一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法。本发明采用高效液相制备色谱法，色谱条件为：聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色谱柱：MKF-EP-RP，5～12μm，(150～600)×(7.0～20.0)mm(I.D.)，流动相组成为：乙腈∶水＝45～60∶55～40(体积比)，流速为：1.0～3mL／min，检测波长：229nm；进样量：20～100μL；本发明克服了硅胶等介质的不可逆吸附以及工艺流程复杂的缺点，经一步分离即可得到98％以上的紫杉醇纯品。
【专利说明】一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法
(—)
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效液相制备色谱(HPLC)分离方法，具体涉及一种以聚苯乙烯凝胶色谱介质为载体的分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法。
(二)
【背景技术】
[0002]紫杉醇是从红豆杉属植物中分离得到的并且具有广谱抗癌活性的二萜类化合物。它具有独特的抗癌机制，对治疗卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等多种癌症均有良好的疗效。近年来，它已成为天然植物药物领域中最热门的新药，需求量与日俱增。由于紫杉醇主要来源于红豆杉的树皮，资源匮乏、含量低微，且临床应用中对紫杉醇的纯度要求较高，因此分离提取得到高纯度的紫杉醇将是一个浩大而复杂的工程。在对紫杉醇进行分离纯化时常会碰到的一个问题就是紫杉醇与三尖杉宁碱的分离。由于这两种物质的结构非常相似，只有C-13侧链末端结构不同，因而两者的色谱行为差别很小，用常规的柱色谱和薄层色谱很难将这二者分开。
[0003]针对紫杉醇与三尖杉宁碱类紫杉烷类化合物的分析分离，国内外已做了大量研究，并取得了一定的效果，但大多数都采用的是以硅胶基质为色谱柱的高效液相色谱法(HPLC)[参见:田桂莲，张志强，苏志国.苯基-硅胶色谱介质的合成及其在紫杉醇提纯中的应用.色谱.2001，19(1):47-50]。虽然该色谱柱经过两步修饰即胺基功能化及苯环衍生化，但仍需经多步分离也仅得到纯度不到80%的紫杉醇纯品。随着色谱介质的发展，大孔树脂[李勇超，杨靖，职明星，等.D4020大孔树脂提纯发酵液中的紫杉醇的研究[J].食品与生物技术学报.2009，29 (5) =710-714]成为了焦点，它是一种有机高分子聚合物吸附剂，且在天然产物的分离纯化方面有着广泛的应用。李勇超等人使用该树脂提纯发酵液中紫杉醇，回收率可达到87%，说明该树脂能较好的吸附-解吸附紫杉醇，但该工艺过程中使用不同浓度的甲醇和乙醇水溶液分别对树脂进行吸附和解吸附处理，且仅说明了该方法对去除色素类杂质有明显效果，未具体指出紫杉醇与其类似的紫杉烷类化合物的分离及纯度。中国专利CN1054382C(申请号96102442.9)公开了一种以大孔树脂分离紫杉醇的方法，即先将紫杉烷类化合物富集在固体吸附剂上，再使用有机溶剂的水溶液进行洗脱，分步收集馏分，浓缩后再次进行柱分离。该方法工艺过程繁琐，且分离条件未进行优化。为此寻找一种操作简单且分离条件完善的提取紫杉醇的方法，对于紫杉醇的制备及工业生产具有深远的意义。
[0004]因此，本发明采用均匀、耐压和耐酸碱的聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微球为填料，优化流动相种类和比例，可经一步色谱法使紫杉醇与三尖杉宁碱达到分离，操作方法简便、闻效。
(三)
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术的工艺复杂等缺点，介绍了一种简单的分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法。 本发明的技术方案如下，即一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法，其特点在于采用一种均匀、耐压、多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为固定相的高聚物制备色谱柱，高效液相制备色谱操作条件为:
a.聚苯乙烯凝胶色谱柱=MKF-EP-RP,5?12 μ m，柱长:150?600，柱径7.0?20mm(1.D.)；
