本发明涉及对样品、尤其是组织样品中的蛋白进行检测和/或定量的改进方法。
背景技术：
：免疫组织化学（IHC）是通过借助抗体检测抗原，从而对组织切片上细胞中的蛋白进行定位的方法的名称。免疫组织化学利用了抗体特异性结合至生物组织中的抗原这一事实。抗体可以是多克隆或单克隆来源的抗体，单克隆抗体本质上更具特异性。可用多种方法对抗体-抗原对进行可视化。大多数情况下，将抗体缀合至酶（特别是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶），所述酶在发色底物（例如用于辣根过氧化物酶的DAB）或荧光团（FITC、TRITC、AMCA等）的存在下产生高度着色的产物。对由发色或荧光方法获得的信号的密度测定分析可分别提供半定量或定量数据，从而能够将测量到的信号水平与蛋白的表达水平或定位相关联。这允许由解剖病理学家进行基于显微镜下观测的半定量检测，将切片分为“阴性”或“阳性”（1+、2+或3+）。免疫组织化学通过检测异常细胞（如那些在癌性肿瘤中发现的细胞）而广泛用于癌症的诊断和/或随访（follow-up）。现已知多种癌症的特异性标记物，如用于结肠癌实例中的癌胚抗原（CEA）、用于Hodgkin氏病的CD15和CD30、用于肝细胞癌实例中的甲胎蛋白、作为胃肠道间质瘤标记物的CD117、以及作为肿瘤增殖指标之一的Ki-67。这些分子标记物是某些细胞事件（如增殖或细胞死亡（凋亡））的特征。免疫组织化学还广泛用于基础研究，以用于理解生物组织不同部分表达的蛋白质和生物标记物的分布和定位。免疫组织化学使用两类方法：直接方法和间接方法。直接方法仅包括一个着色步骤，并且该方法基于使用直接与组织切片中的抗原进行反应的经标记的抗体。虽然这一方法简单快速，但由于缺少信号放大因而灵敏度低。间接方法包括使用未标记的一抗（该一抗对感兴趣的抗原具特异性）、以及经标记的二抗（该二抗识别用于制备一抗的动物物种的IgG）。由于每个一抗与数个二抗结合而放大了信号，因此这一方法比直接检测方案更为灵敏。传统的免疫组织化学技术在组织抗原的最终着色前需要多个步骤，而许多潜在的问题可能影响这一过程的结果。最常遇到的问题是背景噪声过高、抗原标记不充分以及自发荧光问题。为了降低与一抗或二抗和样品中存在的蛋白间的非特异性结合相关的背景噪声，一般将样品与封闭一抗或二抗可能结合的反应位点的缓冲液共同孵育。最常用的封闭缓冲液为：正常血清、脱脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）或明胶，并且其它具有特定配方的缓冲液也是可商购的。对于分析生物样品、特别是组织的生物样品的技术存在需求，该技术不具有传统技术特别是在背景噪声方面的缺陷。本发明使得能够解决这些问题；本发明特别是显著降低了使用传统免疫组织化学方法（即，使用单一抗体检测感兴趣的蛋白）时观测到的背景噪声。技术实现要素：本发明的目的为有利地使用FRET伴侣对（pairofFRETpartners）来对细胞表面或组织样品中存在的蛋白进行定量的方法。本发明的目的还为实施这一方法的试剂盒；以及在用于确定乳腺癌患者能否使用抗-HER2抗体进行治疗的治疗诊断（theranostic）方法的情况下，将这一方法应用于HER2蛋白的用途。术语“FRET伴侣对”是指由能量供体荧光化合物（下文称为“供体荧光化合物”）和能量受体化合物（下文称为“受体化合物”）所组成的对；当它们彼此接近并且在供体荧光化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发出FRET（“ResonanceEnergyTransfer”）信号。术语“FRET信号”是指代表供体荧光化合物及受体化合物之间的FRET的任何可测量信号。因此，FRET信号可以是供体荧光化合物或受体化合物（当受体化合物为荧光化合物时）的发光强度或发光寿命的变化。当以时间分辨测量FRET信号（一般为使用稀土元素螯合物或穴状化合物的情况）时，使用术语TR-FRET（时间分辨FRET的首字母缩写）。本发明的第一方面涉及用于对在细胞表面表达或存在于组织样品中的感兴趣的蛋白进行定量的方法，所述方法包括如下步骤：（i）使表达所述蛋白的细胞或组织样品与第一配体和第二配体接触，这些配体的每一种均能够特异性地结合至所述蛋白的结构域，并且这些配体分别标记有供体化合物和受体化合物，所述供体化合物和所述受体化合物二者形成FRET伴侣对；（ii）清洗所述细胞或所述组织样品；（iii）测量由测量介质发射的FRET信号。术语“组织样品”优选意指取自患者的固态组织样品，优选为肿瘤组织提取物。术语“定量方法”意指用于相对定量的方法，即根据存在于样品中的感兴趣的蛋白的量，所测量的信号在不同样品中将有所不同。这一技术与传统免疫组织化学方法的不同之处在于，使用了对感兴趣的蛋白具有特异性的两种配体（特别是两种抗体），而非现有技术方法中的只使用一种。由于这一方法允许在均质介质（homogeneousmedium）中进行测量，因此还包括清洗步骤（在使用FRET技术时通常不进行这一步骤）。