微生物威胁检测的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种依赖于光学检测分析物内部微生物的生长追踪并预测微生物在环境中扩散的方法，所述分析物含有用于待检测的一种或多种微生物的生长培养基。用于每种微生物的容器和生长培养基的标准化允许快速检测具体生物的生长模式和实施在野外从便携式培养箱单元（1201）远程自我报告结果的方案，所述便携式培养箱单元包括存储结果的存储器（1206）、提供位置信息的GPS单元（1204）和发送结果至允许快速追踪并预测环境源有机体扩散的中央测绘机构的发射器（1203）。
【专利说明】微生物威胁检测
【技术领域】
[0001]本发明总体上涉及从整理跨扩展区域检测到的微生物的结果推断威胁，涉及在实验室和在野外培养并分析微生物以确定威胁并且整理来自多个分析实例的结果以允许作出推断。
[0002]更具体地，本发明涉及从其中浸没了有机体的培养基的颜色的变化检测并计数多种不同微生物、在某些位置追踪这些微生物种群并追踪微生物空间种群的出现和扩散或衰落。
[0003]额外地，本发明涉及用于分析物中微生物的生长培养基和辅助剂的标准化，以及分析后使这种分析物在生物学上惰性的介质。
[0004]更具体地，本发明涉及提供用于培养微生物、分析结果并将这些结果报告至用于整理数据的远端点的便携式可重置装置。
【背景技术】
[0005]染料还原试验是已知的，但是认为它们不是微生物类型或存在量的可靠指示剂。它们提供指示细菌存在或不存在的粗略指导。
[0006]以下取自Atherton (阿瑟顿)，H.V.和 Newlander (纽蓝德)，J.A.1977Chemistryand Testing of Dairy Products.(乳产品的化学和测试)第4版,AVI, Westport(西港)，CT.援弓丨于 http://www.foodsc1.uoguelph.ca/dairyedu/resazurin.html
[0007]“亚甲基蓝还原试验基于以下事实，通过添加染料(例如亚甲基蓝)向乳赋予的颜色将或多或少迅速消失。从乳移除氧并且细菌代谢期间形成还原性物质造成颜色消失。负责耗氧的因子是细菌。尽管某些细菌物种比其他物种具有明显更大的影响，但是通常假定乳中细菌数目越大，则氧消耗得越迅速，并转而颜色消失得越快。因而，以还原时间作为乳中有机体数目的量值，不过，实际上有可能它是在细菌细胞表面继续进行的总代谢反应的更真实量值。
[0008]与亚甲基蓝还原试验相似实施刃天青试验，基于孵育规定时间后产生的颜色亦或或基于还原染料至给定终点所需要的时间，判定质量。如果恰当地实施并明智地解读，刃天青试验可能是一项省时的有价值工具，但是应当辅以显微镜检查。
[0009]刃天青试验可靠性的结果是矛盾的。一个在235份样品上比较刃天青试验与Breed (布里德)显微镜法的研究发现该检验是可靠的。其他报告宣称刃天青试验是乳中细菌学品质的不可靠指标。对该方法的主要批评在于，在20°C或37°C冷藏瓶装的乳的刃天青还原时间太长，以至于在评价储存乳的细菌学腐败变质方面没有任何价值。
[0010]标准方法指出，在任何情况下均不应当就细菌数目报告亚甲基蓝试验亦或刃天青试验的结果。美国公共卫生协会编纂的第13版标准方法的第15章中更详细地描述了这两种染料还原方法”。
[0011]已经存在许多尝试以开发出鉴定细菌物种或确定污染程度的检验法。大多数这类检验法需要样品迅速快递(优选地以冰冷状态)至实验室，在此将样品培养24至48小时(典型地在琼脂平板上）并且通过显微镜检查所产生的培养物以确定存在的细菌量和类型。这类检验法的典型返回时间是3至5日，这个时间太长以至于不能提供对水道中或海滩上污染的充分报警。导致在污染已经过去后仍长久关闭海滩。对食品原料尤其对甲壳类而言完成和报告这类检验法的时间延迟意味着多批产品不得不在发出后召回亦或保持储存5日直至已经接到清晰的检验结果。类似地，家禽和乳产品连同其他产品的冗长细菌学检验产生巨大的经济后果。明显需要快得多然而精确的用于检验细菌存在和类型的系统，这样使得可以迅速处理任何污染地并且可以确定污染源，使得可以采取补救行动。在食品加工厂尤其是这样，但是这也适用于海水养殖场。
[0012]已知通过取得有机体样品，在合适的培养基中培养该样品并且测量在培养后培养物基中有机体的数目，测量微生物(例如大肠型细菌）在环境中的出现。还已知对具体地点(例如泳滩）反复采样以提供感兴趣的有机体当前种群的持续状态的指示。以这种方式，可以基于或多或少连续基础监测该水平。
[0013]已知提供便携式分析装置用于分析化学物质，例如空气中的气体、水中的痕量杂质和油中的金属颗粒。这类装置总体上以低电力要求为特征，允许使用小电池。
[0014]不幸地，用于培养微生物的当前方法要求培养物应当保持恒定温度至少24小时的时间。在该装置没有主电源的地点维持培养物处于恒定温度持续这种长的时间高度依赖于环境温度，其中如果环境温度距离所需培养温度大幅变动，则该装置将需要不可行的电池尺寸以给出所需要的耐久性。额外地，需要一些精确检测微生物计数的方法。
[0015]自从产生能够检验样品中感兴趣的分析物存在的仪器后，已经需要辅助收集和检验样品的容器。因此，已经制造了允许使用者取得样品、将样品带至实验室并随后转移样品至另一个容器以便检验亦或 在检验过程中直接使用该容器的样品容器。虽然，先前开发的这些容器够用，但是这些容器未摆脱它们的问题。此外，已经发现，现存容器经常需要用手过多处置，在采样和检验期间经常需要打开并关闭容器多次，这经常导致将杂质引入样品中并且不必要地让使用者暴露于可能有害的物质和微生物。而且，一旦检验已经完成，经常必须将检验容器及其内容物正确地作为危害废物处置，因为内容物仍可能含有可能有害于人类或环境的物质或微生物。
[0016]可以在以下文件中找到现有检验法的实例：
[0017]【背景技术】
[0018]专利标题/提要
[0019]FR2831182用于培养和监测微生物的生物反应器
[0020]JP10150976用于检测微生物的设备
[0021]JP09159671用于测量衍生自微生物的组分的方法和器材
[0022]US5501959使用刃天青的抗生素和细胞毒药物敏感性测定法
[0023]EP0301699用于确定生物液态混合物的生物活性的方法和设备
[0024]US6597450用于核酸测定法的自动化光读取器
[0025]US4551766 光读取器
[0026]US3504376自动化的化学分析仪
[0027]US6055050光度计和用于其中的测试样品座、方法和系统
[0028]US6395537双容器装置和用于检测并计数样品中微生物的方法[0029]US6653096过程质询装置和方法
[0030]W02004/060766混合分配器
[0031]W02001/069329使用一个或多个多维变量控制工业过程
[0032]US4321322微生物的脉冲伏安检测
[0033]HU0500591检测和计数固态、液态、无形物质中微生物的方法
[0034]US5366873用于检测样品中微生物的装置和方法
[0035]US6197576用于检测微生物的仪器
[0036]US20060285539用于网络上传输已分析数据的系统和方法
[0037]US6465242便携式培养箱
[0038]W02006/123946具有带切割齿的膜开口装置的分配封口
[0039]US4174035双组分容器和包装物
[0040]US4103772具有易碎分区的密封容器 [0041]W02004/085278具有推压型开口的封口
[0042]W02002/074647推压 / 牵拉封口
[0043]W01990/014288具有戳穿容器颈部上盖的穿孔件的用于烧瓶和相似容器的喷嘴
[0044]US4903828用于双组分包装物的瓶封盖
[0045]W00027717用于可释放片剂的释放盖
[0046]GB659553滴剂递送瓶
[0047]DE4139784具有再装填单元的瓶型容器
[0048]NZ540021具有带切割齿的膜开口装置的分配封口
[0049]W098/38104用于保持产品在使用之前分离的包装物
