专利名称：一种检测脂肪酶酶活的纳米金比色法的制作方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种使用纳米金作为信号元件，在水溶液中吐温即作为脂肪酶的底物又作为纳米金稳定剂的检测脂肪酶酶活的化学比色法。
背景技术：
脂肪酶(lipase E. C. 3.1.1. 3)是一类具有多种催化功能的酶，主要催化三酰甘油酯及其它一些不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，还具有水解外消旋混合物以及酯和肽键合成的能力.脂肪酶已广泛应用于食品、化工、医药合成等诸多领域。随着脂肪酶的应用领域日渐拓宽、市场规模逐步扩大，脂肪酶检测也日益重要。脂肪酶水解活性的测定方法主要有p-NPP法和恒电位自动滴定法。使用的底物主要有三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄榄油。但这些底物存在制备麻烦，需要加入乳化剂乳化，加入的乳化剂会影响酶活的测定，且有PH范围的限制，P-NPP法虽然操作简单，但是P-NPP试剂价格昂贵，且灵敏度不足的缺点。纳米金颗粒是指粒径在f 100纳米之间的金颗粒。常以金颗粒分散在水中所形成的金溶胶进行应用，故又称胶体金或金溶胶。近年来，纳米金颗粒作为一种新型的材料，凭借其独特的物理化学特性，如高比表面积、高表面反应活性、强吸附性等，在材料科学、临床医学、生命科学等领域均获得广泛的应用。13纳米直径的金颗粒的吸光系数为2. 7 X 108M-1 cm-1,比传统的有机发色团大了 3个数量级。另外，分散在溶液中的纳米金在互相聚集之后，颜色会从红色变成蓝色。因此，在比色分析法中，纳米金是一种理想的颜色信号元件。现有技术未公开以纳米金作为颜色信号元件对脂肪酶的活性进行检测的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测脂肪酶的简单廉价有效的比色分析法。此方法首次将纳米金比色法与脂肪酶天然底物结合，用于检测其酶活，具体使用吐温作为脂肪酶的特异性底物，纳米金作为信号元件。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现
一种检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，使用纳米金作为信号元件，同时以吐温作为脂肪酶的底物兼纳米金稳定剂。更确切地，本发明所述的方法具体包括如下步骤
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得酒红色纳米金溶液，
(2)向步骤(I)中得到的纳米金溶液中加入吐温溶液对纳米金进行修饰；
(3)向修饰后的纳米金溶液中加入氯化钠溶液，使得经吐温稳定的纳米金处在盐溶液
中；
(4)向步骤(3)中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度，使纳米金表面的吐温被脂肪酶水解，纳米金重新暴露到盐溶液中发生聚集，检测溶液的紫外可见光谱，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E62(i/E52(i作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。本发明所述的方法，所述步骤(I)中柠檬酸钠还原法制备的纳米金溶液的浓度为1.8-2. 5 nmol/L,纳米金的粒径为13±2 nm。优选纳米金溶液的浓度为2 nmol/L,纳米金的粒径为13 nm。具体纳米金溶液的制备可以采用现有技术公开的制备方法，如中国申请201110052259. 7所公开的，本发明对此不作特别限定。其中，所述步骤(2)中吐温溶液的浓度为3-6 mmol/L，吐温溶液与纳米金溶液的体积比为1:100-1:50，优选1:100。步骤(2)中修饰时间为10-60 min，优选30min。其中，所述步骤(3)修饰后的纳米金溶液中，氯化钠的最终浓度为O. 02-0.1mol/L,优选 O.1 mol/L。本发明所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，步骤(4)所述的缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，该缓冲液的浓度及具体用量为本领域技术人员所理解和掌握，具体以最终将纳米金溶液PH值调至6-8为准，优选6. 5。本发明所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，所述步骤(4)中，反应温度为30-60°C，优选50°C ;待测脂肪酶溶液的加入量为纳米金溶液体积的1:20-1:5，优选1:20。更具体地，本发明所述检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，包括如下步骤
