一种对照提取物的标定方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种对照提取物的标定方法，对照提取物共有n批，每批均含有m个成分，将它们配成溶液，分别利用色谱法将其分离检测，以不同的进样体积进样并对各个成分进行线性回归，得出回归方程，利用此方程计算出同一成分在不同批次对照提取物中的信号质量比，列出一个n行的m元一次方程组，这个方程组的根共有Cnm种解，统计每种根，在相对标准偏差低于可接受的判别误差R时，标定成功。此标定方法可成功的解决对照品来源困难的问题，为中药、天然药物提供更科学合理的标准制定思路，为化药品种中有关物质的准确定量提供混合对照品，还为归一法定对照品纯度的缺限提供了一个更好的补充。
【专利说明】-种对照提取物的标定方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析领域，具体的涉及一种对照提取物的标定方法及应用。
【背景技术】
[0002] 在进行药品的研发和检验过程中，对照品起着一个非常重要的角色，然而对照品 的分离和精制是一项繁琐而又困难的工作。现行新药注册法规上对于含量测定用对照品的 技术要求是；一般化药对照品的纯度要求为99. 5%，有关物质对照品纯度要求为95%，中药 对照品的纯度要求为98%，所述的纯度检测方法大都采用归一法，为了达到该个纯度，研究 者用尽各种分离方法如萃取、柱色谱、高速逆流色谱、制备液相色谱、反复重结晶等手段，即 便该样，还不能达到含量测定所需的纯度，期间所用到的大量有机溶剂，试验过程中试剂的 消耗带来的环境污染和人体的健康是巨大的。
[0003] 在进行中药、天然药物等含多种成分药物的质量研究时，由于成分复杂，测量某一 两个成分并不能代表该产品的质量，欲分离出其中的纯大多数成分并作为对照品进行含量 测定时，就目前的技术来说是不现实的，纵然投入大量的物力、人力，浪费大量的有机溶剂， 甚至动用制备色谱等，从经济上和W后的推广上也是不合算的。
[0004] 对于有关物质用对照品，分离则更困难。
[0005] 可喜的是针对中药成分复杂该一现状，人们提出了使用对照提取物作为对照，制 定质量标准，简化了应用，降低了成本。文献马玲云，马双成中药标准物质的发展现状与展 望[J].中国药事，2010,24 (12):1232-1235.上提到了对照提取物的标定要求；1)原料 的来源、提取部位及制备工艺应明确；2)主成分及含量相对固定（TLC、HPLC、GC);3)理化特 征换批间应一致(溶解度、相对密度、折光率、旋光度等)。从上述要求可知，对照提取物中的 主成分只是含量相对固定，并不能标定出其具体的含量比例，如若确定其具体的主成分含 量，还得使用对照品进行测定。
[0006] 就目前的行业现状，对照品的纯度检测方法通常是用归一法进行检测，W主成分 峰面积占所有成分的峰面积的百分比，此种检测方法有一个缺限，不同成分的峰面积与质 量比通常是不同的，因此归一法测定对照品的纯度实际上是有一定的方法误差，如同一对 照品，采用HPLC-UV法检测纯度，当检测波长不同时，检测结果是不一样的。
[0007] 如上，在新药研发和药品的质量控制中，对照品的来源是相当的困难，归一法测定 对照品纯度有一定的缺限，如何突破技术难关，弄清中药中的大部分成分的质量，还能解决 化药中有关物质对照品来源困难，完善对照品的纯度标定方法，对多成分对照提取物中各 成分的含量进行标定，并将对照提取物作为对照进行新药研发和药品的质量控制是本发明 所要解决的问题。
【发明内容】
[0008] 本发明针对上述问题，提出了一种对照提取物的各组分的标定方法，在标定过程 中不需要使用高纯度的对照品，而只需多批对照提取物。
[0009] 本发明是该样实现的： 一种对照提取物的标定方法，对照提取物共有n个批次，分别为第1、2、3…… i……n化每个批次均含有m个成分，它们分别为V A2、As……k;……A。，其中n > m， Ki《n，Kj《m，每批对照提取物通过色谱法W在仪器中进行检测，各种成分均能达到分 离的效果，成分Aj.的信号质量Nj.与一定范围巧j,，Dj,]内的信号值Sj.存在如下的一一对应 函数关系式： Sj 二 fj(Nj)，式中，j=l、2、3......m。