[0050]US6098795用于添加组分至包装物的装置
[0051]W003/106292用于组合粉末与液体的饮料容器
[0052]W099/24806用于确定最佳加权小波变换法的方法
[0053]US4757916允许两种产物分别和同时储存的单元
[0054]US4637934具有集成开口设备的液体容器
[0055]US6059443用于容器中储存并混合两种物质的方法和系统
[0056]US5984141饮料储存和混合装置
[0057]US2005/0218032无菌清洁试剂盒
[0058]CA2176895具有胶化内容物和颜色检验法的检验包。
[0059]CA2199445具有独立辅助剂和钝化剂的检验包。
[0060]DE4139784具有插入式胶囊的生长瓶。
[0061]GB659553通过挤压显示含量的瓶。
[0062]NZ541057混合分配器
[0063]US2004-028608生物学存在的棉拭子测试。
[0064]US2005-218032瓶含有内容物混入第一瓶的第二瓶。
[0065]US4321322通过电传导检测有机体的生长曲线。
[0066]US4406547自动化连续反应分析仪
[0067]US4637934通过内部机构刺穿密封出口的婴儿奶瓶。[0068]US4757916容器在混合时分散两种分离的产物。
[0069]US4903828用于两个组件包的瓶封口。
[0070]US4925789显示微生物的组分
[0071]US5164301通过荧光染料指示微生物。
[0072]US5284772可再密封的检验标本瓶。
[0073]US5393662大肠型检测颜色对比检验。
[0074]US5411867大肠型检测连续颜色检验。
[0075]US5605812借助凝胶板颜色计数的大肠型检测。
[0076]US5610029具有颜色变化的微生物生长培养基。
[0077]US5620865生长培 养基阻抑除肠球菌属之外的细菌。
[0078]US5620895具有多个样品孔的袋。
[0079]US5827675生物发光ATP分析试剂盒。
[0080]US5965453饮料容器混合两种饮料。
[0081]US5984141饮料分配器分配两种饮料。
[0082]US6055050光度计测量来自微生物样品的发光。
[0083]US6059443第二物质在颈部中密封胶囊内的混合容器。
[0084]具有加热器(化学)、生长曲线、光学检测和培养灭活的便携式大肠
[0085]US6060266杆菌培养试剂盒。
[0086]US6465242便携式培养箱_容器具有用于加热器的凹陷。
[0087]US6978212分析物的远程分析和中央报告。
[0088]US6984500具有生长曲线的便携式培养试剂盒。
[0089]W000/27717具有通风道的容器。
[0090]W003/106292婴儿奶瓶_图显示可切割密封。
[0091]W095/23026用于液体样品中定量生物材料的设备和方法
[0092]W098/38104瓶包括具有可破裂胶囊的螺旋盖。
[0093]W099/24086多室柔性容器。各室之间的密封通过操作破坏。
[0094]W02004009756增殖和递送装置
[0095]US5292644用于检测大肠型的快速过程
[0096]US5364766用于快速计数大肠型细菌的培养基
[0097]US5817475自动微生物检验
[0098]US5528363用于瞬时检测和鉴定实体的集成装置
[0099]US5003611用于检测不希望的微生物存在的方法
[0100]US6372485自动化微生物检验设备及其方法
[0101]US6849422用于分析生物样品的抗生素敏感性的系统和方法
[0102]JP3225484微生物检验、微生物数目检验、用于检验微生物的工具
[0103]US6597450用于核酸测定法的自动化光读取器
[0104]US2008/0179331具有带切割齿的膜开口装置的分配封口
[0105]US5728542用于细菌的一次性检验试剂盒设备和方法[0106]US7828141 其内部具有胶囊的容器封口
[0107] 申请人:已经描述了一种新颖的检验机器和方法，所述检验机器和方法基于生长培养基中颜色和透射率的机器可检测变化作为样品起初中存在的微生物的数目的函数，如 申请人:新西兰专利539210中所述。典型地,生长培养基是一种液体,所述液体含有微生物生长促进辅助剂和因微生物作用而还原，由此改变生长培养基的颜色的指示剂，例如刃天青。颜色变化归因于指示剂的变化、该液体中其他化学分子的变化和来自该液体中颗粒(例如有机体或有机体团块）的光反射的变化。浊度可能是影响穿过养基的光的总体透射的因素之一 O
[0108]尽管可以光学地测量有机体生长，如以上专利申请中那样，但是如果样品中存在多于一种有机体，则不可能区分有机体。两个或更多个有机体种群的生长曲线形成一个结果，并且从使用者观点看，观察没有给出哪种有机体占优势或最重要的任何指示。
[0109]在这类情况下，通常需要求助于在琼脂平板上生长并检查以便区分微生物。
[0110]因此，需要针对以下问题的解决方案：追踪一个或多个位置内的微生物种群并从量值预测该微生物的过去和将来种群。
[0111]仍存在以下问题：追踪扩展区域范围内微生物的出现、就出现区域及水平而言检测该种群的进展和预测未来种群。
[0112]此外，如果将在扩展的自然区域内监测一个种群或初期种群，为做到这一点所需的人力付出高昂，涉及在许多位置重复测量。
[0113]将希望提供用于原 位分析微生物并远程报告以允许在远程地点简单检测生物污染或有机体扩散(如在“赤潮”情况下）的便携式装置。然后将可能为不熟练的工作人员提供该装置以携带至野外以便安置在所需位置，提供样品以培养，并且留下来向中央端点报告培养结果。这将允许快速阐明微生物威胁和相对简单地追踪其扩张或收缩的面积。
[0114]这种快速部署和结果的返回允许创造在许多食品原料供应情况下提供针对生物污染响应的方法。
[0115]下文列出许多这类应用。全部这些均是可以在自然集水区或系列集水区内存在的产业或服务业。
[0116]可以通过鉴定生物污染可能发生的每个食品原料供应或生产阶段并且在这些阶段提供检验，按相同方式看待每种产业或服务业。例如对于乳牛场，挤乳过程、运输、加工、分销和供应链均提供污染机会。如同巨大自然集水区内的水流经景观，可能在其途中变质那样，所以从农场至顾客的乳面临相似生物学挑战。
[0117]在每种况下，食品的集水区相互联系并受人类干预影响。在以下的每种供应服务业中，鉴定可能的污染点。在这些点的每一处，可以进行污染检验。
[0118]I.农业
[0119]?畜牧供水(废水污染）
[0120]?环境废水管理
[0121]·灌溉系统
[0122]?家禽和禽蛋生产
[0123]·马产业
[0124]2.乳品业[0125]?养殖场上水质(检查上游污染）
[0126]?乳品生产(冲洗）
[0127]·奶油检验/颜色检验
[0128]?排放流检验
[0129]·罐车抽样检验
[0130]·生产线检验(奶粉、黄油、奶油）
[0131]?无菌检验(例如蜜胺）
[0132]3.园艺
[0133]?灌溉系统（内部、外部）
[0134]?水培系统
[0135]?农产品清洁和系统
[0136]·喷撒承包商
[0137]·防霜冻系统
[0138]4.水产养殖
[0139]?鱼类和虾蟹养殖场水质
[0140]·鱼类和虾蟹类加工厂
[0141]?水产管理
[0142]·鱼饲料制造商
[0143]·从水道释至海洋
[0144]5.招待
[0145]·商业保洁
[0146]·饮食服务
[0147]·快餐
[0148]·餐厅管理
[0149]·酒店
[0150]6.应急管理
[0151]·商业和居民区洪水维护和恢复
[0152]·应急服务车辆(饮用水储存）
[0153]?有害物质管理和控制
[0154]?野外医院供应
[0155]?流行病和疾病管理
[0156]7.旅行
[0157]?假日公园、营地
[0158]?水供应-井、河流
[0159]?健康度假-日间水疗
[0160]?游轮：供应、储藏、制备和递送