这一方法与仅当这些配体（或抗体）彼此接近时才发射FRET信号这一事实相联合，得到的信噪比远优于传统方案（即使用单一配体或抗体的方案）中观测到的信噪比。当在组织样品上实施所述方法时，需要以20μm-50μm厚度切片的形式制备这一样品的步骤。这些制备步骤为本领域（即免疫组织化学）技术人员所常规使用的。这些步骤可特别在于由如下内容组成：通过用甲醛处理而固定样品、以及在石蜡中包埋所述样品（特别是包埋为随后能够在切片机上进行切割的块状（blocks）形式（优选具有约20μm-50μm的厚度））。用二甲苯对这些切片进行处理从而去除石蜡、用乙醇并随后用水漂洗所述切片、以及借助HIER（“热诱导的表位修复（heatinducedepitoperecovery）”的首字母缩写）技术进行表位重建均为本领域普通技术人员已知的技术。或者，根据本发明的方法也可在冷冻切片上实施，所述冷冻切片优选为20μm-50μm厚，同样也是根据传统技术制备。当根据本发明的方法在组织样品上实施时，优选包括在将荧光化合物引入测量介质之前或之后，旨在以细胞裂解物的形式对该样品进行均质化的步骤。这一步骤优选在将荧光化合物（第一配体、第二配体以及任选的标记试剂）引入测量介质之后、对FRET信号进行测量之前实施。这样的处理可以是机械的，并可选自于应用超声波（声波处理）、冷冻/解冻循环、使用机械研磨机，任选地与低渗裂解缓冲液或含有去污剂的裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）共用。此外，当根据本发明的方法在组织样品上实施时，测量介质中第一配体和第二配体的终浓度被确定为优选大于10nM、优选10nM-150nM或20nM-80nM、优选30nM-60nM。术语“终浓度”意味着将所有试剂引入测量介质后，这些化合物在测量介质中的浓度。这些浓度范围显著高于TR-FRET类型分析中正常使用的浓度（其中，荧光配体的终浓度为1纳摩尔的量级，即小于10nM）。所述方法还可在附着的细胞、或甚至悬浮的细胞上实施。然而，在后一种情况下，为实施所述清洗步骤，将需要至少一个离心步骤。优选根据测量介质中存在的生物材料（细胞或组织）的量，对FERT信号进行归一化。由此，在一个具体实施方式中，根据本发明的方法包括在清洗步骤前，将所述细胞或所述组织样品与用于DNA的荧光标记的试剂（例如Hoechst33342）进行孵育，并根据这一标记试剂的发光所对应的信号对所述FRET信号进行归一化。在一个优选的实施方式中，第一配体和第二配体为识别感兴趣的蛋白的抗体。这里，应在广义上理解术语“抗体”，该术语“抗体”包括免疫球蛋白家族的任何蛋白、或包含免疫球蛋白结构域，以及特异性结合至感兴趣的蛋白的位点。因此所述抗体可以是Fab或Fab′片段、单链抗体、或免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域。本领域技术人员能够使用传统技术制备对需要确定其表达的蛋白具有特异性的抗体。还可商购获得多种抗体。本领域技术人员会注意对识别感兴趣的蛋白上不同表位的抗体进行选择，从而能够将所述抗体同时结合至该蛋白。可使用其它配体代替抗体。由此，在本发明的一个具体实施方式中，第一配体为感兴趣的蛋白的已知配体（如激动剂或拮抗剂）且不是抗体；第二配体为抗体。这里再次重申，优选第一配体的结合位点与抗体的结合位点不同。若感兴趣的蛋白为G蛋白偶联受体，本领域技术人员将可参考Okuno等公开的数据库（GLIDA:GPCRliganddatabaseforchemicalgenomicsdrugdiscoverydatabaseandtoolsupdate.Nucl.AcidsRes.，36（suppl_1），D907-912）来寻找能够用于本发明所述方法的配体。感兴趣的蛋白可以是任何由测量介质中存在的细胞表达的蛋白质。本方法特别适合研究膜蛋白，如离子通道、受体，特别是G蛋白偶联受体（GPCR）、受体酪氨酸激酶（RTK），例如EGFR（HER1）、HER2、HER3、HER4。所述方法特别有益于确定组织样品、特别是肿瘤样品中HER2蛋白的表达，从而确定能否对有关患者使用抗-HER2类型治疗，特别是使用结合至HER2蛋白的抗体，如曲妥珠单抗（赫赛汀（Herceptin）TM）进行治疗。对此，将获得的代表HER2表达的值与参比阈值相比较，高于所述参比阈值时倾向于对患者进行抗-HER2类型治疗。在第二方面，本发明因此涉及对能够以结合至HER2蛋白的抗体进行治疗处理的癌症患者进行选择的方法，该方法包括实施本发明所述的定量方法，其中所述蛋白为HER2。完全出乎意料地，本发明所述的方法使得能够在“HercepTestTM阴性”患者（即，这一测试的结果使得不适合以曲妥珠单抗抗体对其进行治疗的患者（患者分类为0、1+、或2+））中明确地检测HER2蛋白。由此，在一个对于临床观点而言特别有益的实施方式中，对HER2蛋白表达的免疫组织化学分析结果为阴性（0、1+、以及2+）的患者的组织样品实施本发明所述的方法。这一方法对于已进行激素化学疗法的患者十分有价值，特别是当该激素化学疗法并未改善该患者的状况时更是如此。