[0010] 步骤一、各批对照提取物中的各成分关系式 每批对照提取物如第i批对照提取物，均配制成一定的浓度W-定的进样体积Vi 进样，进样质量为Mi=。* Vi，第i批对照提取物中的成分Ai、A2、As......Aj......Am的进样浓 度分别为C。、、C。......Cy...... Cim，在仪器中的信号质量分别为N。、Nc、Ni3 ...... N。……Nim ，它们在仪器中的信号值分别为S。、Si2、Si3……S。……Sim,各批对照提取 物中的各组分存在如下的关系式：
【权利要求】
1. 一种对照提取物的标定方法，其特征在于： 对照提取物共有η个批次，分别为第1、2、3……i……η批，每个批次均含有m个成分， 它们分别为Αρ A2、A3……Α』……Am，其中η彡m，l〈i彡n，l〈j彡m，每批对照提取物通过 色谱法W在仪器中进行检测，各种成分均能达到分离的效果，成分?的信号质量％与一定 范围[Df D"]内的信号值&存在如下的一一对应函数关系式： Sj =心叫），式中，j=l、2、3……m 步骤一、各批对照提取物中的各成分关系式 每批对照提取物如第i批对照提取物，均配制成一定的浓度Q，以一定的进样体积\ 进样，进样质量为吣=(；* \，第i批对照提取物中的成*ApA2、A3……A」……进样浓 度分别为C n、Ci2、Ci3……Cu……Cim，在仪器中的信号质量分别为N n、Ni2、Ni3…… Njj……Nim ，它们在仪器中的信号值分别为Sn、Si2、Si3……Si」……S im，各批对照提取 物中的各组分存在如下的关系式： Ml = Nn+ N12 + N13 ……&……+ Nlm - N21+ N22 +N23......N2j......+ N2m Mi = Nn+ Ni2 + Ni3 ……心……+ Nim Mn = Nnl+ Nn2 + Nn3......NnJ......+ N· S。· = f爲） NfC# ν, 其中，i=l、2、......n j=l、2、......m 步骤二、方程组的建立 由于成分?的信号质量与信号值存在一一对应的关系，将任一批对照提取物溶 液如第1批，以不同的进样体积（V)通过色谱法W分离并进行检测，根据函数& = &(%)= f^CjV)可知： 由于是一个固定的未知值，因此对于第1批对照提取物所配制的溶液，存在函数关 系式4 = g^v)及它的反函数v= g^(sp，即第1批对照提取物的溶液的不同进样体积 (V)，有一个固定的信号值与之相对应，同样，一个固定的信号值，存在第1批对照提取物溶 液的某个进样体积与之相对应，且这两个函数的相关系数是通过线性回归可确定出具体数 值，令队』=λ υ = λ u ，式中，λ υ是信号质量比，则存在下列等式： s ij = f j (N i j) = f j (Νυ* λ ij) = f j (cu*vi* λ ij) = gj (νι* λ ij ) s u = fj(N ij) =gj(vi) λ u = gj-1(S u )/ V!，其中 i=2、3......n，j=l、2、......m 在上式中，SpSn、％是具体的固定值，函数& (V)的相关系数是固定的，因此入^ 是可以计算出的一个具体值，这样，根据步骤一中的关系式，可得到如下的方程组： 1. Ml = Nn+ N12 + N13……&……+ Nlm 2. M2 = N21+ N22 +N23......N2j......+ N2ni =λ 21*Nn+ λ 22* N12 + λ 23* N13......入 2产心......+ 入 2ηι*Ν1ηι i) Mi = Nn+ Ni2 + Ni3……心……+ Nim =λ n*Nn+ λ i2* N12 + λ i3* N13...... λ ......+ λ ini*Nlni n) Mn = Nnl+ Nn2 + Nn3......Nnj......+ N· =λ nl*Nn+ λ n2* N12 + λ n3* N13...... λ jNu.......+、*?"> 步骤三、方程组的求解 选择其中的m行，共有u=Cn°'种m行组成的方程组， 解第1种m行的方程组，得出第1批对照提取物中各成分在仪器中的信号质量为： (Nm、N121......Njjj......Nlml )， 各成分的信号质量和为： Ni〇i= Nm+ N121 + N131......Nij!......+ Nlml, 记 Qn- (Nm，Nm......Ν。、......Nlml，N101); 解第2种m行的方程组，得出第1批对照提取物中各成分在仪器中的信号质量为： (N112、N122......N1J2......Nlm2), 各成分的信号质量和为： Ni〇2_ N112+ N122 + Ν132......N1J2......