[0161]·空运：供应、储藏、制备和递送
[0162]·铁路旅行：供应、储藏、制备和递送
[0163]?海运：供应、储藏、制备和递送[0164]8.工业、商业、住宅责任调查
[0165]?水质检验
[0166]?食品安全检验
[0167]?保险咨询和责任
[0168]?风险管理咨询
[0169]·污染源/集水区事务调查
[0170]9.基础设施
[0171]?水检验实验室
[0172]?含水层
[0173]·储水罐和管道建设/清洁
[0174]?商业和家用钻井服务
[0175]·渗滤液检验：污染的垃圾填埋点、堆碴场、再循环中心、建筑场地和侵蚀场地
[0176]·实验室检验：全部水样和液态洗液
[0177]·排水检验：污染/渗滤
`[0178]?废水处理厂，包括处置和扩展
[0179]?水再循环和净化厂
[0180]·乡村和城镇饮用水供应检验
[0181]·乡村和城镇娱乐/环境用水检验
[0182]10.商业
[0183]·瓶装水厂，包括通风机
[0184]?无菌包装专用设备
[0185]·水冷却器：制造/维护/耗材
[0186]·水过滤和净化：初始检验、单元维护和耗材
[0187]·空调冷却塔：器材测试和性能测试
[0188]·罐头食品厂
[0189]·面包房
[0190]·软饮料、果汁、葡萄园、酿酒厂
[0191]·房屋和建筑监察机构
[0192]?化学品制造商
[0193]·制冰商
[0194]?冰箱和冷却储藏维持
[0195]?食品机械制造和维护
[0196]·肉类和农产品腌制和保存
[0197]·商业喷水清理/化学清洗
[0198]?商业洗衣店(泰国新西兰女子死亡案例）
[0199]·制管商、衬砌和清洁承包商
[0200]·水暖承包商
[0201]·医学和卫生保健门诊
[0202]·敬老院和养老院[0203]·安全设备和产品储存
[0204]·清洁卫生服务
[0205]·水疗池清洁剂和维护
[0206]·泳池维护
[0207]11.娱乐
[0208]·船舶：个人用和租赁-储存并从储罐递送水 [0209]· RV :个人用和租赁-储存并从储罐递送水
[0210]·淡水娱乐场所检验，包括水道、河流、湖泊、池塘、泉眼和公共游泳池
[0211]·海水娱乐场所检验,包括海滩、河口和水道
[0212]12.辅助项目
[0213]·现场评价饮用水品质
[0214]·现场饮用水处理和储存系统的性能监测
[0215]·用于化学投药的数据供给：远程供水
[0216]13.军事应用
[0217]·现场评价饮用水品质(细菌和其他）
[0218]·现场饮用水处理和储存系统的性能
[0219]·用于化学投药的数据供给-远程给水设施
[0220]·食堂和厨房管理
[0221]?野外厨房管理
[0222]14.教育
[0223]·校园游泳池
[0224]·校园厨房和餐食服务区
[0225]·对社区内学校基于课程的研究-环境和居民供水应监测
[0226]15.职业体育和文化团体
[0227]·事件管理期间的饮用水和液体监测
[0228]·基于马拉埃的事件(水质问题）
[0229]16.医学
[0230]·尿路感染
[0231]·针对稳定结果的流体监测
[0232]17.管理机关
[0233]·本地、地区、中央政府机关健康和质量标准监督
[0234]18.滑雪产业
[0235]·基于水和食品
[0236]?造雪操作。
[0237]这些环境中每种均需要在延误尽可能少情况下提供污染检验结果的一些方法。因此，需要下述问题的解决方案：怎样提供一种自持式微生物分析装置，该装置依赖实际电池电力供应将培养样品持续仅足以提供可靠结果的长时间并且向远端点报告该结果。
[0238]因此，需要具有以下一个或多个特征的改良检验容器：减少采样或检验期间将杂质引入该容器中的可能、减少容器内容物将在采样或检验期间或在采样或检验完成后对人类和环境造成损害的可能，更可靠，制造成本更低、具有更少部件、更易使用、和更可靠。
[0239]本发明为这个问题和其他问题提供一种解决方案，所述解决方案提供胜过现有技术的优点或将至少为公众提供一种有用选项。
[0240]承认在不同司法权下，术语“包含(comprise)”可以被赋予排他性亦或包含性意思。出于本说明书的目的，并且除非另外指出，否则术语“包含(comprise)”应当具有包含性意思-即它将意指不仅包含列出它直接所指的组分，还包含其他未指定的组分或要素。当术语“包含(comprised)”或“包含着(comprising)”相对于方法或过程中的一个或多个步骤使用时，该原理也将适用。
[0241]在本说明书内，提到色“频”和色“频带”。对“频”的称谓将是具体颜色的光的总体频率，并且对“频带”的称谓是光在某个频率范围内延伸但具有一种一般颜色。
[0242]全部参考文献，包括本说明书中援引的任何专利或专利申请，均通过引用结合在此。绝不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论部分宣称了其作者的断言，并且 申请人:保留权利对所引用文件的精确性和关联性提出异议的权利。将清楚地理解，虽然在此提到的许多现有技术出版物；但是这些参考文献不构成承认这些文件的任一者在新西兰或在任何其他国家形成本领域公知常识的部分。
[0243]发明目标
[0244]本发明的一个目标是提供一种用于辅助使用者收集并检验环境样品的检验方法，所述检验方法改善已知现有技术的一些缺点和局限性或至少为公众提供一种有用选项。
[0245]本发明的又一个目标是提供一种自动进行环境样品检验并且以下述可能性报告它们的方法:整理持续不断的结果以产生来自环境的任何威胁的指示。
[0246]本发明的又一个目的是为这个问题和其他问题提供一种解决方案，所述解决方案提供胜过现有技术的优点或将至少为公众提供一种有用选项。
【发明内容】
[0247]在第一方面，本发明提供一种便携式微生物检测设备，所述设备包括:
[0248]培养箱，其至少部分包围能够接纳基本上透明的刚性流体容器的容器接收空间，所述容器具有穿过所述容器的至少一条光路
[0249]安装在培养箱上或其中的能够传输光至所述流体容器中的至少一个光源
[0250]至少一个光传感器，其安装在所述培养箱上或其中并且能够检测至少一种颜色的光，所述光已经从所述至少一个光源穿过至少部分的流体
[0251]在非瞬态介质上存储的校准信息，所述校准信息关于在含有鉴定的已知微生物样品的相似容器中所测量的随时间推移的光变化
[0252]连接至或安装在所述培养箱上以提供所述样品在何处取得的位置数据的位置检测工具
[0253]微处理器，能够控制培养箱和一个或多个光源和一个和多个光传感器的运行并且比较、分析和存储结果并且接收来自位置检测工具的位置数据
[0254]在非瞬态介质上存储的校准信息，所述校准信息关于在含有鉴定的已知微生物样品的相似容器中所测量的随时间推移的光变化
[0255]具有比较器的微处理器，所述比较器能够检测随时间推移因在所述培养箱中孵育的基本上透明的刚性流体容器中样品所致的变化，并且将所述变化与存储的校准信息比较以确定具体微生物的存在或不存在
[0256]存储比较结果及来自位置检测工具的日期和时戳及位置信息的数据记录器。
[0257]优选地，该培养箱具有发送结果至基站的发射器。
[0258]在另一个方面，本发明提供一种通过下方式从其中浸没了可能含有微生物的样品的生长培养基的颜色变化检测微生物的方法:将来自一个位置的样品密封于基本上透明的刚性流体容器中，所述流体容器具有穿过容器的至少一条光路；将该容器置于培养箱中，随时间推移从安装在培养箱上或其中的至少一个光源传输光至该流体容器中；通过安装在该培养箱上或其中的至少一个光传感器检测至少一种颜色的光，所述光已经从至少一个光源穿过至少部分的流体；从所述至少一个光传感器发送数据至具有比较器的微处理器，所述比较器通过以下方式分析随时间推移因在培养箱内正在孵育的基本上透明的刚性流体容器中样品所致的光变化以确定至少一种特定微生物的存在或不存在:将检测到的光变化与存储的校准信息比较；并且将样品的比较结果连同这份样品的位置信息和日期和时戳存储于数据记录器中。
[0259]优选地，将结果传输至基站并存储于数据库中。