b.流动相:乙腈/水=40?75/60?25(体积比);乙醇/水=50?75/50?25 ；
c.流速:1.0?3.0mL/min，进样量:10?200 μ L，柱温:室温；
d.采用UV检测器，检测波长为229nm。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下:
1、整个分析周期短，色谱分离全过程仅约40min。
2、经一步分离即可得到99.1 %纯度的紫杉醇，且操作方法简单。
3、本发明同样能在常规高效液相色谱仪上进行操作，不限于昂贵的中、低压制备色谱，因此对仪器的要求低，方法普及性好。
4、在AKTAexplorerlOO制备型色谱仪器上放大制备紫杉醇，可得到98%以上纯度的紫杉醇，方法稳定性好。
(四)【专利附图】
【附图说明】:
图1为本发明的举例方法效果图之一，即具体条件:紫杉醇与三尖杉宁碱在聚苯乙烯凝胶色谱柱=MKF-EP-RP型制备色谱柱(8 μ m, 300 X 7.8m (1.D.))中的HPLC图，流动相:乙腈/水=60:40(体积比);流速:lmL/min ;进样物质分别为供试品_1,_3和4,图1中1、2分别代表三尖杉宁碱和紫杉醇。图1为本发明的举例方法效果图之一，其它举例方法图不
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图1液相色谱图
(五)
【具体实施方式】
实验器材及试剂:
(1)实验仪器:
戴安Summit型高效液相色谱系统(美国戴安公司)；AB SCIEXAPI2000LC-MS/MS液质仪；AKTA explorerlOO制备型色谱系统(通用电器医疗集团)；
(2)色谱柱:
MKF-EP-RP 型制备柱:300mmX7.8mm(1.d.)，8ym，两只；200mmX8.0mm(1.d.)，8 μ m ;150mmX20mm(i.d.), 10 μ m ;300mmX7.8mm(1.d.), 12 μ m,两只；300mmX7.8mm(1.d.), 10 μ m ；MKF-DK-RP 制备柱:150mmX 10mm (i.d.), 12 μ m ；300mmX 10mm (i.d.)，12 μ m ;150mmX 20mm(1.d.), 8 μ m ;300mmX 20mm(1.d.), 12 μ m ;150mmX20mm(i.d.), 12 μ m。(南京麦科菲高效分离载体有限公司)
(3)实验试剂:
紫杉醇标样(纯度为93.6% );三尖杉宁碱标样(纯度82.9% );发酵液(紫杉醇含量为33.9% ;三尖杉宁碱含量为33.3% );色谱纯乙醇；色谱纯乙腈；高效液相去离子水。供试品的配制: 供试品-1:取发酵液0.5ml至20ml的容量瓶中，用甲醇定容至20ml，待测(现用现配)
供试品-2:取紫杉醇标准品约10mg，精密称定，用甲醇溶剂定容至10ml，待测(现用现配)
供试品-3:取三尖杉宁碱标准品约10mg，精密称定，用甲醇溶剂定容至10ml，待测(现用现配)
供试品-4:取发酵液Iml至20ml的容量瓶中，用甲醇定容至20ml，待测(现用现配)
实施例1
色谱条件:检测机器:戴安Summit型高效液相色谱系统；
色谱柱:MKF-EP-RP(300mmX7.8mm，8ym);流动相:乙腈(B)/水(A) = 75:25(体积比，以下同上);流速:lmL/min ;检测波长:229nm ;进样量:20 μ L ;进样物质:供试品_1，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为0.84。
实施例2
色谱条件:检测机器:戴安Summit型高效液相色谱系统；
色谱柱:MKF-EP_RP(200mmX8.0mm,8 μ m);流动相:乙腈(B)/水(A) = 60:40(体积比，以下同上);流速:lmL/min ;检测波长:229nm ;进样量:20 μ L ;进样物质:供试品_2，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.04。
实施例3
色谱条件:检测机器:戴安Summit型高效液相色谱系统；
色谱柱=MKF-EP-RP (600mm X 7.8mm, 12 μ m)；流动相:乙腈(B) / 水(A) = 50:50 (体积比，以下同上)；流速:1.5mL/min ;检测波长:229nm ;进样量:20 μ L ;进样物质:供试品-3，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.27。
实施例4
色谱条件:检测机器:戴安Summit型高效液相色谱系统；