(1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得浓度为1.8-2. 5 nmol/L的酒红色纳米金溶液，
(2)向步骤(I)中得到的纳米金溶液中加入吐温溶液对纳米金进行修饰；吐温溶液的浓度为3-6 mmol/L,吐温溶液与纳米金溶液的体积比为1:100-1:50 ;修饰时间为10-60min ；
(3)向修饰后的纳米金溶液中加入氯化钠溶液，使得经吐温稳定的纳米金处在盐溶液中；其中，氯化钠的最终浓度为0. 02-0. lmol/L ；
(4)向步骤(3冲得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至6-8;后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至30-60°C，使纳米金表面的吐温被脂肪酶水解，纳米金重新暴露到盐溶液中，使纳米金发生聚集，每分钟后检测溶液的紫外可见光谱，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E62(i/E52(i作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。本发明采用将一定浓度的吐温溶液加入到纳米金溶液中。一定时间后，加入一定溶度的氯化钠溶液和PB缓冲液。由于加入的吐温溶液能使纳米金抵抗盐离子，纳米金颜色没有发生变化。当向该溶液中加入一定浓度的脂肪酶后，吐温开始被脂肪酶水解，纳米金重新暴露在盐离子下，盐离子使得纳米金发生聚集，导致溶液颜色发生变化。颜色的变化与脂肪酶的酶活有关，因此能够用于检测脂肪酶的酶活。本发明所述的技术方案所采用的底物吐温溶解性好，无需传统技术所需的乳化环节，简单方便，且价格低廉。此外，本发明基于纳米比色法传感，故灵敏度高，可视化适用于高通量监测，同时吐温能在高离子强度条件下稳定纳米金，可用于实际体系中脂肪酶的检测。因此，有利于推广应用。
图1为(a) 13nm纳米金的透射电镜图；(b) 13nm纳米金聚集后的透射电镜图。图2为(a)纳米金溶液；(b)含0.1 mo I L-1氯化钠和0.01 mo I L-1磷酸缓冲液的纳米金溶液；(c)含0.1 mo I L—1氯化钠和0.01 mo I L—1磷酸缓冲液的吐温(3 mmol/L)稳定的纳米金溶液；(d)加入失活脂肪酶后，含0.1 mol L—1氯化钠和0.01 mol L—1磷酸缓冲液的吐温稳定的纳米金溶液；(e)加入脂肪酶后,含0.1 mol L—1氯化钠和0.01 mol L-1磷酸缓冲液的吐温稳定的纳米金溶液的紫外可见光谱。图3 为分别为加入脂肪酶后(a) O min ； (b) I min ； (c) 2 min ； (d) 3 min ； (e) 4min ； (f) 5 min ； (g) 6 min ； (h) 7 min ； (i) 8 min ； (j) 9 min ； (k) 10 min 后含 0.1 molL—1氯化钠和0.01 mol L—1磷酸缓冲液的吐温稳定的纳米金溶液的紫外可见光谱。图4为脂肪酶酶活的动力学曲线。
具体实施例方式实施例1
(1)纳米金溶液的制备
纳米金采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得(其透射电镜图见图la，其紫外可见光谱图见图2a)。具体的制备过程为:
将所有玻璃仪器都需要使用王水浸泡以除去玻璃容器中残留的还原性物质。准确称取HAuCl4.4H20 0.0123 g于250 mL三口烧瓶中，然后三口烧瓶中加入100 mL水。剧烈搅拌，加热沸腾回流。准确称取2水合柠檬酸钠0.2849 g于25 mL容量瓶中。取一定量的柠檬酸钠溶液，水浴加热到50 °C后快速加入烧瓶。15分钟后溶液从无色到浅蓝色再到紫色最后为酒红色，继续加热10分钟后停止加热，继续搅拌10分钟后冷却到室温。纳米金的大小与加入的柠檬酸钠的量有关。(2)纳米金溶液的修饰；向步骤(I)中得到的纳米金溶液中加入吐温溶液对纳米金进行修饰；吐温溶液的浓度为4.5 mmol/L，吐温溶液与纳米金溶液的体积比为1:100 ;修饰时间为30 min ；
(3)向修饰后的纳米金溶液中加入氯化钠溶液，使得经吐温稳定的纳米金处在盐溶液中；其中，氯化钠的最终浓度为0.05mol/L (其紫外可见光谱图见图2b)；