[0260]优选地，分析多份样品并将结果传输至基站用于通过计算机分析。
[0261]优选地，评估样品内部一种或多种微生物随时间推移的生长速率以计数在所述位置处检测到的一种或多种微生物的数目。
[0262]优选地，该计算机从每份样品的样品数据和位置与日期时戳分析微生物空间种群的出现或扩散或衰落。
[0263]优选地，随时间推移的生长速率针对不同微生物的存储校准信息进行匹配以确定最接近的匹配。
[0264]优选地，该生长培养基对大肠杆菌进行优化。
[0265]优选地，该生长培养基含有乳糖、酪胨、NaCl, KC1、CaCl2、和MgCl2作为生长辅助剂。
[0266]在另外一个方面，本发明提供一种通过下方式从其中浸没了可能含有微生物的样品的标准化生长培养基(其含有一种或多种指示剂染料)的颜色变化检测微生物的方法:将来自一个位置的样品密封于基本上透明的刚性流体容器中，所述流体容器具有穿过容器的至少一条光路；将该容器置于培养箱中，随时间推移从安装在培养箱上或其中的至少一个光源传输光至该流体容器中；通过安装在该培养箱上或其中的至少一个光传感器检测至少一种颜色的光，所述光已经从至少一个光源穿过至少部分的流体；从所述至少一个光传感器发送数据至具有比较器的微处理器，所述比较器通过以下方式分析随时间推移因在培养箱内正在孵育的基本上透明的刚性流体容器中样品所致的光变化以确定最接近的匹配或多个匹配并报告不同微生物的存在或不存在:将检测到的光变化与存储的存储的不同微生物校准信息比较，所述校准信息已经通过在具有相同量和类型的生长培养基以及相同类型指示剂染料的相同类型容器中孵育已知的微生物而校准过。
[0267]优选地，分析样品的结果连同这份样品的位置信息和日期及时戳一起存储于数据记录器中。
[0268]优选地，将结果传输至基站并存储于数据库中。[0269]优选地，分析多份样品并将结果传输至基站用于通过计算机分析。
[0270]优选地，评估样品内部一种或多种微生物随时间推移的生长速率以计数在所述位置处检测到的一种或多种微生物的数目。
[0271]优选地，该计算机从每份样品的样品数据和位置与日期时戳分析微生物空间种群的出现或扩散或衰落。
[0272]优选地，生长培养基含有乳糖和生长辅助剂。
[0273]仍在另外一个方面，本发明提供一种从其中浸没了可能含有微生物的样品的生长培养基的颜色变化检测并计数微生物，记录这些微生物在已知位置计数，从这种计数结果追踪微生物的空间种群出现和扩散或衰落的方法，所述方法特征在于生长培养基最初密封于样品沉积在其中的容器内部、在于将生长培养基释放至样品中、在于至少随时间光学地监测生长培养基的透明性和在于报告取决于样品内部有机体消逝的生长速率的至少一种微生物的计数结果用于在远程位置进行记录。
[0274]优选地，对至少一种色频带监测透明性。
[0275]优选地，对若干色频带分别监测透明性。
[0276]优选地除透明性之外还监测浊度。
[0277]优选地，这种消逝的生长速率针对不同微生物的消逝生长速率匹配以确定最接近的匹配。
[0278]优选地，通过以下方式进行比较:用时间归一化样品透明性的记录并将归一化的记录与相同物理条件下相同生长培养基中的已知微生物的那些记录进行比较。
[0279]优选地，如果不存在针对任一种微生物的匹配，则将消逝的生长速率针对该份样品内部的多种微生物进行匹配。
[0280]优选地，密封于容器中的生长培养基对具体微生物进行优化。
[0281 ] 优选地，该生长培养基对大肠杆菌进行优化。
[0282]优选地，该生长培养基含有乳糖、酪胨、似(:1、1((:1工&(:12和1%(:12作为生长辅助剂。
[0283]优选地，酪胨以体积计0.1%和1%之间的浓度存在。
[0284]优选地，乳糖以体积计0.5%和10%之间的浓度存在。
[0285]优选地，生长培养基含有胆盐作为其他非特异性微生物的抑制剂。
[0286]优选地，生长培养基含有氧化还原染料指示剂。
[0287]在另一个方面，本发明涉及一种微生物计数器，它包括:
[0288]容器，其包含以隔离方式密封于该容器内部的用于至少一种微生物的生长培养基
[0289]允许插入可能含有微生物的样品的可关闭容器开口
[0290]允许释放密封的生长培养基至容器内部的样品中的释放结构
[0291]用于该容器的培养箱，所述培养箱维持该容器和内容物处于希望的温度
[0292]该培养箱包括光源和与监视器连接的至少一个光传感器，所述监视器至少连续测量容器内部样品和生长培养基的透明性
[0293]至少记录样品和生长培养基随时间的透明性的培养箱记录仪
[0294]培养箱透明性匹配比较器，所述比较器将样品和生长培养基的透明性随时间的变化与这类可能变化的数据库比较并且抽取最可能的匹配
[0295]向远处位置报告最可能匹配的培养箱报告器。[0296]优选地，该容器还包括密封的杀生物剂，所述杀生物剂可释放至样品和生长培养基内。
[0297]优选地，手工实现释放。
[0298]优选地，样品透明性由穿过该容器的光来测量。
[0299]优选地,光源于培养箱内并且由培养箱中的光传感器检测到。
[0300]优选地，测量样品透明性并将其对单一光色进行比较。
[0301]优选地，测量样品透明性并将其对多种光色进行比较。
[0302]优选地，额外测量并比较样品浊度。
[0303]优选地,容器可以含有用于选择性生长单一微生物属或物种的生长培养基。
[0304]优选地，容器可以含有用于选择性抑制一个或多个微生物属或物种生长的生长培养基。
[0305]优选地，容器生长培养基在靶向特异性微生物的全部容器之间是标准的。
[0306]优选地，培养箱报告器可以含有报告可能匹配的无线电发射器。
[0307]优选地，培养箱无线电发射器是移动电话。
[0308]优选地，就至少一份样品生长周期的电源而言，该培养箱是便携和自持式的。
[0309]优选地，该容器在与培养箱光源相邻和相对的至少那些区域内是透明的。
[0310]优选地，该容器额外地在水平垂直于培养箱光源的那些区域内是透明的。
[0311 ] 优选地，培养箱包括允许自我鉴定该单元位置的GPS接收器。
[0312]在本说明书中，我们已经提及“位置检测系统”或“位置检测工具”。在目前实现这种检测的最实用方式是使用GPS芯片(一种芯片组，其访问全球定位卫星系统以便基于来自卫星的三角测量提供位置的坐标)。这种芯片可以是接至微处理器的现货GPS接收器，或它可以是形成该微处理器的部分的芯片组。
[0313]可替代地，可以使用其他位置检测系统。例如，该便携式培养箱可以包括显示器和一组储存的地图，并且它可以允许操作员依照培养箱中存储的地图手工切入该位置，或该培养箱可以包括具体采样地点的坐标，所述采样地点已经预定并且已经在该地图上鉴定或以一些其他方式鉴定，这样使得操作员然后可以从这个具体预定义位置取得样品并且通过适合地参考样品位置的样品编号鉴定该样品。
[0314]优选地，培养箱允许输入所希望的地理参照位置。
[0315]优选地，这种地理参照位置可以远程输入。
[0316]在另外一个实施例中，本发明涉及通过以下方式累加并显示在一个自然区域内部分析特定微生物的结果的方法:在该区域内部提供多个微生物分析单元，在微生物分析单元中培养来自该自然区域内部已知位置的样品，远离该自然区域提供能够从分析单元接收结果的中央位置，在该中央位置从远程分析单元接收分析结果和分析样品的位置，基于微生物计数对比时间在自然区域的地图上显示结果，从时间/计数逆转鉴定该区域的一个亚区域作为微生物增加的假定来源，至少将分析单元再放置于所鉴定的亚区域内部的多个位置并且重复该方法直至证实假定来源。
[0317]优选地，远程分析单元是如上文所提及的单元。
[0318]优选地，鉴定亚区域的步骤包括影响特定微生物转移和增殖的自然因素作为输入。[0319]优选地，假定来源的鉴定可以包括以下步骤:向远程分析单元提供所选择的远程分析单元的新位置。
[0320]优选地，每个远程分析单元包括GPS位置鉴定装置和鉴定通向新位置的途径的音频和视频输出。
[0321]优选地，从该分析单元接收的结果包括样品收集时间。