在一个优选的实施方式中，感兴趣的蛋白不同于以同二聚体形式组成性且专一性（constitutivelyandexclusively）表达的受体。当感兴趣的蛋白为EGFR（HER1）受体时，以FRET伴侣标记的配体之一可以是抗-EGFR抗体，而另一配体可以是EGF或抗-EGFR抗体（抗-EGFR抗体可商购获得）。当感兴趣的蛋白结构为HER2蛋白时，第一配体和第二配体优选为对HER2蛋白具有特异性的抗体，特别是其表位位于该受体胞外结构域的抗体。如上所述，优选这些表位是不同的。在第三方面，本发明涉及用于实施本发明所述的方法的试剂盒。该试剂盒包含第一配体和第二配体，这些配体的每一种均能够特异性地结合至感兴趣的膜蛋白的结构域，并且这些配体分别标记有供体化合物和受体化合物，所述供体化合物和所述受体化合物二者形成FRET伴侣对。这些配体的技术特征如上所述。对于使用传统IHC测试（HercepTestTM）判断不适合对其进行抗-HER2类型治疗的患者，本发明所述的用于对HER2蛋白进行定量的试剂盒具有可观的治疗优势。因此该试剂盒（其中的配体为HER2蛋白特异性抗体）是特别优选的。具体实施方式以能量供体或受体化合物标记抗体通过传统缀合技术，利用反应基团以荧光供体或受体化合物对配体或抗体进行标记。荧光供体或受体化合物通常以“官能化”的形式出售，即，其具有能够与待标记化合物（在这一情况下为配体）上存在的官能团进行反应的反应基团。典型地，供体或受体荧光化合物上存在的反应基团是亲电（electrophilic）基团或亲核（nucleophilic）基团；所述基团分别在合适的亲核基团或亲电基团存在下能形成共价键。例如，以下列出了亲电/亲核基团对以及当其成对出现时所形成的共价键类型：亲电基团亲核基团键类型丙烯酰胺硫醇硫醚酰卤胺/苯胺酰胺（carboxamides）醛胺/苯胺亚胺醛或酮肼腙醛或酮羟胺肟烷基磺酸盐/酯硫醇硫醚酸酐胺/苯胺酰胺芳基卤化物硫醇硫醚芳基卤化物胺芳基胺氮丙啶硫醇硫醚碳二亚胺羧酸N-酰基脲或酸酐活化的酯*胺/苯胺酰胺卤代乙酰胺硫醇硫醚卤代三嗪胺/苯胺氨基三嗪酰亚胺酯（imidoesters）胺/苯胺脒异氰酸盐/酯胺/苯胺脲异硫氰酸盐/酯胺/苯胺硫脲马来酰亚胺硫醇硫醚磺酸酯胺/苯胺烷基胺磺酰卤胺/苯胺磺胺*：术语“活化的酯”意味着式COY的基团，其中Y为：·离去基团，选自于琥珀酰亚胺氧基（-OC4H4NO2）和磺基琥珀酰亚胺氧基（-OC4H3NO2-SO3H）基团；·未取代或取代的芳基氧基，所述取代为至少一个亲电取代，如硝基、氟代、氯代、氰基或三氟甲基取代，从而形成活化的芳基酯；·以碳二亚胺基团活化的羧酸，形成酸酐-OCORa或-OCNRaNHRb，其中Ra和Rb相同或不同，并选自于C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基、C1-C6烷氧基和环己基；·3-二甲氨基丙基或N-吗啉基乙基。可商购获得的供体和受体荧光化合物通常包含马来酰亚胺官能团或活化的酯（多数通常以NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）基团活化），其分别与硫醇和胺基基团反应，因此可用于标记抗体。标记的抗体通过终摩尔比（FMR）表征（FMR表示接枝至配体的标记分子的平均数量）。当配体是天然蛋白质时，优选使用蛋白质中天然存在的官能团中的一种：氨基末端基团（amino-terminalgroup）、羧基末端基团（carboxylateterminalgroup）、天冬氨酸的羧基及谷氨酸的羧基、赖氨酸的氨基、精氨酸的胍基、半胱氨酸的巯基、酪氨酸的酚基、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。若配体在天然状态下不包含官能团，可引入此类官能团。引入官能团的方法在C.Kessler，Nonisotopicprobing，BlottingandSequencing，第二版；L.J.Kricka（1995）编，AcademicpressLtd.，London，p.66-72中有具体描述。另一种用荧光化合物标记配体的方法在于将反应基团（例如NHS基或马来酰亚胺基团）引入配体，并使其与含有官能团的荧光团共存，该官能团将与所述反应基团反应从而形成共价键。对经标记的配体对于其受体是否保持足够的亲和性进行验证是重要的；这可简单地通过传统结合实验进行控制，从而能够对经标记的配体对于受体的亲和常数进行计算。FRET伴侣对FRET伴侣对优选由能量供体荧光化合物和能量受体荧光化合物组成。FRET定义为由能量供体和能量受体间的偶极-偶极相互作用导致的非辐射性能量转移。这一物理现象要求这些分子间具有能量相容性（compatibility）。这意味着供体的发射光谱必须与受体的吸收光谱至少部分重叠。根据理论，FRET是依赖于受体和供体分子二者的间隔距离的过程：当这些分子彼此接近时，将发射FRET信号。本领域技术人员能够对用于获得FRET信号的供体/受体荧光团对进行选择。可用于研究FRET现象的供体-受体对在由JosephR.Lakowicz编写的教科书（Principlesoffluorescencespectroscopy，第二版，Kluweracademic/plenumpublishers，NY（1999））中具体描述，本领域技术人员可加以参考。