牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法、培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物内生菌分离培养技术，具体涉及牡丹营养器官内生细菌的分离纯 化方法，以及分离纯化操作中使用的培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物内生菌一般是指生活史的某一阶段生活在植物组织内，对植物生长发育没有 引起明显病害症状的一类微生物，如真菌、细菌、放线菌等。植物内生菌往往是植物在特定 生境中不同类型微生物经过长期的协同进化形成的一种稳定的共生或寄生关系，内生菌一 些生理活性特征与土著微生物类群往往存在差异，是筛选特定菌株、产功能酶菌株或农业 生防菌株的良好材料来源。近年来，关于植物内生菌的文献报道逐渐增多。
[0003]目前，细菌分离培养基最为经典和通用的是牛肉膏蛋白胨培养基，其配方如下： 牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂粉15~20g/L，蒸馏水定容至1000mL，自然 pH7. 0~7. 2,121°C高压蒸汽灭菌20min。该培养基应用极为广泛，为各种材料细菌的分离 培养做出了重要贡献。但随着微生物科学研究领域的不断拓展和深入，传统的细菌培养基 配方及其制备方法也面临一些窘境，突出的问题主要表现在以下几个方面：（1)培养基配 方缺乏持续创新，单一配方经过长期反复使用，使得细菌筛选时菌株的多样性受到严重制 约；（2)在使用特殊材料筛选细菌时，传统的细菌培养基配方并没有很好的针对性，往往达 不到理想的试验效果，如昆虫内生细菌、植物内生细菌等；因为缺乏培养基创新，因重复筛 选造成的试验耗材及试验时间的浪费也成为一个不可小觑的问题。
[0004] 在一些文献报道中，细菌培养基配方有时也会做一些调整，但根本性的调整并不 多，所以，微生物研究中常见菌的重复筛选已经成为制约相关试验研究的瓶颈问题。资料显 示，微生物资源的多样性，远没有得到充分的开发和利用，人们所能分离培养的微生物种类 仅占总量的1~2%，足见不断创新和改良培养基的必要性和重要的现实意义。
[0005] 牡丹Paeoniasuffruticosa隶属于毛茛科Ranunculaceae苟药属，牡丹花雍容华 贵，气势奔放，被誉为"花中之王"。牡丹产业发展迅速，在栽培、观赏、药用、瓷艺、精油、化妆 品、膳食等方面均已得到长足发展，形势喜人。但关于牡丹内生菌方面的研究鲜见报道，营 养器官内生细菌方面的研究更是空白，因此创新牡丹内生细菌分离的培养基配方，明确牡 丹内生细菌分离培养基配方及其制备技术，不仅能拓展微生物资源筛选途径，为下游研究 提供技术支撑，还能提高牡丹内生细菌筛出菌株的多样性，丰富牡丹内生菌开发利用理论， 尽量减少不必要的重复筛选，为稀有种类的筛出提供更多可能，意义重大。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种专门针对牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基。
[0007] 同时，本发明还提供一种上述分离纯化培养基的制备方法。
[0008] 最后，本发明还提供一种牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法。
[0009] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉 1. 5~2. 5g，酵母粉4~6g，吉兰糖胶1. 5~2. 5g，海藻糖0? 2~lg，菊糖0? 1~lg，NaCl 8~10g，牡丹根际土壤浸提液150~250mL，琼脂粉14~18g，余量为蒸馏水。
[0011] 金蝉干粉为金蝉老熟若虫经灭菌、干燥、破碎处理后得到的粉末。其中灭菌、干燥、 破碎处理均可采用本领域常规操作，比如干燥可焙干、烘干或冻干。具体的，金蝉干粉可参 照下述步骤制备：取金蝉老熟若虫若干，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min，再置于恒温干 燥箱中90°C条件下过夜烘干，取出剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过160~180目 筛，即得金蝴干粉。