[0322]优选地，随时间推移从相同位置收集多份样品，并且该方法包括比较在不同时间来自相同位置的信息以测量在特定位置出现随时间的变化。
[0323]优选地，这比较揭示细菌在多个位置在指定地区内随时间推移的出现。
[0324]优选地，将生长趋势以空间和时间为单位绘制在地图上。
[0325]优选地，生长趋势包括预测种群的输出。
[0326]在另一个方面，本发明提供一种通过以下方式追踪细菌出现的方法:
[0327]a)在相关地理位置取得样品并且储存该地理位置的机读取身份证明(machinereadable identification)和每份样品收集的时间，
[0328]b)分析样品以获得关于样品中特定细菌的存在、不存在或其出现水平的信息，
[0329]c)以机读形式传输关于每份样品和其位置的信息至数据库
[0330]d)比较关于每个位置处细菌的数据库信息以鉴定某地理区域内的细菌种群。
[0331]优选地,每个单元包括能够存储样品收集时GPS坐标的GPS组件。
[0332]优选地，设定每个单元以存储取得该样品的人的身份证明。
[0333]优选地，每个单元利用标准化的种群生长试验，其中将样品分别在每个单元中限定的样品容器内的标准化营养液中生长(其中该单元充当培养箱和光记录装置以检测检验下的样品内部光透射和反射的变化并且与已知种群的参比样品进行比较，所述参比样品的数据存储于每个单元中。
[0334]优选地，通过数据流的无线电传送传输信息。
[0335]在另外一个实施例中，本发明在于便携式分析装置，所述分析装置能够接纳含有培养基的至少部分透明的培养容器并包括:能够维持培养基处于指定温度的培养基温度控制器；光透射率测量手段，所述测量手段能够测量培养容器和培养基的光透射率并检测指示培养物中至少一种微生物生长的透射率变化；数据记录器，所述记录器存储代表检测到的变化的数据；传输记录器数据至远程位置的发射器；和电源，所述电源能够对该装置供电至其中存在显著水平的待检测微生物的所希望的培养终点或持续这样的时间，所述时间超过为达到其中微生物不存在的水平所需要的时间。
[0336]优选地，该便携式分析装置包括位置检测系统。
[0337]优选地，该位置检测系统是全球定位系统接收器。
[0338]优选地，传输记录器数据的发射器是GPRS、CDMA或其他移动电话协议传输。
[0339]优选地，在穿过培养基的至少两条途径范围内测量光透射率。
[0340]优选地，还测量培养基的反射。
[0341 ] 优选地，便携式分析装置具有可拆卸电池组。
[0342]优选地，培养容器含于绝缘环境下的该装置内部。
[0343]优选地，培养容器可以在该环境下加热或冷却。
[0344]在一个替代实施例中，本发明在于一种在便携式分析装置中培养微生物的方法，所述方法包括将样品、培养基和微生物生长指示剂置入至少部分透明的培养容器中，将该容器置入能够维持该容器处于基本上恒定温度的便携式装置中，在至少一个光波长测量培养基的光透射率，从透射率的变化中检测希望检测的微生物的存在或不存在，储存关于该微生物存在或不存的信息，向远端点报告存储的信息并且从内部电源向便携式分析装置供电，所述内部电源能够对该装置供电至微生物检测终点。
【专利附图】
【附图说明】
[0345]图1是环境中多种微生物测量站设置的简图；
[0346]图2是更大地区和检测初始有机体种群的简图；
[0347]图3是与图2相同的地区的简图，该显示与参考图2描述的检测相对应，布置额外的测量站或采样站；
[0348]图4是便携式分析装置的孵育和分析模块的顶部的总体透视图；
[0349]图5是图4的顶部的俯视图，孵育室盖移除；
[0350]图6是携式分析装置的供电和通讯模块的透视图；
[0351]图7是供电和通讯模块的上透视图，罩取下；
[0352]图8是供电和通讯模块的底视图，罩取下；
[0353]图9是装配的模块的正视图，罩取下；
[0354]图10是装配的模块的左侧视图，罩取下；
[0355]图11是孵育模块的内在部分的放大视图；
[0356]图12是一个分析过程的流程图；
[0357]图13是多种不同生物的生长曲线的图；
[0358]图14是来自多个样品平板的许多生长曲线；
[0359]图15是在单一光频率处匹配单种或多种有机体的生长曲线的过程的流程图；
[0360]图16是在透射光所致的多色时单种有机体的生长曲线；
[0361]图17是在反射光所致的多色时第二单种有机体的生长曲线；
[0362]图18是图16和图17的一些曲线的微分；
[0363]图19是通过利用生长曲线拐点检测有机体的流程图；
[0364]图20是根据本发明形成的容器的一个实施例的前正视图，所示的容器被包在保护罩内并且在混合之前；
[0365]图21是图20的容器的放大剖视图,截面切口(cross-sectional cut)穿过容器的中线垂直取得并且为清晰起见在移走保护罩的情况下显示；
[0366]图22是图20容器的装配的剖视图；
[0367]图23是在样品收集件已经从容器移走后显示的用来收集样品并返回该容器的图22容器的前正视图；
[0368]图24是在第一屏障已经受损，从而允许液体与试剂添加物和样品混合后显示的图22容器的前正视图；
[0369]图25是在检验设备中检验容器内容物期间显示的图22容器的前正视图；并且
[0370]图26是在第二屏障已经受损，从而允许预防性添加物与容器内容物混合后显示的图22容器的前正视图；[0371]图27显示包括易腐败食品原料供应链中主要污染点的简图；
[0372]图28显示从环境检验结果的变化预测威胁的过程的流程图。
[0373]本发明的所示实施例总体上涉及在辅助使用者收集和/或检验样品时使用的样品检验各器。
【具体实施方式】
[0374]现在参考图1，该图显示从河流105、106输入并通过河口 102与海滨103连接的河口湖101。草地107和树104均包围它们。便携式分析单元108至117遍及该区域定位。当要求测量特定微生物的当前计数时，这些单元使得来自局部环境的样品和容器内的培养基辅助剂一起置于它们之中。这些单元将样品培养至其中完成所希望的微生物生长的测量亦或未发现生长的点，并且它们然后向远程中央位置报告生长曲线，典型地通过嵌入式移动电话模块报告。
[0375]这些单元可以再装填并定期(例如每周)读取，并且因此可以随时间推移提供微生物数目的量值。
[0376]读取将随时间、温度等波动，但是可以例如见到靶微生物的持续来源源自位点112。
[0377]将来自分析单元的读数输入数据库，典型地在远程中央位置，并且然后可以与环境因素相关以允许靶微生物来源预的确定和它持续扩大或收缩的预测。因此，在所示的实例中，该河流下游的水流应当被认为是先前、当前和预期降水的函数，河口湖中和离开河口湖的潮汐流量是已知的，沿岸的水流是已知的并且追踪每日风向，历史(预期)风向是已知的，追踪每日温度，历史(预期)温度是已知的，预报温度、风和降水是已知的。在所选择位置处的初始作图仅提供微生物来源的暂时鉴定，并且为了鉴定具体微生物的精确来源，以接收的数据为基础的反向预测可以用来指示主区域内部的亚区域，其中应当将分析单元移动至所示亚区域用于更好地分辨来源。
[0378]图2和3是显示新西兰奥克兰怀特玛塔港的部分的真实地图。全部地名是真实地名以辅助解释本发明。
[0379]图2显示更简单地隔离污染性微生物的来源，该来源首次在示为201的传教士湾处检测到，该海湾是流行的浴场并且受来自怀特玛塔港的河口集水区的落潮冲刷。建立其他监测点202 (Pipemea (派普马))和203 (Bastion(巴斯申)点)作为原始总区域内部的亚区域并且在那里也检测到有机体。
[0380]图3显示该来源的另外连续追踪,如显示在Hobson Point (霍布森点)码头(301)处的污染、在海岸路点(Shore Road point) (302)和Orakei (奥拉基)车站浅滩(303)处的一些污染，但是在怀阿塔鲁溪(Waitarua Creek)排水口(304)处污染更多。通过持续再确定疑似区域沿河流向上后续采样，将来源隔离至怀阿塔鲁路向河流的通入点。