由于长寿命（>0.1ms，优选在0.5ms-6ms之间）的能量供体荧光化合物、尤其是稀土元素螯合物或穴状化合物能够实现时间分辨的测量，即在消除由测量介质发出的自发荧光现象时测量TR-FRET（时间分辨FRET）信号，因此是优选的。因此，通常优选上述供体化合物来实施本发明所述的方法。镝（Dy3+）、钐（Sm3+）、钕（Nd3+）、镱（Yb3+）或铒（Er3+）的配合物（complexes）是等同地适于本发明目的的稀土元素配合物，然而特别优选铕（Eu3+）螯合物和穴状化合物以及铽（Tb3+）螯合物和穴状化合物。已描述了大量稀土元素配合物，数种稀土元素配合物目前由PerkinElmer、Invitrogen和CisbioBioassays公司销售。适于本发明目的的稀土元素螯合物或穴状化合物的实例为：·包含一个或多个吡啶单元的镧系元素穴状化合物。此类稀土元素穴状化合物已记载于例如专利EP0180492、EP0321353、EP0601113和国际申请WO01/96877中。铽（Tb3+）穴状化合物和铕（Eu3+）穴状化合物特别适合于本发明的目的。镧系元素穴状化合物由CisbioBioassays公司销售。通过非限定性实例的方式，可提及具有下式的铕穴状化合物（可通过反应基团将其偶联至待标记的化合物，在此情况下，反应基团例如为NH2基团）：·在专利US4761481、US5032677、US5055578、US5106957、US5116989、US4761481、US4801722、US4794191、US4637988、US4670572、US4837169和US4859777中有具体描述的镧系元素螯合物。专利EP0403593、US5324825、US5202423和US5316909中记载了由九齿（nonadentate）配体（如三联吡啶）形成的螯合物。镧系元素螯合物由PerkinElmer公司销售。·也可使用由螯合剂（如四氮杂环十二烷）形成的镧系元素配合物，所述配合物用含有芳环的发色团取代（如R.Poole等在Biomol.Chem，2005，3，1013-1024“Synthesisandcharacterizationofhighlyemissiveandkineticallystablelanthanidecomplexessuitableforusageincellulo”中记载的配合物）。还可使用申请WO2009/10580中记载的配合物。·还可使用在专利EP1154991和EP1154990中描述的镧系元素穴状化合物。·具有下式的铽穴状化合物（可通过反应基团将其偶联至待标记的化合物，在该情况下，反应基团例如为NH2基团）：其合成在国际申请WO2008/063721中有描述（化合物6a，第89页）。·来自于Lumiphore公司的铽穴状化合物Lumi4-Tb，由CisbioBioassays出售。·具有下式的来自于ResearchOrganics公司的量子染料（可通过反应基团将其偶联至待标记的化合物，在该情况下，反应基团为NCS）：·钌螯合物，特别是由钌离子及若干个联吡啶组成的配合物，如三(2,2'-联吡啶)钌(II)。·具有下式的铽螯合物DTPA-cs124Tb，由LifeTechnologies公司出售（可通过反应基团R将其偶联至待标记的化合物），其合成在美国专利US5622821中有描述：·具有下式的铽螯合物，其由Latva等（JournalofLuminescence1997，75：149-169）描述：特别优选地，供体荧光化合物选自于：铕穴状化合物、铕螯合物、铽螯合物、铽穴状化合物、钌螯合物以及量子染料；特别优选铕螯合物、铕穴状化合物、铽螯合物和铽穴状化合物。镝（Dy3+）、钐（Sm3+）、钕（Nd3+）、镱（Yb3+）或铒（Er3+）的配合物也为适于本发明目的的稀土元素配合物。受体荧光化合物可选自于由下列化合物所组成的组：别藻蓝蛋白，尤其是已知的商品名为XL665的别藻蓝蛋白；发光有机分子，例如罗丹明、花青素（cyanines）（例如Cy5）、方酸菁（squaraines）、香豆素、原黄素（proflavins）、吖啶、荧光素（fluoresceins）、硼-二吡咯亚甲基衍生物（以“Bodipy”的名称出售）、已知名称为“Atto”的荧光团、已知名称为“DY”的荧光团、已知名称为“Alexa”的化合物和硝基苯并噁二唑。受体荧光化合物优选选自于别藻蓝蛋白、罗丹明、花青素、方酸菁、香豆素、原黄素、吖啶、荧光素、硼-二吡咯亚甲基衍生物和硝基苯并噁二唑。表述“花青素”和“罗丹明”分别应理解为“花青素衍生物”和“罗丹明衍生物”。本领域技术人员已知多种可商购的此类荧光团。“Alexa”化合物由Invitrogen公司出售；“Atto”化合物由Atto-tec公司出售；“DY”化合物由Dyomics公司出售；“Cy”化合物由AmershamBiosciences公司出售；其它化合物由多个化学试剂供应商（如SigmaAldrich或Acros公司）出售。