+ Nlm2， 记 Q12_ (Ν112, Ν122......Nlj2......Nlm2, Ν1(ι2); 解第k种m行的方程组，其中1 < k < u，得出第1批对照提取物中各成分在仪器中的 信号质量为： (Nllk、N12k......Nljk......Nlmk)， 各成分的信号质量和为： Ni〇k_Nllk+ N12k + N13k......N1Jk......+ Nlmk, 记 Qik_ (Nnk，N12k......Nljk......Nlmk，N 1(lk); 解第u种m行的方程组，得出第1批对照提取物中各成分在仪器中的信号质量为： (Nllu、N12u......Nlju......Nlmu)， 各成分的信号质量和为： Ni〇u=Nllu+ N12u + N13u......Nlju......+ Nlmu， 记 Qlu- (Nllu，N12u......Nlju......Nlmu，N 10u) 步骤四、统计第1批对照提取物中各成分的信号质量及信号质量总和 统计第1批对照提取物的第1种成分Ai信号质量的U种值（Nm，N112，……Nllk…… Nllu)，得出统计值（Tn，en)，其中Tn为平均值，e n为标准偏差，相对标准偏差Pn= en/ T11; 统计第1批对照提取物的第2种成分Α2信号质量的u种值（Ν121，Ν122,……N 12k……N12u)， 得出统计值（T12, e12)，其中T12为平均值，e12为标准偏差，相对标准偏差P 12 = e12/ T12 ; 统计第1批对照提取物的第j种成分Α」信号质量的u种值（Nw，Nlj2,……Nljk……N lju)， 得出统计值（L，eij)，其中为平均值，eij为标准偏差，相对标准偏差Ρυ_ = eij/ ; 统计第1批对照提取物的第m种成分信号质量的u种值（Ν1η?，Ν1ηι2，......N lnik...... Nlmu)，得出统计值（Tlm，elm)，其中Tlm为平均值，e lm为标准偏差，相对标准偏差Plm = elm/Tlm ; 统计第1批对照提取物的m种成分信号质量总和的u种值（N1CI1，N1CI2,......N 1(lk......N1(lu)， 得出统计值（T1CI，e1(l)，其中T1(l为平均值，e1(l为标准偏差；相对标准偏差P 1(l = e1(l/T1(l ; 当相对标准偏差Pn、P12……Pu……。均低于可接受的判另Ο误差R时，贝1J标定成功， 第1批对照提取物的各成分在仪器中的信号质量为（Tn，T12…………Tlm)，总信号质量为 T1(l，第1批对照提取物的各成分的百分含量或者为（Τη/ Μ。L/X…………Tlm/ ΜΡ， 或者为（Tn/ T1(l，T12/ T1(l……IV Τ1(ι……Tlm/ Τ1(ι)，其中，可接受的判别误差R与仪器的精 密度、操作人员的操作误差、提取物纯化的难易程度、提取物中成分的稳定性等有关，其值 或者是5%，或者3%，或者2%，或者1%等。
2. 根据权利要求1所述的对照提取物的标定方法，其特征在于： 在步骤三中解出了第1批对照提取物中各成分的信号质量及信号质量总和的u种值， 即 Qik_ (Nnk，N12k......Nljk......Nlmk，N 10k)，其中，k-l、2......u ; 于是可计算出第i批对照提取物中各成分的信号质量及信号质量总和的U种值，即 Qik_ (Nnk，Ni2k......Nijk......Nimk，N i0k) =(λ n*Nllk，λ i2*N12k......入 ij*N1Jk......入 im*Nlnik，Ni0k)， 其中，i=2、3......n，k=l、2、......u ; 在步骤四中，除了统计第1批对照提取物各成分的信号质量及信号质量总和的相对标 准偏差（Pn，P12…………Plm，P10)夕卜，还应统计： 第i批对照提取物中各成分的信号质量及信号质量总和的u种值的相对标准偏差（Ρη， Pi2……Pi」……？^--))，其中1=2、3……η; 当相对标准偏差？^均低于可接受的判别误差R时，则标定成功，其中i=l、2、3……n， j=l、2、3......m、0〇
