专利名称：Ngal荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条。
背景技术：
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)是1993年在中性粒细胞内首次被发现的，与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导以及多种肿瘤的发生于发展等过程相关。国内外研究表明，NGAL蛋白在多种疾病发生过程中具有特异性表达变化的特点，使得NGAL成为检测疾病的生物标志物。近年美国临床化学协会(AACC)年度会议的研究结果发表得知检测尿中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白可能有助于临床医生检测心脏移植患者环孢霉素诱导的毒性，以及调节环孢霉素剂量以预防其对肾脏造成的不可逆伤害。中国专利CN101163971A研究在急性肾衰竭(ARF)、急性肾小管坏死(ATN)和急性肾小管间质性肾病(ATIN)发病的早期，尿液和血液中NGAL水平显著增加，因此NGAL是早期检测肾脏对缺血性损伤的标志物。目前，检测NGAL方法主要有酶联免疫法(中国专利CN101650369A)、基于抗体免疫的微型柱测试法(中国专利CNlOl 163971A)和胶乳免疫比浊法(中国专利CN102072960A)。酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确；胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。荧光纳米检测是一种将荧光纳米与蛋白分子偶联，制备成免疫层析诊断试剂，并用专门的荧光纳米检测仪进行检验的新型快速检测方法。该方法具有检测快速、操作简便、适合床边检测和实时记录保存结果等优点，目前还未见NGAL检测采用荧光纳米干式免疫技术的报道。
发明内容本实用新型目的提供一种快速检测、操作简便、灵敏度高、适合床边检测的NGAL荧光纳米定量检测试纸条。本实用新型的技术方案为一种NGAL荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有荧光纳米颗粒标记的抗NGAL抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗NGAL抗体B的检测线和兔抗鼠IgG抗体的质控线。所述荧光纳米颗粒为无机发光量子点或复合荧光二氧化硅纳米粒子。所述标记抗NGAL抗体A和包被抗NGAL抗体B为配对的单克隆抗体或配对的单抗-多抗。所述结合垫材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。所述样品垫材质为玻璃纤维素膜、聚酯膜或红细胞过滤膜。一种NGAL荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制备方法包括如下步骤[0013]I).包被荧光纳米颗粒标记NGAL抗体A结合垫的制备荧光纳米颗粒在偶联剂的作用下与NGAL抗体A形成荧光纳米抗体A复合物；将所得荧光纳米颗粒标记抗NGAL抗体A喷涂在结合垫上。2).硝酸纤维素膜的制备用包被缓冲液分别稀释抗NGAL抗体B和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的两种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜上，两种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成抗NGAL抗体B检测线和兔抗鼠IgG抗体的质控线。3).在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。本实用新型与现有技术相比，具有如下优点I)本实用新型制作方便，体积小、便于携带；2)本实用新型通过对试纸条上荧光纳米-抗体-抗原-抗体复合物荧光信号的检测，能够准确对NGAL含量进行定量；3)本实用新型可批量生产，适用于床边快速诊断和现场快速检测，易于保存和在基层医院的推广使用。
图1为本实用新型NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条结构示意图；其中，图1 :1、底衬；2、样品垫；3、结合垫；4、硝酸纤维素膜；5、吸水纸；6、检测线；7、质控线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式
对本实用新型作进一步详细的说明。如图1所示，一种NGAL荧光纳米免疫快速定量检测试纸条，包括底衬1、吸水纸5，底衬I上从左到右依次粘贴样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，结合垫3上包被有NGAL单克隆抗体相偶联的荧光纳米颗粒，硝酸纤维素膜4上包被有NGAL抗体的检测线6和兔抗鼠IgG抗体的质控线7。上述硝酸纤维素膜上检测线6还可以是包被抗NGAL的多克隆抗体，所述多克隆抗体是采用本领域熟练技术人员熟知的常规方法免疫鼠获得抗血清制备而得。所述荧光纳米颗粒为无机发光量子点或复合荧光二氧化硅纳米粒子。所述结合垫材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。所述样品垫材质为玻璃纤维素膜、聚酯膜或红细胞过滤膜。实施例1NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条制备方法如下I).包被荧光纳米颗粒标记NGAL抗体A结合垫3的制备CdTe荧光量子点和NGAL单克隆抗体3B1在偶联剂EDC作用下得到CdTe标记NGAL抗体复合物，将所得复合物用Bio-Dot仪的喷头喷到玻璃纤维素膜上，即得结合垫3。所述NGAL单克隆抗体3B1记载在中国专利申请号2012102309716中，是由杂交瘤细胞株3B1产生的，所述杂交瘤细胞株3B1保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO :C201249，保藏日期为2012年5月9号。2).