所述的氯胺酮唾液检测试纸条，其特征在于反应线和质控线的条带形状为条形或线形。
3.一种氯胺酮唾液检测试剂盒，包含检测试纸和卡套(8)，检测试纸依次包含以下部分反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的上样垫(I)、金标垫(2)、反应膜(3)和吸水垫(4);所述反应膜(3)上间隔设置有平行的反应线和质控线，其特征在于，所述反应线设置在反应膜(3)上邻近上样垫一端(I)，而质控线设置在远离上样垫(I)的一端；所述反应线是包被有与载体蛋白偶联的氯胺酮的条带，所述的质控线是包被有二抗IgG的条带；所述检测试纸容纳于卡套(8)内，且该卡套(8)设置有与该检测试纸上反应线和质控线相对应的观察窗⑵。
4.如权利要求3所述的氯胺酮唾液检测试剂盒，其特征在于，该卡套对应检测试纸的上样垫(I)开设有加样孔(6)。
5.如权利要求3或4所述的氯胺酮唾液检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括一个唾液收集拭子。
6.如权利要求3或4所述的氯胺酮唾液检测试剂盒，其特征在于，还包括一个能够卡合在卡套上的卡帽。
7.如权利要求3或4所述的氯胺酮唾液检测试剂盒，其特征在于，反应线和质控线的条带形状为条形或线形。
专利摘要本实用新型提供了一种氯胺酮胶体金唾液检测试剂盒，包含检测试纸和卡套，其中检测试纸包含以下部分在反应支持物(5)上依次相互搭接粘贴的上样垫(1)、金标垫(2)、反应膜(3)和吸水垫(4)；所述反应膜(3)上间隔设置有平行的反应线和质控线；所述的反应线是包被氯胺酮的条带，质控线是包被有二抗IgG的条带；检测试纸容纳于卡套(8)内，该卡套设置有与该检测试纸上反应线和质控线相对应的观察窗(7)。本实用新型试剂盒，可有效检测唾液中氯胺酮，特异性强，重复性好，灵敏度高，最低检出量达到50ng/ml，该试剂盒操作简单，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广，适合于现场检测。
文档编号G01N33/558GK202512118SQ201220146099
公开日2012年10月31日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者戴国华 申请人:戴国华