受体荧光化合物也可使用如下荧光蛋白：青色荧光蛋白（AmCyan1、Midori-IshiCyan、mTFP1），绿色荧光蛋白（EGFP、AcGFP、TurboGFP，Emerald、AzamiGreen、ZsGreen），黄色荧光蛋白（EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellow1、mBanana），橙色和红色荧光蛋白（Orangekusibari、mOrange、tdtomato、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、mTangerine、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、mStrawberry、HcRed1、mRaspberry、HcRed-Tandem、mPlim、AQ143），远红外荧光蛋白（mKate、mKate2、tdKatushka2）。对于本发明的目的，优选使用花青素衍生物或荧光素衍生物作为受体荧光化合物。实施例实施例1将含有hEGFR编码序列的质粒稳定转染至NIH/3T3细胞（不表达人EGFR受体的小鼠成纤维细胞），并在含有嘌呤霉素的培养基中进行筛选。获得的表达hEGFR受体的品系随后称为P1。类似地（区别在于用含有潮霉素的选择培养基），制备表达人HER2蛋白的品系（以下称为“H2”）。通过将P1细胞异种移植至小鼠获得肿瘤，根据传统使用的方案将所述肿瘤在甲醛中固定，随后在石蜡中包埋。用切片机对得到的块状物进行切割（厚度约20μm），得到的FFPE（甲醛固定石蜡包埋）切片在eppendorf管中4℃储存待用。将1.2mL二甲苯替代品（substitute）加至eppendorf管中的切片，孵育5min后，对所述管进行离心（16000RCF），通过吸液除去上清液。重复1次相同步骤，然后添加1.2mL无水乙醇。孵育3min后，对管进行离心（16000RCF），通过吸液除去上清液。重复1次相同步骤，随后添加1.2mL95%乙醇。孵育3min后，对所述管进行离心（16000RCF），通过吸液除去上清液。随后添加1.2mL50%乙醇，孵育3min后，对所述管进行离心（16000RCF），通过吸液除去上清液。加入0.5mL10mMTRIS-HCl+EDTA缓冲液（pH9），随后封闭所述管并水浴加热20min。冷却（10min）后，对所述管进行离心（16000RCF），通过吸液除去上清液。通过热处理对切片的EGFR表位进行重建（HIER为热诱导的表位修复），在由180μl50mMHEPES缓冲液构成的孵育缓冲液（pH为7）中重悬所述切片，在所述缓冲液中还含有蛋白酶抑制剂混合物、1%BSA、终浓度为50nM并标记有穴状化合物的EGFR特异性抗体Ab15（ThermoFisher）（CisbioBioassays）、以及终浓度为50nM并标记有受体荧光团d2（CisbioBioassays）的同为EGFR特异性的抗体REGF01（CisbioBioassays），其在665nm发射（REGF01-d2）。在20℃孵育16h后，添加20μl在缓冲液中为20μg/ml的Hoechst33342溶液，随后，在孵育15min后，对所述管进行离心（16000RCF），通过吸液除去上清液。在含有蛋白酶抑制剂混合物和0.1%BSA的300μl50mMHEPES缓冲液中重悬沉淀，对所述管进行离心（16000RCF）。在相同缓冲液中重复清洗/离心循环两次，并除去上清液。超声处理（以20%的强度在Branson声波仪上进行5s）使其均质化后，将100μl获得的裂解物通过移液枪加至黑色（96孔）微板的B3和B4孔中。用类似的方式制备“阴性对照”样品（不表达EGFR受体），只是所述样品来自于由异种移植H2细胞的小鼠获得的肿瘤。将100μl获得的裂解物通过移液枪加至黑色微板的B1和B2孔中构成阴性对照。在相邻的孔中还放置了：仅缓冲液（BB：缓冲液空白）和100μl通过1/2连续稀释（在HEPES缓冲液中，0.1%BSA）获得的REGF01-d2和抗体混合物的稀释液（孵育缓冲液），从而获得0.16nM～5nM终浓度范围的经标记的抗体（A3-A12孔）。随后在TecanSafire2设备上以荧光模式进行连续测量（“瞬时（prompt）荧光”延时=0；延时后测量时间=20μs），在640nm激发受体（d2）并在665nm读取所发射的荧光，随后在Pherastar设备上（用闪光灯激发）在340nm激发后，以时间分辨模式同时在620nm和665nm（延时=60μs；延时后测量时间=400μs）读取荧光。以荧光模式在665nm（F665）对0.16nM-5nM范围的孔进行的测量使得能够通过减去仅有缓冲液的荧光（B665）获得与每孔校正后的荧光相关联的校准线（calibrationline）：F665c=F665-B665（见图1）。通过插值（interpolation）获得结合至生物材料的抗体浓度。表1特异性信号（REGF01-d2结合至EGFR）与阴性对照信号的比值为4.6/2.8=1.64，这是一个相当低的信噪比。