置于65°C恒温箱中，备用；
[0065] 4)分别称取吉兰糖胶2. 5g、金蝉干粉1. 5g、酵母粉6g、NaCl8g和琼脂粉18g，依 次加入300mL蒸馏水和250mL牡丹根际土壤浸提液的混合液中，将pH值调至7. 0,转入三 角瓶中，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至65°C(左右均可），无菌操作条件下与步 骤3)的备用液混合，定容至1000mL，摇匀后倒板，所得平板即为牡丹营养器官内生细菌分 尚平板。
[0066] 本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0067] 1)分别取牡丹Paeoniasuffruticosa的当年生健康营养器官根、莖、叶，先用自 来水冲洗，将根、茎剪成5cm的小段，两端用融化的石蜡封口，叶的叶柄切口处也用石蜡封 口，之后分别用无菌水冲洗三次；
[0068] 2)转入65%乙醇溶液表面消毒8min，再用0. 05mol/L升汞消毒5min，无菌操作条 件下将封口石蜡剪去，将剩余的部分放入研钵充分研磨和混匀，静置沉淀后取适量上清液 涂布于固体分离培养基，于33°C条件下恒温培养54h;
[0069] 3)用接种环挑取差异明显、特征典型的不同单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌 落连续划线3次，获取不同单菌落的活体纯培养物。
[0070] 实施例3
[0071] 本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成 为：金蝴干粉2. 5g，酵母粉4g，吉兰糖胶1. 5g，海藻糖0. 2g，菊糖lg，NaCl10g，牡丹根际土 壤浸提液150mL，琼脂粉14g，余量为蒸馏水，pH7. 0。
[0072] 牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，包括以下步骤：
[0073] 1)金蝉干粉的制备：
[0074] 称取金蝉老熟若虫适量，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min后，置于恒温干燥箱 90°C条件下过夜烘干，剪去前足后，用研钵研碎至无明显颗粒，过180目筛，即得金蝉干粉；
[0075] 2)牡丹根际土壤浸提液的制备：
[0076] 取牡丹根际土壤若干，手工去杂后，再过60目筛，制得根际细土 400g，将细土置于 1000mL三角瓶，加蒸馏水500mL，室温、220r/min摇床震荡2h，之后静置30min，将上清倒入 砂芯过滤器过滤，滤液即为牡丹根际土壤浸提液；
[0077] 3)称取海藻糖0. 2g、菊糖lg，依次缓慢加入装有500mL蒸馏水的烧杯中进行溶 解，搅拌均匀后转入三角瓶，l〇l°C条件下蒸汽灭菌25min后，于恒温箱37°C放置48h，再在 101°C条件下蒸汽灭菌30min，最后置于65°C恒温箱中，备用；
[0078] 4)分别称取吉兰糖胶1. 5g、金蝉干粉2. 5g、酵母粉4g、NaCl10g和琼脂粉14g，依 次加入300mL蒸馏水和150mL牡丹根际土壤浸提液的混合液中，将pH值调至7. 0,蒸馏水定 容至500mL，转入三角瓶中，121°C条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至65°C(左右均可），无 菌操作条件下与步骤3)的备用液混合，摇匀后倒板，所得平板即为牡丹营养器官内生细菌 分离平板。
[0079] 本实施例中牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，包括以下步骤：
[0080] 1)分别取牡丹Paeoniasuffruticosa的当年生健康营养器官根、莖、叶，先用自 来水冲洗，将根、茎剪成5cm的小段，两端用融化的石蜡封口，叶的叶柄切口处也用石蜡封 口，之后分别用无菌水冲洗三次；
[0081] 2)转入75%乙醇溶液表面消毒3111；[11，再用0.151]1〇1凡升萊消毒3111；[11，无菌操作条 件下将封口石蜡剪去，将剩余的部分放入研钵充分研磨和混匀，静置沉淀后取适量上清液 涂布于固体分离培养基，于35°C条件下恒温培养48h;
