门针对牡丹营养器官内生菌分离培养的培养基配方，经试验证明对内生细菌 具有良好的分离和培养效果。
[0032] 在本发明中，将金蝉老熟若虫干粉引入培养基，是基于金蝉若虫在地下一般经历 2~3年，甚至长达12~13的生长发育时间，期间以吸食植物根部汁液为食，经过长时间的 营养积累，最终作为一个能量的储存体成为一个老熟若虫。有资料显示，每l〇〇g金蝉若虫 富含蛋白质72g、脂肪15g、灰分1. 8g，还含有钙、磷、铁和多种维生素、氨基酸等，因此金蝉 是制备细菌微生物培养基的良好用料。在培养基中金蝉干粉营养物质与配方中的酵母粉互 为补充，旨在满足内生细菌对营养的需求。
[0033] 菊糖是果糖通过0 -(2 - 1)键连接而成的寡糖或多糖存在形式，且终端含有一个 葡萄糖分子。从分子结构上来说，添加菊糖更加有利于具有不同糖源（或碳源）利用能力 的微生物的生长，其广谱性要高于单一使用其他形式的单糖、寡糖和多糖。在微生物培养基 中添加菊糖有利于保持试验样品本底微生物的多样性。除结构上的特殊性外，菊糖还具有 良好的保湿性和热稳定性，这都对提高培养基的品质具有直接的影响，因此菊糖是良好的 细菌培养基用料。
[0034] 培养基配方中添加的吉兰糖胶和海藻糖均既有提供能源、刺激细胞生长的作用， 还有非特异性保护作用，其主要作用原理是二者具有防治菌体细胞干燥脱水、稳定新陈代 谢的独特作用。所以吉兰糖胶和海藻糖对保护弱势菌株、降低菌体死亡率和增强适应性方 面具有积极的意义，尤其是对植物内生菌的筛选具有更加明显的作用。
[0035] 培养基中配合使用牡丹根际土壤浸提液是基于平衡营养的考虑，尤其是对微量元 素的平衡。牡丹根际土壤浸提液是一种更加接近于牡丹内生菌生长的天然营养液，它的添 加对保存和提高牡丹内生细菌代谢的生理活性和存活几率也起着辅助作用。
[0036] 在牡丹营养器官内生细菌的分离和培养过程中，内生细菌生境渗透压的改变是难 以避免的，为了缓冲渗透压剧烈改变对菌体生长的影响，特意将培养基中氯化钠成分控制 在生理盐水的离子浓度9%左右，以利于保护更多内生细菌的生长。
[0037] 本发明中培养基整体上用料搭配精当，在核心成分的选择上有独到之处，既适合 细菌的分离培养，也可用于划线纯化，实际使用效果良好。与传统培养基相比，可鉴定出的 菌株种类丰富，多样性优势明显。另外，对其他类型植物内生细菌的分离培养也有很好的借 鉴意义。
[0038] 本发明中培养基的制备方法简单，便于操作，具有良好的推广应用价值。在培养基 制备过程中，海藻糖和菊糖在98~105°C条件下高压蒸汽灭菌2次，是因为糖类在121°C常 规灭菌温度下结构往往受到破坏，而98~105°C条件下高压蒸汽灭菌2次后，绝大部分微生 物即可杀死。能形成芽孢的菌体，当受到98~105°C热胁迫后就会复苏生长，解除芽孢状 态，在第二次灭菌时即可杀死，以上处理方法在实践操作中已取得良好的效果。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成 为：金蝴干粉2g，酵母粉5g，吉兰糖胶2g，海藻糖0. 5g，菊糖0. 3g，NaCl9g，牡丹根际土壤 浸提液200mL，琼脂粉16g，余量为蒸馏水，pH7. 0。
[0042] 牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0043] 1)金蝉干粉的制备：
[0044] 称取金蝉老熟若虫适量，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min后，置于恒温干燥箱 90°C条件下过夜烘干，剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过160目筛，即得金蝉干粉；
[0045] 2)牡丹根际土壤浸提液的制备：
[0046] 取牡丹根际土壤若干，手工去杂后，再过40目筛，制得根际细土 300g，将细土置于 1000mL三角瓶，加蒸馏水500mL，室温、220r/min摇床震荡2h，之后静置30min，将上清倒入 砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根际土壤浸提液；