类似地，以TRF模式在620nm对0.16nM-5nM范围的孔进行的测量使得能够通过减去仅有缓冲液的荧光（B620）获得与每孔校正后的荧光相关联的校准线：E620c=E620-B620（见图2）。表2特异性信号（结合至EGFR）与阴性对照信号的比值为2.72/0.8=3.4，这也是一个相当低的信噪比。以TRF模式同时在620nm（供体的发光）和665nm（受体d2的发光）对板进行测量。获取表3中报导的下列值，用于校准范围。表3AbLumi4Tb（nM）0.160.310.631.252.55E6206650132002727053600106450210700E665609115023604630926018250绘制表示E665=f(E620)的图，获得直线，其斜率使得能够对如下进行计算：相对于H2和P1样品中在620nm测得的信号而言，铽在665nm的残余发射（residualemission）的贡献（下表中称为B665）。通过计算在665nm的信号（E665c）和铽在665nm通道的残余发射之差，计算在665nm恢复（restored）的FRET信号：Δ665=E665c-B665。在下表中，H460c对应于通过传统荧光模式测定的Hoechst33342化合物在460nm处的荧光。表4根据本发明获得的特异性信号（REGF01-d2与结合至EGFR）与阴性对照信号的比值为26646/300=89，这是优异的。这一实施例显示，根据本发明的方法使得能够在特异性信号和背景噪声之间获得优异的信噪比（系数为89），而使用单个标记的抗体最高仅能够获得系数为3.42的信噪比。实施例2将A431细胞系（ATCC/CRL-1555，每细胞表达约2×106EGFR受体（Shinobu，1984MolecularandCellularEndocrinology37，205））以每孔25000个细胞的密度分配至微滴定板（平底96孔黑色板）的孔中，在DMEM培养基中37℃过夜培养，从而获得附着的细胞层。以100μlPBS清洗两次后，在每孔中加入50μlKREBS缓冲液。[Krebs/HEPES缓冲液mmol/l：NaCl99；KCl4.69；CaCl21.87；MgSO41.2；K2HPO41.03；NaHCO325；Na-HEPES20+葡萄糖11.1mM+0.1%BSA，pH7.4]。在A1-A4孔中不加入其它试剂（缓冲液空白）。在A9-A12孔中加入10μl含有1μMEGF的KREBS（以饱和EGF结合位点），随后将Ab10-d2抗体（以d2-NHS（CisbioBioassays）标记的抗-EGFRAb10（ThermoFisherScientific），RMF=1.8）和EGF-Lumi4Tb（CisbioBioassays）的混合物加入A5-A12孔。以KREBS缓冲液将每孔中的体积补足至100μl，从而使得孔中Ab10-d2的终浓度为5nM且EGF-Lumi4Tb的终浓度为5nM。在相同微滴定板的孔中，通过在KREBS缓冲液中稀释含有EGF-Lumi4Tb和Ab10-d2的储液，形成标准范围（1/2连续稀释，从而获得1nM至0.031nM的Ab终浓度）。在PherastarFS设备（BMG）上用如下参数进行时间分辨模式读取：在下表中示出获得的E620c发射值（减去在仅含有缓冲液的A1和A2孔中测定的B620空白值后）。表5EGF-Lumi4Tb（nM）0.0310.0630.1250.250.51E620c63493014903050550010850E620c=f(EGF-Lumi4Tb)的图使得能够获得E620c和EGF-Lumi4Tb的nM浓度之间的对应关系（见图3）。将板在20℃孵育4小时（黑暗中）后，向A3-A12孔添加10μlHoechst33342（2mg/mL在DMSO中的溶液，即时在KREBS中预稀释至1/100th），并再在20℃孵育1小时。随后以100μlKREBS缓冲液对所有孔清洗4次，再在每孔中加入100μl相同的缓冲液。以与上述相同的参数进行时间分辨荧光读取。表6为使细胞表达的EGFR受体的结合位点饱和，在孔中加入EGF（终浓度100nM）（A9-A12孔），从而能够获得E620c荧光值（平均值=1050AFU），其代表了对应于标记有Lumi4Tb的EGF与细胞的非特异性结合的背景噪声。借助于校准线，估计EGF-Lumi4Tb的结合为约0.096nM。EGF-Lumi4Tb与细胞的特异性结合（A5-A8孔）为约0.348nM。因此，当使用感兴趣受体的单一配体（EGF-Lumi4Tb）时，信噪比为3.6，这一数值相对较低。为将孔中细胞数量的变化（特别是由于在清洗中细胞的脱离）考虑在内，使用Hoechst33342信号，通过将E620c信号除以用“传统”荧光模式在460nm测定的每孔中Hoechst/DNA复合物的荧光值来进行归一化（并乘以100000从而得到整数）。表7根据Hoechst33342的信号对值进行归一化后，信噪比为3.78，这一数值同样相对较低。测定经标记抗体（Ab10-d2）的结合：根据制造商的信息表，由于Ab10抗体干扰EGF与EGFR的结合，Ab10结合至与EGFR结合位点邻近的表位。