图2a是Iml纳米金溶液的紫外可见光谱图，只在520nm处出现吸收峰，说明纳米金呈分散状态，溶液为酒红色。图2b是Iml纳米金溶液中加入0.1 mol Γ1氯化钠和0.01 mol Γ1磷酸缓冲液的紫外可见光谱图，在650nm处出现新的吸收峰，且520nm处吸收峰降低，说明纳米金呈聚集状态，溶液成蓝色。图2c为Iml吐温(3 mmol/L)稳定的纳米金溶液中加入0.1 mol L—1氯化钠和0.01mol L—1磷酸缓冲液的紫外可见光谱图,在650nm处无新的吸收峰出现,且520nm处吸收峰基本保持不变，说明吐温保护纳米金溶液在高盐溶液中分散存在。图2d为Iml吐温(3 mmol/L)稳定的纳米金溶液中加入0.1 mol L—1氯化钠、0.01mol L—1磷酸缓冲液和0.2 mg/ml失活的脂肪酶的紫外可见光谱图,在650nm处无新的吸收峰出现，说明失活的脂肪酶无法水解吐温，从而无法引起纳米金聚集。
图2e为Iml吐温(3 mmol/L)稳定的纳米金溶液中加入0.1 mol L—1氯化钠、0.01mol L4磷酸缓冲液和0.2 mg/ml脂肪酶的紫外可见光谱图,在650nm处出现新的吸收峰,且520nm处吸收峰降低，说明吐温被脂肪酶水解，纳米金直接暴露到高盐溶液中，发生聚集。(4)向步骤(3)中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至
6.5 ;后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至50°C，使纳米金表面的吐温被脂肪酶水解，纳米金重新暴露到盐溶液中，使纳米金发生聚集(其透射电镜图见图lb，其紫外可见光谱图见图2c)，颜色由酒红色变为紫色。每分钟后检测溶液的紫外可见光谱，得到不同时间对应的紫外可见光谱(见图3)，然后使用吸光度比值E62tZE52tl作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线(见图4)。图3是在I ml的纳米金溶液中加入50 μ L的4mg/ml脂肪酶在不同时间下的紫外可见光谱图时间依次为(a) O min ； (b) I min ； (c) 2 min ； (d) 3 min ； (e) 4 min ； (f) 5min ； (g) 6 min ； (h) 7 min ； (i)8 min ； (j) 9 min ； (k) 10 min ;随着时间的增加,在 650nm附近的吸收峰越来越大，而在520nm处的峰逐渐下降，因此本发明选用E65(l/E52(l的比值为纵坐标作图，比值越大表示聚集的程度越大，即吐温被脂肪酶水解的越多。因此，比值变化的速率越快就是脂肪酶酶活越大。图4是跟据向纳米金溶液中加入脂肪酶后不同时间下(1-10 min)测得的紫外可见光谱后，以吸光度比值E65tZE52tl作为纵坐标，酶水解反应时间作为横坐标，绘制的酶学动力学标准曲线。可以看到，随着反应时间的增加，E650/E520比值越大，表示吐温被逐渐被水解，纳米金的聚集程度越大。因此，本发明可以根据E65(i/E52(i的比值对脂肪酶酶活进行分析检测。实施例2
与实施例1相比，区别点仅在于步骤1-4的操作参数不同，本实施例具体为:
(1)纳米金溶液的浓度为1.8nmol/L,纳米金的粒径为13nm ;
(2)纳米金溶液的修饰；向步骤(I)中得到的纳米金溶液中加入吐温溶液对纳米金进行修饰；吐温溶液的浓度为3 mmol/L，吐温溶液与纳米金溶液的体积比为1:50 ;修饰时间为 10 min ；
(3)向修饰后的纳米金溶液中加入氯化钠溶液，使得经吐温稳定的纳米金处在盐溶液中；其中，氯化钠的最终浓度为0.02mol/L ；
(4)向步骤(3)中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至6;后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至30°C，使纳米金表面的吐温被脂肪酶水解，纳米金重新暴露到盐溶液中，使纳米金发生聚集，每分钟后检测溶液的紫外可见光谱，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后使用吸光度比值E62(i/E52(i作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。实施例3
与实施例1相比，区别点仅在于步骤1-4的操作参数不同，本实施例具体为:
(1)纳米金溶液的浓度为2.5 nmol/L，纳米金的粒径为20 nm ；
(2)纳米金溶液的修饰；向步骤(I)中得到的纳米金溶液中加入吐温溶液对纳米金进行修饰；吐温溶液的浓度为6 mmol/L，吐温溶液与纳米金溶液的体积比为1:80 ;修饰时间为 60 min ； (3)向修饰后的纳米金溶液中加入氯化钠溶液，使得经吐温稳定的纳米金处在盐溶液中；其中，氯化钠的最终浓度为O. lmol/L ；