[0082] 3)用接种环挑取差异明显、特征典型的不同单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌 落连续划线3次，获取不同单菌落的活体纯培养物。
【主权项】
1. 牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，其特征在于：每1000 mL培养基的组成 为：金蝴干粉1. 5~2. 5g，酵母粉4~6g，吉兰糖胶1. 5~2. 5g，海藻糖0. 2~lg，菊糖 0. 1~lg，NaCl 8~10g，牡丹根际土壤浸提液150~250mL，琼脂粉14~18g，余量为蒸馏 水。2. 根据权利要求1所述的牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，其特征在于：每 1000 mL培养基的组成为：金蝉干粉2g，酵母粉5g，吉兰糖胶2g，海藻糖0. 5g，菊糖0. 3g， NaCl 9g，牡丹根际土壤浸提液200mL，琼脂粉16g，余量为蒸馏水。3. 根据权利要求1或2所述的牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，其特征在于： 金蝉干粉为金蝉老熟若虫经灭菌、干燥、破碎处理后得到的粉末。4. 根据权利要求1或2所述的牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，其特征在于： 牡丹根际土壤浸提液为每500mL水中加入200~400g牡丹根际细土，经浸提制得。5. 牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 将海藻糖〇. 2~lg、菊糖0. 1~Ig加入蒸馏水中，于98~105°C条件下高压蒸汽灭 菌20~30min，静置，再于98~105°C条件下高压蒸汽灭菌20~30min，得溶液A备用； 2) 将金蝉干粉1. 5~2. 5g、酵母粉4~6g、吉兰糖胶1. 5~2. 5g、NaCl 8~10g、琼脂 粉14~18g和牡丹根际土壤浸提液150~250mL加入蒸馏水中，灭菌，得溶液B备用； 3) 将溶液A、溶液B混合后定容至lOOOmL，即得。6. 根据权利要求5所述的牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，其特征 在于：金蝉干粉为金蝉老熟若虫经灭菌、干燥、破碎处理后得到的粉末。7. 根据权利要求5所述的牡丹营养器官内生细菌分离纯化培养基的制备方法，其特征 在于：牡丹根际土壤浸提液为每500mL水中加入200~400g牡丹根际细土，经浸提制得。8. 牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 取牡丹当年生健康营养器官，冲洗净，将非正常裸露的部位用融化的石蜡封口，再用 无菌水冲洗； 2) 转入65~75%乙醇溶液中表面消毒3~10min，再用0. 05~0. 15mol/L升萊消毒 3~5min，无菌操作条件下将封口的石蜡剪去，剩余部分破碎处理后，静置沉淀，取上清液 接种到如权利要求1~4中任一项所述的分离纯化培养基中，30~35°C条件下恒温培养 2~3天； 3) 挑取差异明显、特征典型的单菌落，分别进行划线纯化，每个单菌落连续划线纯化3 次以上，得到不同单菌落的活体纯培养物。
【专利摘要】本发明公开了一种牡丹营养器官内生细菌的分离纯化方法、培养基及其制备方法，属于植物内生菌分离培养技术领域。牡丹营养器官内生细菌的分离纯化培养基，每1000mL培养基的组成为：金蝉干粉1.5～2.5g，酵母粉4～6g，吉兰糖胶1.5～2.5g，海藻糖0.2～1g，菊糖0.1～1g，NaCl？8～10g，牡丹根际土壤浸提液150～250mL，琼脂粉14～18g，余量为蒸馏水。该培养基整体上用料搭配精当，既适合牡丹根、茎、叶营养器官内生细菌的分离培养，也可用于划线纯化，与传统培养基相比，可分离培养出的菌株种类更加丰富，多样性优势明显，且制备方法简单，便于操作，具有良好的推广应用价值。
【IPC分类】C12N1/20
【公开号】CN105039214
【申请号】CN201510410155
【发明人】孙会忠, 宋月芹, 王小东, 薛娴, 侯小改
【申请人】河南科技大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月13日