加入过量的EGF也应干扰该抗体的结合，从而能够通过加入过量的EGF来对这一抗体的非特异性结合进行评估。通过在640nm对受体进行激发并在680nm（考虑到滤光片的带宽，可以将以“665nm”和“680nm”滤光片进行的测量归为一类，在两种情况下，测定均对应于“受体”通道）测定其发射（“瞬时荧光”），以荧光模式进行荧光测量。利用Ab10-d2的校准范围（1nM-0.031nM），在减去于680nm测得的缓冲液空白后而来的E680c测定值使得能够获得结合至细胞的抗体浓度（以nM计）。表8因此，当使用感兴趣受体的单一配体（(Ab10-d2）时，信噪比为1.58，这一数值相对较低。通过TR-FRET测定荧光探针的结合：以类似的方式，以时间分辨模式在620nm和665nm测量含有EGF-Lumi4Tb和Ab10-d2稀释液（1nM至0.031nM）的孔的信号。表9E620c63493014903050550010850E665c13431062204661210E665c和E620c的相关性直线使得能够获得铽在665nm通道的发射贡献：E665=0.102×E620，从而能够获得对应于铽发射贡献的B665值。在665nm的时间分辨测量（参数如上）的结果在下表中归类，其中Δ665=E665c–B665。表10在这一情况中，在665nm获得的信号代表由供体（EGF-Lumi4Tb）通过FRET激发受体（Ab10-d2）所发射的信号。当实施根据本发明的方法（即，使用两个标记有FRET伴侣的配体）时，信噪比为6.0，高于仅由标记的配体或仅由标记的抗体观测到的信噪比。为将每孔中细胞数量的变化考虑在内，使用Hoechst33342信号，通过将Δ665信号除以用“传统”荧光模式在460nm测定的每孔中Hoechst/DNA复合物的荧光值来进行归一化（并乘以100000从而得到整数）。表11信噪比为6.29，因此高于仅由标记的配体或仅由标记的抗体观测到的信噪比。实施例3将A431细胞系（ATCC/CRL-1555，每细胞表达约2×106EGFR受体（Shinobu，1984MolecularandCellularEndocrinology37，205））以每孔25000个细胞的密度分配至微滴定板（平底96孔黑色板）的孔中，在DMEM培养基中37℃过夜培养，从而获得附着的细胞层。用2×100μlPBS清洗，然后在每孔中加入50μlKREBS缓冲液。[Krebs/HEPES缓冲液mmol/l：NaCl99；KCl4.69；CaCl21.87；MgSO41.2；K2HPO41.03；NaHCO325；Na-HEPES20+葡萄糖11.1mM+0.1%BSA，pH7.4]。在B1-B4孔中不加入其它试剂（缓冲液空白）。将Ab10-d2抗体（以d2-NHS（CisbioBioassays）标记的抗-EGFRAb10（ThermoFisherScientific））和西妥昔单抗-Lumi4Tb（抗-EGFR）的混合物加入B5-B8孔，并以KREBS缓冲液将体积补足至100μl，从而使得孔中Ab10-d2的终浓度为5nM且西妥昔单抗-Lumi4Tb的终浓度为5nM。在相同微滴定板的孔中，通过在KREBS缓冲液中稀释含有西妥昔单抗-Lumi4Tb和Ab10-d2的储液，形成标准范围（1/2梯度稀释，从而获得1nM至0.031nM的Ab终浓度）。在PherastarFS设备（BMG）上用如下参数进行时间分辨模式读取：为评估抗体与细胞表面的非特异性结合，将CHO（中国仓鼠卵巢）细胞与相同的经标记抗体的溶液进行孵育，对孔进行清洗并在相同条件下测量荧光。清洗后，仅由西妥昔单抗-Lumi4Tb发射的平均信号对于A431细胞为24033AFU（任意荧光单位），而对于CHO细胞是1170AFU，即信噪比为21。当实施根据本发明的方法并测量FRET信号时，获得明显更好的信噪比，为约520。实施例4在这一实施例中，使用根据本发明的方法对患者肿瘤样品（具体为乳腺肿瘤样品）中EGFR和HER2蛋白的表达进行定量。以与实施例1类似的方式实施本方法：分别将和d2荧光团（Cisbiobioassays）用作FRET伴侣的供体和受体。为测量EGFR的表达，分别以和d2荧光团对所使用的西妥昔单抗（MerckKGaA）和Ab-10（ThermoScientific）抗体进行标记，该西妥昔单抗和Ab-10抗体识别EGFR的不同表位。为对HER2进行定量，也分别将和d2荧光团缀合至曲妥珠单抗抗体（RochePharmaAG）和FRP5抗体（在IMHarwerth等（1992）J.Biol.Chem.267：15160-15167中描述），该曲妥珠单抗和FRP5抗体对HER2的不同表位具有特异性。对于每种分析，在均以50nM含有两种抗体的180μlTR-FRET缓冲液（1×PBS/10%BSA）中将50μm肿瘤的冷冻切片孵育过夜。随后通过加入20μl0.1mg/ml的Hoechst33342（Invitrogen）溶液并在环境温度下孵育10min，对DNA进行染色。清洗和离心后，将样品重悬在TR-FRET缓冲液中、进行超声处理并转移至微板中。