[0381]正常地，这类定位是一个缓慢过程，因为获得样品培养结果典型地耗时约14小时。使用新西兰专利539210的设备，结果可以在2小时内获得，大幅度减少为定位微生物行进所耗费的时间并且允许培养一份样品，同时将培养该样品的设备移至将取得下一份样品的位置。
[0382]为最佳利用这种快速分析，每个单元具有内建的GPS单元。这具有两个优点。首先，可以将每个单元的位置的精确地理参考自动告知远程中央位置，并且其次，每种装置可以从中央位置就其下一个优选的位置进行远程编程。重置功能允许显示器运行典型的GPS路径方向视频显示辅以音频伴奏，以允许将远程单元搬运者导引至下一个位置。
[0383]现在参考图4，该图显示孵育模块400，所述孵育模块包括耐候罩401、显示任何分析的当前状态的LCD可视板402、触敏键区403和图5中更好地可见的用于孵育室的盖404。盖404具有与模块本体顶部上的位置与转动挡块406相互啮合的凹陷405和与孵育室周界周围的插槽408相互啮合的小块407。尽管显示触敏键区，但是耐候罩也可以同等地具有可移动部分，从而可触及对一些使用者而言可能为优选的下折式键盘。
[0384]可以将盖404降低就位并通过转动固定以随孵育室顶部一起形成耐候密封，所述孵育室顶部将含有标准化的透明容器，所述透明容器具有含有来自环境的样品的标准化分析物。可以在该盖上方放置一个罩(未显示)以提供额外的天气防护作用。
[0385]在模块的基板412上是向孵育模块供给电力和输出连接的连接器409和带有释放清洗器411的定位和锁定凸起410，所述释放清洗器与供电和通讯模块紧密配合。
[0386]图5显示孵育模块的俯视图，移除盖以显示可拆溢流桶501，所述可拆溢流桶在图12中更好地可见，具有培养基容器可以坐落于其上的接合点502和允许空气经溢流桶循环并且还为微生物检测光学提供小口的插槽503。这些小口不延伸至桶底部，这样使得在不污染该模块剩余部分的情况下，捕获来自培养基容器的溢流。
[0387]图6显示供电和通讯模块600的外观，所述模块是从培养箱的剩余部分可拆下的并且具有耐候罩601、与培养箱模块的连接器409紧密配合的连接器602、顶板604、在顶板604中与孵育模块上的凸起410紧密配合的定位孔603和通过按钮605致动的用于释放板606的释放机构(图7)。
[0388]图7显示相同模块，盖601和顶板604移除以显示电池701、模块化GPS接收器、数据记录器和可以利用集成移动电话单元与远端点通讯的通讯单元702和安装有电池和连接器602的连接器面板703。夹在连接器面板703和释放板606之间的是用于培养箱模块的停留与释放机构，它由使滑动板606抵住凸起410偏斜以捕获释放清洗器411的弹簧定位板704和弹簧706组成。压下按钮605允许孵育模块从供电和通讯模块释放。
[0389]图8显示其中电池701包围中央配合孔603的供电和通讯模块的基本视图。
[0390]图9和图10分别显示在罩被移走情况下两个配合模块的前视图和侧视图。值得注意的是加热器单元901和902，它们穿过塑料机匣907塑料安装至内部铝管501。还显示两块电路板903、904。这些电路板分别安装有光源和传感器，它们与机匣907中的孔和包围中央腔的铝管中的间隙协作，这样使得光可以是传输至样品中并穿过样品，其中所述样品在中央腔内的基本上透明的容器中培养。
[0391]图10的侧视图显示前电路板和后电路板905和1006，这些电路板携带光传感器、904和主处理电路，所述光传感器用于检测来自侧电路板904上光源LED的光的散射，所述主处理电路用于在不同波长检测光遮蔽和散射的趋势并使散射匹配于一种或多种有机体。
[0392]LED光源可以在不同光波长(例如白、红、绿、黄和红外波长)运行。每种传感器可以被过滤以仅响应于受限的波段。
[0393]带形电缆1002互连这些电路板，包括携带触敏键盘和IXD显示器102的电路板。
[0394]图11显示核芯组件的放大视图，溢流桶501具有接合点502和插槽503以允许光从LED通过抵达传感器。该桶含于铝管1101内部，所述铝管具有孔1102、1103，以便光从光源抵达传感器。加热器901附接至座1104以提供遍及铝管1101的热分布。管1101起到维持均匀温度遍及中央腔的作用，而机匣907起到使该腔与环境隔绝的作用。
[0395]尽管该实例显示加热器，然而同等可能的是在环境温度预期超过所需要孵育温度的情况下，还提供拍尔帖效应(Peltier effect)冷却装置。
[0396]图12显示在分析或计数样品时所遵循的过程。一旦样品就位并且分析以步骤1201启动，则使用嵌入式移动电话模块1203和从1204处的GPS模块获得的位置在202处进行初始位置报告。
[0397]GPS不需要在全部时间开启并且正常情况下将仅在分析开始和结束时开启，以便为最终报告提供初始位置和证实位置，然而它可以按常规间隔时间打开，这样使得模块的所希望的位置的任何变化可以从中央位置远程下载并且用来提示孵育模块的位置中的转移。
[0398]位置报告的结果在1205处取得并存储在1206，正常情况下使用闪存RAM (随机存取存储器)以保留数据。在步骤1205处还打开照明用LED并且在要求的波长取得样品透射率或透明性和反射率的读数。在1207处，确定样品是否已经达到终点并且鉴定原始样品中存在的微生物的水平。如果这样，则最终结果存储在1208，在1211处经由来自模块1203的远程通讯报告并然后整个装置在1212关闭。
[0399]如果未检测到终点，在1209处检查以便确定在其范围内可能预期某种结果的最长可能时间是否失效，并且如果是这样，则将空结果(nil result)存储于1210处并且再次存储最终报告，并且发生关闭。
[0400]在这些检查后，检查样品室中的温度并且如果在1213处，发现温度太低，则在1216处开启加热器601、602。类似地，如果在1214处发现温度太高，则在1215关闭加热器，并且然后重复测量循环，典型地以大致一分钟的间隔时间重复以保留电力。
[0401]在使用中，将样品置于透明样品容器中并且将含有微生物敏感指示组分的培养基是添加至样品并搅拌。典型地在培养基达到足够水平的靶微生物浓度时，指示组分改变颜色。这种组分是刃天青，但是其他组分是熟知的。
[0402]随后将样品置于孵育和供电/通讯模块组件中，并且键盘和IXD显示器用来选择需要的时间/温度程序，所述程序对待检测的微生物是特异的。键盘随后用来启动分析，此时如果需要，可以摒弃该单元。该单元经编程以经由无线电或移动电话链路报告，给出如通过GPS取回那样给出其位置和其当前环境。这种信息可以自动输入远程数据库以允许未来验证该单元。
[0403]在透明性、光透射率或浊度作为生长速率消逝的指示方面，来自培养基内部微生物的持续发育或其他方面的数据被记录至合并数据记录器并且两类事件之一最终发生。或者将不存在生长培养基指示剂的可察觉变化，这表明微生物不存在于样品中，或将存在样品颜色、透射率或反射率的变化，这可以解读作存在一种或多种微生物的量值。当变化达到所希望的终点时，分析单元告知通讯模块，所述通讯模块将发送记录器数据和它正在关闭进入睡眠模式的指示。在后一种情况下，如果需要，对嵌入式移动电话号码的移动电话呼叫将允许唤醒并远程控制该单元。
[0404]因为光波段传感方法比确定特定类型微生物存在的任何其他已知方法更早给出结果，所以可行的是，远离任何电源提供电池供电的装置，所述电源由相对不熟练的人员可用，因为要求的全部事情是应当将样品正确装入该装置中并且该装置应当正确初始化。
[0405]尽管显示的形式不是防水的，然而可能例如提供具由太阳能电池为电池充电的自由漂浮形式，它将自动吸入一部分该自由漂浮形式在其中漂浮的介质至培养基中，孵育该介质到期并且然后在其位置上载入培养物时提供结果，这样使得在水流或潮汐驱动的位置提供对感兴趣的微生物的继续记录。对于持续结果，每份完成的样品和培养试验可以通过以下来终结:将杀生物剂投入培养基、从培养室冲洗出该培养基、用水冲洗清洁该室并且然后在该室内安置更多培养基并装入样品。
[0406]尽管所示形式的装置相对大，因为它意在说明手工容易操作的样品容器，但是使样品、样品支架和孵育装置微型化，例如通过使用纳米蚀刻能力微型化是可行的。这转而导致缩减所需要的电池的尺寸，因为必须加热或冷却更小体积，从而导致总装置尺寸的明显缩减。