3. 根据权利要求1或2所述的对照提取物的标定方法，其特征在于： 函数S」=fj(Nj)为直线线性关系时，即 sj= f j (Nj) =aj*Nj+bj 对第1批对照提取物溶液，作如下的函数变换： Sj= fj(Nj)=aj*Nj+bj= a/KQ/lAO+bj: (afQj) *V+bj=gj(V) 以不同的进样体积（V)进样，可回归出函数g」(V)= (a」％」）*V+bj的相关系数（a'Cy、 bj)的具体值，这样对于第1批和第i批对照提取物，令Nu= λ Ny_，有下列的关系式： sij= f j (Nij) =aj*Nij+bj= aj* ( λ ij*Nij) +bj su= f j (Nij) =aj*Nij+bj 解上二式，可得(δ。一 bj)/ ( Si」一 bj)， 其中，i=2、3……n j=l、2、......m 当b j的绝对值与Su中最小的信号值的比值很小如低于1%时，线性关系式可以近似的 认为是通过原点的，λ 的大小可以估算为Sij/Sij，此时信号质量比就是信号值的比。
4. 根据权利要求1或2所述对照提取物的标定方法，其特征在于： 函数S」=fj(Nj)为对数线性关系时，即 sj= f j (Nj) =10~ (aj*ig (Nj) +bj) 对第一批对照提取物溶液，作如下的函数变换：sj= fj(Nj)=l〇~ (aJ*lg(NJ)+bJ) =10~ ( a^lg(Cu^V)+bj) =10~( aj*lg(V)+bj+ a^lgiX^j)) = gj(V) 函数 Sj =g」(V) =10~( a」*lg(V)+bj+ aflgiX^j))中的相关系数（a」、bj+ aflg^j))是 通过试验及线性回归能得出具体值，这样对于第一批和第i批，令Nij= λ ，有下列的关 系式 ^(8^-)= aJ*lg(N1J)+bJ ^(8^·)= aJ*lg(NiJ)+bJ= aj*lg( λ )+bj saflgOijHaflgCNuO+bj =aj*lg( λ u ) + lgGu) 解上二式，可得 ％=1〇~{ [lgGij) - lg^j)] / a』} 其中，i=2、3……η j=l、2、......m 。
5. 根据权利要求3所述对照提取物的标定方法，其特征在于： 对于第i批对照提取物的八」成分，若Su不在区间[DfD#]内，可通过调节第i批的进 样质量为V 使进样后的信号值Si/落在区间[DyDp]内， Yu是一个通过试验能得到的具体数值，此时，队/ =Yu*N^入^的计算方法如下： Slj= aj*Nlj+bj su ' =aj*Nij ； + bj = aj*Nij* Y ij + bj = aj* λ ij * Nu * Y ij + bj =(Su. - bj * λ u u + bj λ ij= (SiJ ' 一 bj) / ( Su - bj)/ Y ij 其中，i=2、3……n j=l、2、......m〇
6. 根据权利要求4所述对照提取物的标定方法，其特征在于： 对于第i批对照提取物的八」成分，若Su不在区间[DfD#]内，可通过调节第i批的进 样质量为V 使进样后的信号值Si/落在区间[DyDp]内， Yu是一个通过试验能得到的具体数值，此时，队/ =Yu*N^入^的计算方法如下： lg^j ' )= a^lg^j ' )+bj = aflg^^Yj+bj = *Υυ)+?3』 =)+ aj*lg( y iJ)+aJ*lg(N1J )+bj =a'lgOij ) + a/^lgOu) 入。_=1〇~{[ lg (Si/ )_ aflgOij) -lgGu)]/ a』} 其中，i=2、3……n j=l、2、......m 上式中，Sp Si/、均是实验后所得的具体值，a」是线性回归后所得的具体值，因 此，λ 也是可以计算出来的一个具体值。
7.根据权利要求1或2所述的对照提取物的标定方法，其特征在于： 若函数关系时，步骤二、三、四作如下的更改： 步骤二、方程组的建立 对第一批对照提取物所配制的溶液，存在函数：3」=&(%)=&^>」= &」*(：1」轉+13」，以不 同进样体积（V)所对应的信号值作线性回归，得出信号值在[DpD"]范围内的线性关系式， 且值afQj和bj是固定值，但a』和Qj均是固定的未知值； 由 Sfa^Nj+bj 可知：Ν」=?