使用荧光计（BMGLabtech），在337nm激发后，以时间分辨模式（延时60μs，读取窗400μs）分别在620nm和665nm测量和d2的荧光信号。以荧光模式在460nm测量Hoechst33342的信号。根据下式对这些信号进行相对于背景噪声的校正：F校正=F样品-F背景噪声，其中F背景噪声的值通过测量仅有TR-FRET缓冲液的荧光获得。此外，对于每种分析，在测量样品的同时，在由含有50nM抗体和50nM抗体-d2混合物的储液进行1/2连续稀释（从而获得浓度范围）而获得的溶液上测量的荧光信号，并建立在每一抗体浓度下在665nm获得的信号和在620nm测得的信号间的关系。基于样品在620nm发射的信号，使用所生成的曲线计算荧光在665nm的贡献（F665Tb）。用如下方式表示TR-FRET信号：ΔF665=F665样品-F665Tb用DNA-Hoechst33342复合物在460nm的信号（F460）对TR-FRET信号进行归一化，从而将各测量介质中存在的生物材料含量的变化考虑在内，归一化至平均值为100000荧光单位（FU）：TR-FRET归一化的=(ΔF665×100000)/(F460)。归一化的TR-FRET信号以FU表示。为将归一化的TR-FRET信号转化为每个细胞中受体的数量，首先在NIH/3T3EGFR、NIH/3T3HER2、NIH/3T3EGFR/HER2和SKOV-3细胞系中对每个细胞中受体的数量进行评估。为此，如在先所描述的（Gaborit等，2011JBiolChem.，286（13）：11337-45），通过间接定量免疫荧光分析（QIFI试剂盒，Dako）用FACS对培养的细胞进行分析。并行地，使用TR-FRET分析对衍生自相应肿瘤细胞的小鼠异种移植样品的EGFR和HER2表达进行测量。由此，基于EGFR和HER2的表达在细胞培养物和衍生自这些细胞的异种移植肿瘤中水平相当的假设，将由异种移植获得的值作为将TR-FRET信号转化为每细胞受体数量的标准。结果：EGFR和HER2的表达由18个乳腺肿瘤样品获得的结果在图4中给出。观测到的表达的中位数水平（medianlevels）为2800EGFR/细胞（范围为220～35500EGFR/细胞）以及49800HER2/细胞（范围为11500～584000HER2/细胞）。18个肿瘤中的5个（即27.8%）表达超高水平的HER2（216800、234300、391000、491500和584000HER2/细胞）。平均来说，HER2表达水平比EGFR高66倍。通过对每一样品重复三次实验，验证结果的可重复性。平均变异系数（CV）对于EGFR的定量分析为22%，而对于HER2为19%。由于各实验中使用了不同的冷冻切片，这一变异考虑了生物可变性。为了确认EGFR的定量，提取每个肿瘤的总RNA用于RT-qPCR分析。观测到通过TR-FRET确定的EGFR的蛋白表达水平与通过RT-qPCR确定的EGFR的mRNA水平之间具有正线性相关（Rho=0.84，P<0.001）。为了验证使用本发明所述的方法对HER2定量分析的结果，使用HercepTestTM，并借助FISH和定量PCR分析测量编码HER2基因的扩增，对HER2的表达进行评估。这一分析的结果在图5中给出，显示通过TR-FRET确定的表达水平在HER2-HerceptestTM阳性肿瘤和HER2-HerceptestTM阴性肿瘤之间没有重叠。仅5个具有>150000HER2/细胞的乳腺肿瘤具有3+的HercepTestTM得分，且在HER2基因扩增测试中为阳性。这表明本发明所述的方法能够以100%的特异性和灵敏度检测肿瘤样品中HER2的过表达，从而对于评估患者对于靶向HER2的特定抗癌治疗（如用曲妥珠单抗、赫赛汀TM进行的治疗）的易感性特别有用。这是首次出现能够评估患者样品中每细胞的HER2蛋白数量的用于HER2定量的可靠方法（该方法例如可在医院中实施）。该方法没有免疫组织化学染色和FISH技术的缺点。实施例5通过如实施例4所述的方法对100个乳腺癌患者的肿瘤冷冻样品的HER2表达进行定量。经归一化的荧光信号的测定使得能够对HER2受体的表达进行定量测定。对每个患者的无病生存率（DFS）和总生存率（OS）进行评估。结果：在100个患者中，82个为IHC-HER2阴性（HercepTestTM阴性），包括60个ER（雌激素受体）阳性并接受激素治疗的受试者。使用Cox比例风险分析显示，IHC-HER2阴性且ER阳性的受试者中，HER2的存在与DFS的降低（p=0.0005）和OS的降低（p=0.003）均显著相关。使用根据本发明的方法对HER2表达的定量测量使得能够预期IHC-HER2阴性且ER阳性的患有乳腺癌的受试者的疾病结果（outcome）。这一生物标记物可用于识别激素治疗未充分有效且可能受益于赫赛汀TM类的抗-HER疗法的辅助治疗的患者。本发明的一个主要贡献在于能够改进对可能能对这类治疗产生响应的患者的选择。当前第1页1 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