色谱柱:MKF-EP-RP (300mmX 7.8mm, 10 μ m);流动相:乙腈(B)/ 水(A) = 40:60 ;流速:1.5mL/min ;检测波长:254nm ;进样量:10μ L ;进样物质:供试品_1，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.52。
实施例5
色谱条件:检测机器:戴安Summit型高效液相色谱系统；
色谱柱=MKF-EP-RP (600mmX 7.8mm, 8 μ m);流动相:乙醇(B)/ 水(A) = 75:25 ;流速:1.0mL/min ;检测波长:254nm ;进样量:10μ L ;进样物质:供试品_1，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为0.92。
实施例6
色谱条件:检测机器:戴安Summit型高效液相色谱系统；
色谱柱:MKF-EP-RP(300mmX7.8mm，8ym);流动相:乙醇(B)/水(A) = 55:45 ;流速:1.0mL/min ;检测波长:254nm ;进样量:10μ L ;进样物质:供试品_1，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.36。
实施例7
色谱条件:检测机器:AKTA explorerlOO制备型色谱系统；
色谱柱:MKF-DK-RP (150mmX 20mm, 8 μ m);流动相:乙腈(B)/ 水(A) = 60:40 ;流速:lmL/min ;检测波长:229nm ;进样量:10y L ;进样物质:供试品_4，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.45。
实施例8
色谱条件:检测机器:AKTA explorerlOO制备型色谱系统；
色谱柱:MKF-DK-RP (450mmX 10mm, 12 μ m);流动相:乙腈(B)/ 水(A) = 65:35 ;流速:2mL/min ;检测波长:229nm ;进样量:100μ L ;进样物质:供试品_4，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.17。
实施例9
色谱条件:检测机器:AKTA explorerlOO制备型色谱系统；
色谱柱:MKF-DK-RP (450mmX 20mm, 12 μ m);流动相:乙腈(B)/ 水(A) = 60:40 ;流速:3mL/min ;检测波长:254nm ;进样量:200 μ L ;进样物质:供试品_4，测得紫杉醇与三尖杉宁碱的分离度R为1.32。
【权利要求】
1.一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法，其特征在于使用高效液相制备色谱，高效液相制备色谱条件为: ￡1.高聚物色谱柱的选用:聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，粒径:5?129111，柱长:150?600臟，柱内径7.0?20麵； 匕流动相:乙腈/水的体积比为40?75 / 60?25 ；或乙醇/水的体积比为55?75 / 45 ?25 ； 0.流速:1.0?3.011^ /砧!!，进样量:10?200 9匕柱温:室温； (1.采用—检测器，检测波长为225咖?254111
2.根据权利要求1所述的一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法，其特征在于所述的高聚物色谱柱为型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物色谱固定相充填。
3.根据权利要求1所述的一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法，其特征在于该方法使用流动相为:乙醇丨水，其体积比为:55?75 / 45?25或乙腈丨水，其体积比为:40?75 / 60?25，可以用等度洗脱，也可以用梯度洗脱方式。
4.根据权利要求1所述的一种分离、纯化紫杉醇与三尖杉宁碱的制备方法，其特征在于该高聚物色谱柱的选用:柱长:150?300臟，柱内径9.0?20.0臟；或200-600臟，柱内径7.0?9.0臟。
【文档编号】G01N30/88GK104422749SQ201310395925
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】刘晓宁, 黄艳, 魏荣卿 申请人:南京工业大学