[0407]图13显示测量不同微生物在样品容器内部的液体培养基中的生长曲线。典型地，培养基含有刃天青作为指示剂并且在37°C温度孵育。通过孵育模块以5分钟间隔测量从穿越培养基的直接路径反射的光和/或培养基的颜色透射率，并且将吸收或颜色作图直至变化似乎有限。如图13中所示，这种情况是在215个5分钟循环或约18小时后。用于所示曲线的具体光带宽是白光，并且有效地是下述光的量的量度，其中以相对于穿过培养基的光路的一个角度检测到所述光。这种因来自培养基中颗粒的反射而分散，所述颗粒可以至少部分地是正在检测的有机体。
[0408]该图显示多种有机体(例如大肠杆菌菌株0111、0117、2091、2250)和其他微生物(例如阪崎肠杆菌)的叠加生长曲线和对照曲线，例如不添加微生物的培养基，如“WC培养基”的对照曲线。应当指出，尽管这些生物中许多在所示曲线中使用的具体生长培养基或辅助剂中或在所用光的具体频率全部亦或大多不以可检测方式反应，但是其他生物提供了非常特异的生长曲线。
[0409]在图13中，培养基(WC培养基)的生长曲线单独作为总体缓慢往上趋向的线显示，所述曲线在37°C约16小时后达到峰值并然后随着溶液老化而缓慢下降。光学测量过程的变动在测量过程中产生某个量的“噪声”。
[0410]大肠杆菌从下述时间起产生培养基颜色的快速变化，所述时间依赖于培养基中有机体的初始计数，但是在显示的实例中是约4小时以后。培养基然后缓慢澄清直至它在14小时标记后稳定。不同大肠杆菌显示非常相似的曲线，大肠杆菌2091，例如，起初显示相似的曲线，但是在初始生长骤增后展示培养基颜色的稳定性平台期，之后再次继续浊度的常规变化。大肠杆菌0111还显示稍晚开始，但是在此，初始缓慢变化后是一个更快速变化的时期，之后缓慢衰落。相反，阪崎肠杆菌显示接近于大肠杆菌的初始梯度，之后显示明显向上的梯度并且然后显示最终向下的曲线。
[0411]众多微生物在所示的培养基中和所示光频带中不显示具体反应，但是这些微生物在其他培养基中、在其他温度和在不同的光频带显示不同的生长模式。差异是足够，可以说存在将允许几乎区分任何微生物与任何其他微生物的一些培养基、温度和光频带。
[0412]图14显示如从一台70小室板读数仪累加的生长曲线，将所述生长曲线以5分钟间隔取得并压缩，这样使得将生长曲线(例如图1中那些生长曲线之一)压缩入单个小室。这些曲线显示下述培养基的实例，所述培养基已经稀释到其中单个平板小室可能含有或可能不含有单种有机体并且非常不可能含有多于两种有机体的点。可以将每条生长曲线解析为已知有机体的一条、两条或更多条其他曲线的组合。可以见到大部分小室不含有有机体，但是在1401处显示出三个小室，所述小室含有提供可鉴定生长曲线的一种类型的有机体，如借助穿过该小室的透射所鉴定。其他两个小室1402显示不同的生长模式并且仍含有另一种有机体，并且三个小室1403含有仍另一种生长模式。后一种模式可以归因于不同的有机体，但是更可能代表这样的小室，其中定位小室1402中所示的两个临时黏附的有机体类型。多种有机体提供更快的生长曲线，不过曲线的形状仍轻易地可识别。可以见到，提供混合有机体的大量量值的任何尝试必须与下述生长曲线竞争，所述生长曲线将在针对培养基每种类型有机体的数目的依赖性方面不同。
[0413]为了将该生长曲线与取自已知有机体的那些进行比较，首先正规化该曲线的起点，即检测任何生长曲线开始的起点，因为这个起点可能随起初存在的有机体的个数变动。新曲线然后沿水平轴(时间)为最佳拟合定标(假定温度或有机体个数可以已经不同)并且随后在垂直轴(量)上为最佳拟合定标(假定生长培养基可以不是相同的)。这个过程可以是递归的并且将提供所比较生长曲线的本体和终点的匹配程度的量值作为最终结果。全部可获得的生长曲线针对新生长曲线进行匹配以便最佳拟合并且记录拟合的紧密程度。
[0414]如果仅单种有机体存在，则可能针对至少一条存储的生长曲线获得非常接近的匹配，然而，如果多于一种有机体存在于样品中并且在培养基中生长，该匹配将不是接近的并且发生第二步骤。
[0415]针对当前曲线取得最接近匹配，将已知有机体的第二生长曲线与第一曲线合并以提供合并的生长曲线。再次，来自第二步骤的曲线在时标上和在量标上定标以便最佳拟合，并且从存储的生长曲线中进行多重比较以确定总体最佳拟合。如果这种拟合没有处于可接受拟合范围内(正常情况下保留作为当前区域和匹配曲线的差异)，则可以用下一个最可能的拟合重复该过程。
[0416]最终，在所要求的标准内部找到一个亦或多个匹配，并且提供在可接受参数范围内的最佳匹配的报告，同时指出哪个是最佳并因此最可能的，或否则无效报告将发布，并且可能要求由产生图14的稀释过程所致的匹配。在该过程成功的情况下，进行的计算将显示找到的有机体并且还显示培养基中最初的有机体浓度。
[0417]比较过程可以在计算机上或者借助GUI界面和使用者辅助标定或完全在软件控制下进行，优选地按照确定最佳匹配的已知方式使用“模糊匹配”算法。
[0418]在一些情况下，生长曲线的初始斜率可以单纯足以允许分类。尽管在培养基中可能存在多种有机体，但仅需要鉴定它们当中一种的情况下，这特别是如此。因而，可以早期区分相对明显的大肠杆菌初始生长曲线并且除非必须鉴定培养基中的其他有机体，否则可以容易地提供存在大肠杆菌的指示。
[0419]图15显示一种实现这种匹配的方法，其中在1501接受待匹配的新生长曲线，在1502将这条曲线与单一现存的生长曲线进行比较，同时选择曲线的起点和标度。针对全部现存的生长曲线进行比较。如果在1503检测到精确匹配，则在1504产生报告，然而如果精确匹配不存在，则通过求取在1505处所见为最佳匹配并且在1506添加其他微生物的单一生长曲线以尝试实现精确匹配，该过程继续。如果尝试之一在1507产生精确匹配，则在1504产生报，否则毕竟全部可能匹配均已经失败，则具有在1508产生最佳匹配的合格报告。这些匹配由数学计算采用线测量亦或面积测量进行，以向曲线指示“最佳拟合”。
[0420]尽管如上文所述的过程采用单一生长曲线，但是可以借助多个不同带宽的光进行测量，并且匹配过程可以相对于该过程中使用的全部带宽或相对于它们的组合发生。因为不同波长的生长曲线可以对于一些微生物而言非常不同，所以可能要求这样，并且这允许证实或排除它们存在于测量的样品中。类似地，即便在单一频带进行测量，但是可以选择这个频带以最佳地显示正在优选追寻的有机体。
[0421]因为对有机体生长的检测是光学方式并且借助透射光亦或反射光，所以需要用于该有机体和培养基或分析物的容器尽可能是一致的，因为顾虑光路扭曲和不同波长的吸收。因此，容器应当在顾虑的波长是透明的，并且光束穿过的区域应当具有一致成型的壁，这些壁在正常使用不可察觉地扭曲。容器应当包装，这样使得光束穿过的区域不容易在户外被使用者污染。同时，容器是一次性使用物品，因此成本是一个因素，并且因此使用具有聚乙烯醇涂层以减少氧吸收的聚对苯二甲酸乙二醇酯。替代性选项可以是丙烯酸(苯乙烯-丙烯腈)容器。
[0422]为此目的，图16显示刃天青中含有大肠杆菌有机体的一份培养物的透射曲线，而图17显示相同培养物的反射比曲线。图17中还包括针对培养物的散射的量，所述量是从光源散射的光的量度。这可以充当培养物浊度的指示剂。
[0423]图16显示在红色频带1601、绿色频带1602和蓝色频带1603中的透射光，如对具体培养测量；图17显示红色1701、绿色1702、蓝色1703的反射光和散射1704，如相对于光路以90度对相同培养物所测量；图18显示组合(蓝-红)/红光1801的第一微分、这种组合光在1802处的第二微分和散射光1704在1803处的微分。
[0424]可以见到在培养时期开始后360至540分钟的时间范围内，培养基的浊度和颜色均发生巨大变化。为了从代表有机体在培养物内部生长的这些曲线可重复地提取可检测事件，必须检测唯一鉴定具体有机体的一系列变化。在培养物中，必需将显示一系列事件的生长模式鉴定为:
[0425]蓝色/红色比的变化(因为这些颜色是刃天青的指示剂颜色)。
[0426]培养物浊度的变化。
