胎菊毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种胎菊毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，包括水、醇两种方法先后提取胎菊样品制备供试品溶液，自制碳电极和铜电极作为检测电极，选择优化毛细管电泳分析条件，测定供试品溶液，确定胎菊的指纹图谱等步骤。本发明分析了10种来源于不同产地和批次胎菊产品的图谱，通过相关系数法和夹角余弦法分析，确定了24个共有的特征峰，得到了标准指纹图谱。本发明提取方法简便，分析方法严谨，特征峰多，能全面的表达胎菊中活性成分的信息，可以作为胎菊质量的有效表征。
【专利说明】胎菊毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药材指纹图谱的构建方法，尤其是胎菊毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。属于中草药物分析【技术领域】。
【背景技术】
[0002]中药中含有多种化学成分，指纹图谱技术能对中药进行整体、宏观和全面的分析表达，已被公认为天然药物质量控制最有效的方法之一。1996年，美国食品药品管理局在制定的《FDA关于植物制品的指南》中，要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品提供相应的指纹图谱。2000年，中国国家药品监督管理部门明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准。从中药全面质量控制的角度看，需要能有效地反映和控制中药整体质量的技术手段。
[0003]毛细管电泳技术分离效率高、使用试样少，已被用于绘制指纹图谱，为中药的质量鉴定提供准绳。专利(ZL200810079790.1)利用毛细管电泳-紫外检测技术为原产地人参建立了指纹图谱。孙国祥等(色谱，2007年第I期)报道了毛细管电泳法建立金银花的指纹图谱。安培检测法灵敏度高，选择性强，检测精确可靠。联合使用毛细管电泳和安培检测技术为中药材建立相应的指纹图谱，可望成为控制中药内在质量的有效方法。
[0004]胎菊是在菊花刚出现花骨朵的时候被摘下，烘干，消毒，选优后制成，是菊花中最上品的一种。胎菊广泛的产于我国的江苏盐城、浙江、福建等地，对中枢神经有镇静作用，有解热、增强毛细血管抵抗力、扩张冠状动脉、抑菌等作用。胎菊中含有多种化学成分，主要包含有糖类、黄酮类活性成分、挥发油类和氨基酸等。目前尚无胎菊的国际推荐鉴别标准。王彬辉等(2011年浙江省医学会临床药学分会学术年会论文汇编)综述了菊花的指纹图谱研究现状，高效液相色谱法是经典的指纹图谱应用技术，但其样品前期处理，操作复杂，往往受到了光分析局限性的影响，提取物很难表达菊花的全貌信息。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种步骤简单、操作便捷、经济实用的毛细管电泳技术，建立胎菊指纹图谱的构建方法，并获得胎菊的标准指纹图谱。
[0006]为实现此目的，本发明的技术方式是依托如下关键点实现的。
[0007]1、胎菊样品采用水溶、醇溶两步骤逐步提取，保证提取充分性，体现样品的全貌。
[0008]2、采用毛细管电泳技术和自制的碳电极、铜电极联用，组成双检测分离体系，确保分离度高、检测限低、信息表达全面，弥补了现有质量控制技术的不足，完善了胎菊的质量控制的方法。
[0009]胎菊毛细管电泳指纹图谱的构建包括以下步骤。
[0010](I)供试品的制备:取胎菊样品，粉碎后置于水溶液中，超声，再在90°C下恒温水浴30min，取出离心，过滤，上层清液作为供试品I备用；滤渣中加入乙醇溶液，超声后，离心，过滤，上层清液作为供试品2备用。[0011](2)电极的制备:其包括铜、碳两种电极的制作方法。
[0012]铜电极制作:废弃铜丝用砂纸打磨，并将其置于去胶管的滴管中，用胶固定即得。
[0013]碳电极制作:用砂纸打磨0.3mm铅笔芯和细铜丝，并将细铜丝缠绕在铅笔芯上，用电烙镀锡后，固定即得。
[0014](3)电泳条件:其包括步骤一中制得的两种供试品的分离检测条件。
[0015]供试品I的毛细管电泳分离检测条件:缓冲液:pH9.24硼砂为分离缓冲液，
0.lmol/1氢氧化钠为最佳检测缓冲液；分离电压:20kv ;检测电极:自制的铜电极；检测电位:0.67V ;进样时间:8s。
[0016]供试品2毛细管电泳分离检测条件:运行缓冲液:ρΗ11.25的硼砂一氢氧化钠溶液；分离电压:14kV ;检测电极:自制的碳电极，检测电位:0.95 V ;进样时间:8s。