(4)向步骤(3)中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节，将pH值调至8;后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度至60°C，使纳米金表面的吐温被脂肪酶水解，纳米金重新暴露到盐溶液中，使纳米金发生聚集，每分钟后检测溶液的紫外可见光谱，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后使用吸光度比值E62(i/E52(i作为纵坐标，时间为横坐标，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，使用纳米金作为信号元件，同时以吐温作为脂肪酶的底物兼纳米金稳定剂。
2.根据权利要求1所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，具体包括如下步骤: (1)采用柠檬酸钠还原氯金酸制得酒红色纳米金溶液， (2)向步骤(I)中得到的纳米金溶液中加入吐温溶液对纳米金进行修饰； (3)向修饰后的纳米金溶液中加入氯化钠溶液，使得经吐温稳定的纳米金处在盐溶液中； (4)向步骤(3)中得到的纳米金溶液加入缓冲溶液进行pH的调节；后加入待测脂肪酶溶液，混匀，调节反应温度，使纳米金表面的吐温被脂肪酶水解，纳米金重新暴露到盐溶液中发生聚集；对溶液进行检测，得到不同时间对应的紫外可见光谱，然后以吸光度比值E62tl/E52tl作为纵坐标，时间为横坐标 ，绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
3.根据权利要求1所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(I)中柠檬酸钠还原法制备的纳米金溶液的浓度为1.8-2.5 nmol/L，纳米金的粒径为13±2nm0
4.根据权利要求3所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(I)中柠檬酸钠还原法制备的纳米金溶液的浓度为2 nmol/L，纳米金的粒径为13 nm。
5.根据权利要求1所述的检脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(2)中吐温溶液的浓度为3-6 mmol/L，吐温溶液与纳米金溶液的体积比为1:100-1:50，优选1:100。
6.根据权利要求1所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(2)中修饰时间为10-60 min，优选30min。
7.根据权利要求1所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(3)修饰后的纳米金溶液中，氯化钠的最终浓度为0.02-0.lmol/L，优选0.1 mol/L。
8.根据权利要求1所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述的缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液。
9.根据权利要求1所述的检测脂肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤(4)中加入缓冲溶液将纳米金溶液的PH值调至6-8，优选6.5。
10.根据权利要求1所述的检测肪酶酶活的纳米金比色法，其特征在于，所述步骤4中，反应温度为30-60°C，优选50°C ;加入的待测脂肪酶溶液的最终浓度为0.15-0.25 mg/ml,优选 0.2 mg/ml ο
全文摘要
本发明公开了一种在水溶液中快速、方便地检测脂肪酶酶活的比色分析法。本发明利用了纳米金具有高吸光系数的特点，将纳米金作为显色信号元件，同时吐温即作为脂肪酶的底物又作为纳米金稳定剂，抵抗高浓度盐离子。发展出一种具有成本低、操作简单、方便快捷的特点的比色分析法。本发明采用的吐温具有两亲性，无需乳化过程，且其稳定的纳米金很稳定，抵抗高浓度盐离子的能力很强，适宜推广应用。
文档编号G01N21/33GK103076326SQ201310007340
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月9日 优先权日2013年1月9日
发明者田丹碧, 宋荣斌, 黄和, 江凌, 邹冰花 申请人:南京工业大学