[0427]在这些变化内部，可以按数学方式鉴定某些临界点，并且尤其是生长曲线的拐点，如通过第一微分和第二微分更清晰显示是有用的。一组这样的临界点借助以下顺序是可鉴定的:
[0428](a)((透射蓝光-透射红光)/透射红光)比率变化(即第一微分)可察觉地为负的点。
[0429](b)此后以上情况下累加变化的第二微分达到可察觉值的点。
[0430](C)此后累加变化的第二微分为负并然后再次可察觉地为正的点。
[0431](d)此后散射变化的3点移动平均值可察觉地为正的点。
[0432](e)如果这些标准满足，可以确定地鉴定有机体为大肠杆菌并且可以将污染的水平读取为在时间点(a)处的散射值。
[0433]这等同于:检测在归一化的蓝色-红色比较曲线上负斜率的存在，然后在该比较曲线中检测下一个向上摆动，然后检测在检测的第一点后所检测到的散射上升。如果这些条件满足，则大肠杆菌存在并在培养物中占优势。
[0434]可以对于其他有机体遵循这种模式，即由指示剂设定使用的第一颜色集合，由指示剂设定使用的最终颜色集合、培养物中的初始浊度、培养物中的最终浊度。将存在醒目的色调变化事件，正常情况下是逐步的，但不必然如此。色调变化的部分将显示对于这种有机体而言为恒定模式的变异。除此之外，随着培养的有机体生长，培养基的浊度将增加，然而这种增加将不以线性速率进行，相反，随着有机体生长，饱和曲线将显示出可能是快并可以逆转的变化。目前认为这归因于有机体内其中一些有机体倾向于群集或团聚并因此暂时降低浊度的生长阶段。
[0435]图19显示使用表述为饱和度/色调曲线的培养基图中的拐点检测有机体类型的方法的流程图，因为不以一种颜色中红色、蓝色和绿色的量表述，反而可以将一个量值表述为这种颜色的色调和这种颜色的饱和度的量。
[0436]在图19中，在1901处提供了用于靶培养物的指示剂颜色的典型起点和终点。接下来，在1902，编码在具有指示剂的培养物中生长时鉴定具体感兴趣的有机体的色调拐点。类似地，在1903，输入这些有机体的饱和曲线的拐点，并且这些拐点典型地不重合于色调的那些拐点。
[0437]在1904处，选择当前生长曲线的第一色调拐点，并且在1905处，选择第二色调拐点。在1906，将这一比较输入这样的回路，其中通过以下方式针对每种存储的有机体的值比较选择的拐点:在1907从任何匹配选择下一个色调拐点亦或在1908选择下一个饱和拐点并且在1909比较第三个点相对于前两个点的相对时间差异。如果在1910找到近似的匹配，则在1912将该匹配存储为可能匹配。如果在1913未完成比较，则所选择拐点的相对间距与勉强够用的匹配的已知追踪拐点在1915进行比较，并且如果存在一个拐点，则将它标记并且继续比较直至排除该选择。对于找到的每种可能匹配，全部拐点的间距与正在检验的当前培养物在1914进行比较，并且在找到匹配的情况下，在1917返回结果。如果未找到匹配，则启动以类似于图15的方式利用有机体组合的另外一个分类过程(未显示)以便鉴定含有靶定有机体的混合物的培养物。
[0438]光透射和反射曲线中拐度和拐点的检测可以进行数学定量以允许自动检测这些曲线上可以充当指示一种或多种有机体存在的点。
[0439]相对于总体生长曲线对出现这种情况的时间进行检测，连同色调变化的不规则性，提供了可解决的醒目特征标识。
[0440]生长培养基
[0441]样品在已经标准化并针对已知有机体校准过的培养基中培育。优选地，将生长培养基以干燥状态保存于PCT/NZ2005/000139中所描述类型的无菌透明塑料容器内部的可破裂容器或小袋中。下文描述合适的生长培养基。无论选择何种生长培养基，它应当在一系列标准检验容器之间是恒定的并且针对已知有机体校准，这样使得上文所示的图可以可靠地用来通过将生长模式与预先校准的图和机读数据进行比较，确定来自环境样品的微生物的身份为了确保可靠检测一类有机体，全部参数(培养基、容器类型、光源、选择的滤光片或波长、孵育温度和液体样品的体积)应当保持恒定，这一使得唯一变量是样品中微生物的身份和量。
[0442]应当指出，可以改变这些生长培养基组成以允许特异生长和检测不同微生物；本发明实例涉及检测大肠型细菌(表1和表2)和葡萄球菌(表3)。
[0443]实例I-大肠型细菌
[0444]一个优选的生长培养基组合物含有指示剂(例如刃天青)、非特异性微生物（即不进行检验的那些微生物）的抑制剂(例如胆盐)、蛋白质源(例如酪胨-酪蛋白胰酶消化物)、能量源(例如乳糖）和至少一种盐(例如NaCl)。下文描述这种组合物的实例；表1。此外，已经给出该组合物的每种组分的百分比范围，在所述范围内仍可以按照本发明进行大肠型检测。表2中给出适于检验大肠型细菌存在(包括大肠杆菌）的另一个生长培养基组合物。
[0445]表1
[0446]
【权利要求】
1.一种便携式微生物检测设备，包括： 一个培养箱，其至少部分包围能够接纳基本上透明的刚性流体容器的容器接收空间，所述容器具有穿过所述容器的至少一条光路， 安装在培养箱上或其中的能够传输光至所述流体容器中的至少一个光源， 至少一个光传感器，其安装在所述培养箱上或其中并且能够检测至少一种颜色的光，所述光已经从所述至少一个光源穿过至少部分的流体， 在非瞬态介质上存储的校准信息，所述校准信息关于在含有鉴定的已知微生物样品的相似容器中所测量的随时间推移的光变化， 连接至或安装在所述培养箱上以提供所述样品在何处取得的位置数据的位置检测系统， 一个微处理器，能够控制培养箱和一个或多个光源和一个或多个光传感器的运行并且比较、分析和存储结果以及接收来自位置检测系统的位置数据， 在非瞬态介质上存储的校准信息，所述校准信息关于在含有鉴定的已知微生物样品的相似容器中所测量的随时间推移的光变化， 具有比较器的微处理器，所述比较器能够检测随时间推移因在所述培养箱中孵育的基本上透明的刚性流体容器中样品所致的变化，并且将所述变化与存储的校准信息比较以确定具体微生物的存在或不存在， 存储比较结果及来自位置检测系统的日期和时戳及位置信息的一个数据记录器。
2.根据权利要求1中所述的设备，其中所述培养箱具有发送结果至基站的一个发射器。
3.—种通过下方式从其中浸没了可能含有微生物的样品的生长培养基的颜色变化检测微生物的方法：将来自一个位置的样品密封于基本上透明的刚性流体容器中，所述流体容器具有穿过容器的至少一条光路；将所述容器置于培养箱中，随时间推移从安装在培养箱上或其中的至少一个光源传输光至所述流体容器中；通过安装在培养箱上或其中的至少一个光传感器检测至少一种颜色的光，所述光已经从至少一个光源穿过至少部分的所述流体；从所述至少一个光传感器发送数据至具有比较器的微处理器，所述比较器通过以下方式分析随时间推移因在培养箱内正在孵育的基本上透明的刚性流体容器中样品所致的光变化以确定至少一种特定微生物的存在或不存在：将检测到的光变化与存储的校准信息比较；并且将样品的比较结果连同这份样品的位置信息和日期和时戳存储于数据记录器中。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中将结果传输至基站并存储于数据库中。
5.根据权利要求4中所述的方法，其中分析多份样品并将结果传输至基站用于通过计算机分析。
6.根据权利要求5中所述的方法，其中评估样品内部一种或多种微生物随时间推移的生长速率以计数在所述位置处检测到的一种或多种微生物的数目。
7.根据权利要求5或权利要求6中所述的方法，其中所述计算机从每份样品的样品数据和位置与日期时戳分析微生物空间种群的出现或扩散或下降。
8.根据权利要求3中所述的方法，其中随时间推移的生长速率针对不同微生物的存储校准信息匹配以确定最接近的匹配。
9.根据权利要求3中所述的检测微生物的方法，其中生长培养基对大肠杆菌进行优化。
10.根据权利要求3中所述的检测微生 物的方法，其中生长培养基含有乳糖和生长辅助剂。
【文档编号】G01N21/00GK103765193SQ201280041284
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2011年6月22日
【发明者】罗斯玛丽·凯瑟琳·卡梅伦·莎平 申请人:载泽吧检测有限公司