检测线6的制备将NGAL单克隆抗体4C2使用20mmol/L的PBS (pH7. 2)稀释到3mg/ml的浓度，按O. 8 μ 1/cm在硝酸纤维素膜4上划线，即得检测线6，在干燥箱内20°C鼓风干燥12h。所述NGAL单克隆抗体4C2记载在中国专利申请号2012102309716中，是由杂交瘤细胞株4C2产生的，所述杂交瘤细胞株4C2保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO :C201250，保藏日期为2012年5月9号。3).质控线7的制备将兔抗鼠IgG抗体使用20mmol/L的PBS (pH7. 2)稀释到3mg/ml的浓度，按O. 8 μ 1/cm在硝酸纤维素膜4上划线，即得质控线7，该线与检测线6平行，然后在干燥箱内20°C鼓风干燥12h，密封干燥保存。4)样品垫2的制备将样品垫2用PBS缓冲液浸泡2 4小时，取出后25°C干燥8小时。5)试纸条组装在底衬I上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、玻璃纤维素膜3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。实施例2NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条制备方法如下I).包被荧光纳米颗粒标记NGAL抗体A结合垫3的制备①含有共价连接有机染料的二氧化娃突光纳米颗粒与O. 5mg/ml、pH7. 4的链霉亲和素PBS溶液，4°C反应18-24h，用lmol/L甘氨酸封闭、洗涤，即得链霉亲和素_ 二氧化硅荧光纳米复合物。②将抗NGAL单克隆抗体3B1用O. lmol/L、pH8. O碳酸氢钠缓冲液稀释至lmg/ml，交互用O. lmol/L、pH8. O碳酸氢钠缓冲液对NGAL抗体3B1充分透析；用Iml DMSO溶解Img的NHSB，得到NHSB溶液；向上述ImlNGAL单克隆抗体3B1溶液加入20 μ I NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7. 2PBS缓冲液透析，即得生物素化抗NGAL单克隆抗体3B1。③将链霉亲和素-二氧化硅荧光纳米复合物和生物素化抗NGAL单克隆抗体3B1混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用含有O. 05% BSA的50mM、pH5. 8的柠檬酸钠缓冲液溶解，恢复至原体积。④将步骤③所得二氧化硅荧光纳米标记NGAL单克隆抗体3B1用Bio-Dot仪的喷头喷到玻璃纤维素膜上，即得结合垫3。2).检测线6的制备将NGAL多克隆抗体使用20mmol/L的PBS (pH7. 2)稀释到3mg/ml的浓度，按O. 8 μ 1/cm在硝酸纤维素膜4上划线，即得检测线6，在干燥箱内20°C鼓风干燥12h。3).质控线7的制备将兔抗鼠IgG抗体用20mmol/L的PBS (pH7. 2)稀释到3mg/ml的浓度，按O. 8 μ 1/cm在硝酸纤维素膜4上划线，即得质控线7，该线与检测线6平行，然后在干燥箱内20°C鼓风干燥12h，密封干燥保存。4)样品垫2的制备将样品垫2用PBS缓冲液浸泡2 4小时，取出后25°C干燥8小时。[0053]5)试纸条组装在底衬I上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、玻璃纤维素膜3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。 实施例3样品检测取新鲜血清、全血或尿液100 μ 1，加入到试纸条样品垫上进行免疫反应，时间5-8min;反应结束后，将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小，进行定量测定。
权利要求1.一种NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条，在底衬(I)上依次搭接地粘贴样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水纸(5)，其特征在于所述的结合垫(3)上包被有荧光纳米颗粒标记的抗NGAL抗体A，所述的硝酸纤维素膜(4)上包被有抗NGAL抗体B的检测线(6)和兔抗鼠IgG抗体的质控线(7)。
2.根据权利要求1所述NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条，其特征在于所述荧光纳米颗粒为无机发光量子点或复合荧光二氧化硅纳米粒子。
3.根据权利要求1所述NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条，其特征在于所述标记抗NGAL抗体A和包被抗NGAL抗体B为配对的单克隆抗体或配对的单抗-多抗。
4.根据权利要求1所述NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条，其特征在于所述结合垫(3)材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
5.根据权利要求1所述NGAL荧光纳米免疫定量检测试纸条，其特征在于所述样品垫(2)材质为玻璃纤维素膜、聚酯膜或红细胞过滤膜。
专利摘要本实用新型公开了一种NGAL荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，在试纸条底衬上依次搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有荧光纳米颗粒标记的抗NGAL抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗NGAL抗体B的检测线和兔抗鼠IgG抗体的质控线。本实用新型能够实现快速定量检测、操作简便、灵敏度高。
文档编号G01N33/68GK202837307SQ201220392399
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者苏恩本 申请人:苏恩本