[0017](4)指纹图谱的构建:按照前述的方法对10批不同产地和批次的胎菊进行毛细管电泳图谱分析，运用相关系数和夹角余弦法，通过比较，以相对保留时间RSD相差小于5%为选择标准，确定了 24个共有特征峰，其中供试品I中有12个共有特征峰(见图1)，供试品2中有12个共有峰(见图2)，这些特征峰反应了胎菊的指纹特征，共同作为胎菊的标准指纹图谱。
[0018]本发明的优点在于以下几个方面。
[0019]胎菊的预处理经过了超声辅助水解和超声辅助醇解两个步骤，有利于提取出胎菊中水溶性和脂溶性的全部物质，体现了整体性。
[0020]针对胎菊中化合物的特性，采用自制的铜电极和碳电极两种方式来检测不同的提取液，有利于全面的表达胎菊的质量标准。
[0021]铜电极检测体系中，使用了不同的分离缓冲液和检测缓冲液，既增加了分离效能，又同时提高了检测灵敏度，突破了在毛细管去带电泳技术中进样端和检测端需实用同一缓冲液的限制。
[0022]本发明适用于胎菊品质的鉴别与控制。
[0023]【专利附图】
【附图说明】
图1是供试品I的标准指纹图谱；图2是供试品2的标准指纹图谱。图中从左到右分别标出了共有特征峰。
[0024]【具体实施方式】
实施案例
Cl)仪器与药品:安培检测器(美国BAS-3C)，毛细管(内径25μπι，河北永年)；胎菊10种，购于江苏射阳、浙江和安徽等地；其他试剂均为分析纯。
[0025](2)样品预处理:精密称取胎菊Ig粉碎于40ml水中溶解，用超声波仪超声30min后，再利用恒温水浴槽在90°C下恒温水浴30min，取出溶液，采用离心机离心频率14800转，时间2min，使用0.22 μ m滤膜过滤，上层清液作为供试品I备用；滤渣中加入95%的乙醇溶解后，超声30min，再利用恒温水浴槽在90°C下恒温水浴30min，取出溶液，离心2min (频率14800转)，0.22 μ m滤膜过滤，上层清液作为供试品2备用。
[0026](3)制作铜电极:用砂纸打磨废弃铜丝，去除其表层的氧化物后置于去胶皮头的滴管中，用万能胶固定，并保证铜丝露在细管口外Icm左右。制成的电极以丙三醇为氧化对象，考察自制铜电极的效能。[0027](4)制作碳电极:用砂纸打磨0.3mm铅笔芯，将打磨过的细铜丝缠绕在铅笔芯上，用电烙铁在铜丝上镀锡，用万能胶固定，并保证铅芯露在细管口外Icm左右。制成的电极以苯酹为氧化对象，考察自制碳电极的效能。
[0028](5)分析检测供试品1:缓冲液:pH9.24硼砂为分离缓冲液，0.lmol/1 NaOH为最佳检测缓冲液；分离电压:20kv ;检测电极:铜电极；检测电位:0.67V ;进样时间:8s。
[0029](6)分析检测供试品2:运行缓冲液:ρΗ11.25的硼砂一氢氧化钠溶液；分离电压:14kV ;检测电极:碳电极,检测电位:0.95 V ;进样时间:8s。
[0030](7)绘制胎菊指纹图谱:按照上述方法，对10种不同产地和批次的胎菊建立了指纹图谱，运用相关系数法和夹角余弦法，通过分析比较，以相对保留时间RSD相差小于5%为选择标准，确定24个共有特征峰。这些特征峰构成了胎菊的指纹特征，可作为胎菊的标准指纹图谱，如图1、图2所示。
【权利要求】
1.一种胎菊毛细管电泳指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，其特征在于包括以下步骤: (1)供试品的制备取胎菊样品，粉碎后置于水溶液中，超声，再在90°C下恒温水浴30min，取出离心，过滤，上层清液作为供试品I备用；滤渣中加入乙醇溶液，超声后，离心，过滤，上层清液作为供试品2备用； (2)电极的制备铜电极制作:废弃铜丝用砂纸打磨，并将其置于去胶皮帽的滴管中，用胶固定即得；碳电极制作:用砂纸打磨0.3mm铅笔芯和细铜丝，并将细铜丝缠绕在铅笔芯上，电烙镀锡后，置于去胶皮帽的滴管中，胶固定即得； (3)毛细管电泳分析条件 ①供试品I的毛细管电泳分离检测条件:缓冲液:pH9.24硼砂为分离缓冲液，0.1mol/l氢氧化钠为最佳检测缓冲液；分离电压:20kv ;检测电极:自制的铜电极；检测电位:.0.67V ;进样时间:8s ； ②供试品2毛细管电泳分离检测条件:运行缓冲液:ρΗ11.25的硼砂一氢氧化钠溶液；分离电压:14kV ;检测电极:自制的碳电极，检测电位:0.95 V ;进样时间:8s ； (4)构建指纹图谱按照前述的方法分析10种来源于不同产地和批次的胎菊样品，运用相关系数和夹角余弦法，通过比较，以相对保留时间RSD相差小于5%为选择标准，确定了24个共有特征峰，其中供试品I中有12个共有特征峰，供试品2中有12个共有特征峰，这些特征峰反应了胎菊的指纹特征，共同作为胎菊的标准指纹图谱。
【文档编号】G01N27/447GK103575793SQ201310510622
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月26日 优先权日:2013年10月26日
【发明者】邢晓平, 刘爱祥, 李丹 申请人:盐城工学院, 盐城市瑞智生物技术有限公司