[0012] 牡丹根际土壤浸提液即牡丹根际土壤加水浸提后得到的提取液，比如每500mL水 中加入200~400g牡丹根际细土，浸提操作为本领域常规技术。具体的，牡丹根际土壤浸 提液可参照下述步骤制备：取牡丹根际土壤若干，（手工）去杂后过40~60目筛得根际细 土，取300g根际细土置于1000mL三角瓶中，加入500mL蒸馏水，于室温、220r/min下摇床振 荡2h，之后静置30min，将上清倒入砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根基土壤浸提液。
[0013] 优选的，牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为： 金虫单干粉2g，酵母粉5g，吉兰糖胶2g，海藻糖0. 5g，菊糖0. 3g，NaCl9g，牡丹根际土壤浸提 液200mL，琼脂粉16g，余量为蒸馏水。
[0014] 牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0015] 1)将海藻糖0. 2~lg、菊糖0. 1~lg加入蒸馏水中，于98~105°C条件下高压蒸 汽灭菌20~30min，静置，再于98~105°C条件下高压蒸汽灭菌20~30min，得溶液A备 用；
[0016] 2)将金蝉干粉1. 5~2. 5g、酵母粉4~6g、吉兰糖胶1. 5~2. 5g、NaCl8~10g、 琼脂粉14~18g和牡丹根际土壤浸提液150~250mL加入蒸馏水中，灭菌，得溶液B备用；
[0017] 3)将溶液A、溶液B混合后定容至1000mL，即得。
[0018] 步骤1)中静置可采用37°C恒温静置，静置时间为18~30h(优选24h)，其是为了 给经过第一次灭菌后未被杀死的耐高温芽孢菌复苏生长的时间，芽孢抗高温能力强，经过 第一次热刺激后，会复苏生长，处于生长状态的菌体经过第二次灭菌处理则很容易被杀死。
[0019] 步骤1)、2)中蒸馏水均可适当取用，两次用量之和不超过1000mL即可。
[0020] 步骤2)中金蝉干粉、牡丹根际土壤浸提液的制备同上。
[0021] 步骤2)中灭菌前可调节混合液pH值至中性。
[0022] 步骤2)中灭菌为常规灭菌操作，S卩121°C条件下高压蒸汽灭菌20~30min。
[0023] 步骤3)中混合、定容操作均要求在无菌条件下进行，定容用蒸馏水要求无菌。
[0024] 牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0025] 1)取牡丹当年生健康营养器官（如根、莖、叶，根茎可剪成小段），冲洗净，将非正 常裸露的部位用融化的石蜡封口（如根、茎的两端及叶的叶柄切口处），再用无菌水冲洗；
[0026] 2)转入浓度65~75%乙醇溶液中进行表面消毒处理（3~10min)，再用0. 05~ 0. 15mol/L升萊消毒（3~5min)，（无菌操作条件下）将封口的石錯剪去，剩余部分破碎处 理后，静置沉淀，取上清液接种到牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基中，30~35°C 条件下恒温培养（2~3天）；
[0027] 3)挑取单菌落（要求差异明显、特征典型），分别进行划线纯化（每个单菌落连续 划线纯化3次以上），得到不同单菌落的活体纯培养物。
[0028] 步骤2)中采用浓度70%乙醇溶液和0. lmol/L升汞。
[0029] 步骤3)后可采用菌落特征、常规生理生化指标测定和16SrDNA序列分析相结合 的方法，对得到的典型菌株进行初步鉴定。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 不同的培养基配方适合不同的微生物种类生长，用料成分的差异，甚至是微量成 分的调整，都会使筛出菌株的数量和类型有所不同，没有任何一种培养基能够同时满足所 有微生物的生长需求，对于特殊生境的微生物种群来说，要想达到理想的分离和培养效果， 创新和完善筛选培养基配方，是一项无法规避的重要工作。本发明通过不断的探索、优化， 摸索出一种专