[0047] 3)称取海藻糖0. 5g、菊糖0. 3g，依次缓慢加入装有500mL蒸馏水的烧杯中进行溶 解，搅拌均匀后转入三角瓶，l〇5°C条件下高压蒸汽灭菌20min后，于恒温箱37°C放置48h， 再在105°C条件下高压蒸汽灭菌30min，最后置于65°C恒温箱中，备用；
[0048] 4)分别称取吉兰糖胶2g、金蝉干粉2g、酵母粉5g、NaCl9g和琼脂粉16g，依次加 入200mL蒸馏水和200mL牡丹根际土壤浸提液的混合液中，将pH值调至7. 0,蒸馏水定容至 500mL，转入三角瓶中，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至65°C(左右均可），无菌操 作条件下与步骤3)的备用液混合，摇匀后倒板，所得平板即为牡丹营养器官内生细菌分离 平板。
[0049] 本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0050] 1)分别取牡丹Paeoniasuffruticosa的当年生健康营养器官根、莖、叶，先用自 来水冲洗，将根、茎剪成5cm的小段，两端用融化的石蜡封口，叶的叶柄切口处也用石蜡封 口，之后分别用无菌水冲洗三次；
[0051] 2)转入70%乙醇溶液表面消毒5111；[11，再用0.11]1〇1凡升萊消毒3111；[11，无菌操作条 件下将封口石蜡剪去，将剩余的部分放入研钵充分研磨和混匀，静置沉淀后取适量上清液 涂布于固体分离培养基，于30°C条件下恒温培养48h;
[0052] 同时以传统的牛肉膏蛋白胨细菌培养基（配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠 5g，琼脂粉20g，蒸馏水lOOOmL)作为对照，各涂15个平板；
[0053] 3)用接种环挑取差异明显、特征典型的不同单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌 落连续划线3次，获取不同单菌落的活体纯培养物。
[0054] 采用菌落特征、常规生理生化指标测定和16SrDNA序列分析相结合的方法，对获 得的典型菌株进行初步鉴定。结果显示，菌株在本发明的分离培养基上生长良好，数量多， 重复性好，菌落特征多样，鉴定出的种类丰富，主要种属名录见下表1，与传统配方分离获得 的牡丹内生细菌种类相比，在多样性上具有明显优势。
[0055] 表1采用不同培养基分离、纯化和鉴定的牡丹内生细菌种类
[0056]
[0057] 实施例2
[0058] 本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成 为：金蝴干粉1. 5g，酵母粉6g，吉兰糖胶2. 5g，海藻糖lg，菊糖0.lg，NaCl8g，牡丹根际土 壤浸提液250mL，琼脂粉18g，余量为蒸馏水，pH7. 0。
[0059] 牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0060] 1)金蝉干粉的制备：
[0061] 称取金蝉老熟若虫适量，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min后，置于恒温干燥箱 90°C条件下过夜烘干，剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过160目筛，即得金蝉干粉；
[0062] 2)牡丹根际土壤浸提液的制备：
[0063] 取牡丹根际土壤若干，手工去杂后，再过40目筛，制得根际细土 200g，将细土置于 1000mL三角瓶，加蒸馏水500mL，室温、220r/min摇床震荡2h，之后静置30min，将上清倒入 砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根际土壤浸提液；
[0064] 3)称取海藻糖lg、菊糖0.lg，依次缓慢加入装有300mL蒸馏水的烧杯中进行溶解， 搅拌均匀后转入三角瓶，98°C条件下高压蒸汽灭菌30min后，于恒温箱37°C放置48h，再在 98°C条件下高压蒸汽灭菌25min，最后