Αι」* (Sj-bj)，其中 S」e [DfDj ; 令 α j=1/aj ， 若第i批对照提取物的第j个成分的信号值在区间[Df D"]内，则 Nfl/aj* (Sij-bj) = (Sij-bj) * α』 式中，％是一个未知值，系数Sij-bj是一个可计算出结果的值，记 若第i批对照提取物的第j个成分的信号值不在区间[DjpDjJ内，可调节第i批 对照提取物的进样质量为乂 ' =Y#Mi，使进样后的信号值Si/落在区间[DyDp]内，Yij 是一个通过试验能得到的具体数值，此时，队/ =Υυ*Νυ， Nij ; =l/aj* (Su ' _bj)= α 产以』'_bj)= γ Ni「α j * (? _bj) / y jj 式中，％是一个未知值，系数（Si/ -bp/Yu是一个可计算出结果的值，为方便方程 的书写，也记作ω u，因此，对于第i批对照提取物溶液的第j个成分、，存在如下的关系 式： Nij=coij*a j，是一个可计算出结果的固定值，α j是一个未知值，i=1、2、3......η ， j=l、2、......m ； 当bj很小时，ω u的近似值是Su或S，/ γ u 根据步骤一的结果，存在下列的方程组： Ml = ?11*^1 +?12*a2 +ω!3*α3 ......ω lj* α j......+ ω lm* α m Μ2 = ω21木 a 1 +ω22φα 2 +ω23φα 3 ......ω2J* a j......+ ω2m* a m Mi = ω η* α ι + ω i2* α 2 + ω i3* α 3 ......ω a j......+ ω im* a m Μη= ωη1*α? +ωη2*α2 + ω η3* Q 3 ......ω nj* Q j......+ ω ?* Q m 步骤三、方程组的求解 选择其中的m行，共有u=Cnm种m行组成的方程组，解第k种方程组，得根为（a lk、 a2k> ...... a ik> ...... a^k)，其中，k=l、2......u ； 步骤四、统计 统计h的11种值（an，a12，……alk……a lu)，得出统计值（Γ ^ θι)，其中Γ i为平 均值，ei为标准偏差，相对标准偏差ε e e1；/r i ; 统计a2的11种值（a21，a22，……a 2k……a 2u)，得出统计值（Γ 2, e2)，其中Γ 2为平 均值，e2为标准偏差，相对标准偏差ε 2= e2/r2 ; 统计a j的u种值（a f a j2，……a jk……a ju)，得出统计值（Γ』，ep，其中Γ』为平 均值，e」为标准偏差，相对标准偏差ε」=ej/Γ』； 统计％的1!种值（απ1，απ2,……amk……a mu)，得出统计值（Γ m，em)，其中Γ m为平 均值，em为标准偏差，相对标准偏差ε m= em/rm ; 当相对标准偏差h、ε2……^……επ均低于可接受的判别误差R时，则标定成功， 第1批对照提取物的各成分在仪器中的信号质量为（ω^Γρ ω12*Γ2……ωυ*Γ^…… ω im* F m)，各成分在仅器中的可质里和N1q= ωη* Γ丨+ ω 12* Γ 2+......+ ω丨」* Γ」+...... + ωlm*Γm，第l批对照提取物的各成分的百分含量或者为（ω11*Γ 1/M1，ω12*Γ2/M1…… ωυ*Γ』/Μ!..../Μ!)，或者为（ω^Γ^/Ν!。，ω12*Γ2 / Ν10......ω υ* Γ』/ Ν10...... ω?πι*「πι / Ν10)。
8. 根据上述任一权利要求所述对照提取物的标定方法，其特征在于： 色谱法W可以是液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法等； 检测成分信号的仪器可以是紫外检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电喷雾 检测器、质谱等，还可以是通过化学反应来检测成分的信号，如薄层色谱扫描法中的显色方 法及扫描方法、化学成分的衍生化等； 目前分析行业中所能接受的分析方法如TLCS、HPLC-UV、HPLC-ELSD、GC、液质、气质等， 可以是一种，也可以是多种组合； 所述统计方法为统计学上可接受的通用方法，如算术平均、加权平均等。
9. 一种对照提取物的应用，其特征在于： 选用权利要求Γ8中任一权利要求所述的标定方法标得的对照提取物作为对照品来 进打药品研究或药品检验。
【文档编号】G01N30/02GK104237398SQ201310598508
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年6月13日
【发明者】陈浩达 申请人:陈浩达