检测猪胞内劳森氏菌抗体的elisa试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，包被酶标板以重组蛋白1024b作为包被抗原。研究及实践证明，本发明具有灵敏度较高、特异性强、稳定性好等特点，可用于猪群猪胞内劳森氏菌感染情况的血清学调查、抗体监测及疫苗免疫效果的评估等方面。
【专利说明】检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于ELISA试剂盒【技术领域】，尤其涉及一种检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002]由猪胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis, LI)引起的猪增生性肠炎(Proliferative enteropathy, PE)是猪的一种肠道传染病,感染后可引起顽固性腹湾、肠壁增厚，使猪生长迟缓、降低饲料报酬率，严重影响养猪业的发展。增生性肠炎在全球范围内广泛流行，不同阶段猪群阳性率在5-100%之间。我国仅有的几份流行病学调查报告也表明，我国猪群的胞内劳森氏菌感染率也非常高。随着我国养猪水平的逐渐提高及抗生素使用的逐渐规范，必将逐渐重视增生性肠炎。血清学诊断无论是在了解疾病流行情况、抗体水平监测、评估疫苗免疫效果还是评估药物治疗效果等方面都发挥着重要作用，血清学诊断是控制疾病流行的关键步骤。
[0003]目前，全世界商品化的猪回肠炎抗体检测试剂盒仅有I款，其是将纯培养的胞内劳森氏菌作为包被抗原建立起来的阻断ELISA，尚未在我国销售。文献报道用胞内劳森氏菌的脂多糖作为包被抗原建立间接LPS-ELISA、夹心-ELISA和斑点-ELISA，也有用胞内劳森氏菌的全菌超声波裂解物作为抗原包被建立ELISA。但是，这些方法都需要通过体外培养胞内菌来获得抗原，而胞内劳森氏菌是一种严格的细胞内寄生菌，多种动物的肠上皮可以用来培养胞内劳森氏菌，可所需培养条件非常严格，国外也仅有少数几个实验室通过细胞培养的方法分离到胞内劳森氏菌，国内还未见通过细胞培养来分离胞内劳森氏菌。因此，研制具有国内独立自主知识产权的ELISA试剂盒意义重大，前景广阔。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、稳定性好的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，用于猪群猪胞内劳森氏菌抗体水平的检测，以判断猪群猪胞内劳森氏菌的感染情况和监测免疫效果等。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，包被酶标板以重组蛋白1024b作为包被抗原。
[0006]重组蛋白1024b具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列的基因编码。
[0007]包被酶标板每孔包被重组蛋白1024b50ng，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5%的脱脂奶粉作为封闭液进行封闭。
[0008]阴性对照血清和阳性对照血清各2mL ;酶标二抗为60mL,由美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得；浓缩洗涤液为IOX洗涤液，为含0.5%吐温-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL ;样品稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%叠氮钠pH7.2-7.4的0.0lM的PBS溶液，共IOOmL,以稀释被检血清和酶标二抗；显色液包括显色液A和显色液B，显色液A:称取200mg四甲基联苯胺，溶于IOOmL的无水乙醇中，双蒸水定容至IOOOmL ;显色液B:称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL,双蒸水定容至IOOOmL,调节PH值为4.5-5.0 ;显色液A和显色液B各60mL ;终止液为2M的H2SO4溶液，共30mL。
[0009]重组蛋白1024b按以下操作制备:以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板，PCR扩增猪胞内劳森氏菌外膜蛋白1024的基因并克隆得到克隆质粒pMD-1024 ;以克隆质粒pMD-1024为模板，扩增1024b并克隆获得克隆质粒pMD_1024b，再将1024b亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中筛选获得原核表达质粒pET32a-0MP1024b ;将原核表达质粒pET32a-0MP1024b转化进宿主表达菌BL-21(DE3)中，经IPTG诱导表达获得重组蛋白1024b ;利用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白1024b，复性后得到具有生物学活性的重组蛋白1024b。
[0010]间接ELISA具有操作简单、特异性及稳定性好等诸多优点，目前在临床上广泛应用于各种细菌、病毒及寄生虫等病原抗体水平的检测。发明人依据间接ELISA的原理，建立了预包被有重组蛋白1024b的酶标板的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒:首先，通过筛选抗原性强的胞内劳森氏菌外膜蛋白，扩增和克隆基因；然后构建原核表达载体，原核表达融合蛋白；接着通过Western blotting进行抗原性分析,筛选表达量高、抗原性较好重组蛋白抗原进行纯化作为包被抗原，最终获得了一种灵敏度较高、特异性强、稳定性好检测胞内劳森氏菌抗体的间接ELISA试剂盒。
[0011]应用本发明对猪瘟病毒标准阳性血清、猪繁殖与呼吸综合症病毒阳性血清、猪圆环病毒2型阳性血清、口蹄疫病毒标准阳性血清、伪狂犬病毒标准阳性血清以及沙门氏菌、布氏杆菌标准阳性血清进行检测，结果均为阴性，说明该试剂盒具有很好的特异性，所用的诊断抗原与其他病原抗体之间无交叉反应；血清吸附试验及竞争性抑制试验结果均表明以本发明为基础建立的ELISA方法具有较好的特异性。本发明可用于猪群猪胞内劳森氏菌感染情况的血清学调查、抗体监测及疫苗免疫效果的评估等方面。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是猪胞内劳森氏菌外膜蛋白(OMP) 1024基因扩增的电泳图，图中:泳道I为0MP1024 基因，泳道 2 为 DNA Marker Dsl5000。
[0013]图2是外膜蛋白1024基因序列的后半段卿1024b)的扩增电泳图，图中:泳道I为 DNA Marker DL2000，泳道 2 为 0MP1024b。
[0014]图3是1024b基因插入原核表达载体pET_32a ( + )中得到的原核表达质粒pET-32a-1024b的酶切鉴定图，图中:泳道I为重组质粒pET-32a_1024b的双酶切片段，泳道 2 为 DNA Marker DsI5000。
[0015]图4是重组菌诱导表达产物的SDS-PAGE分析图，图中:泳道I为预染分子量蛋白Marker,泳道2为未诱导重组菌,泳道3为诱导后重组菌。
[0016]图5是重组菌诱导表达产物的Western-blot分析图，图中:泳道I为预染分子量蛋白Marker，泳道2为诱导后重组菌，泳道3为未诱导重组菌。
[0017]图6是纯化后的重组蛋白1024b的抗原性鉴定图(一抗采用胞内劳森氏菌阳性猪血清)，图中:泳道I为预染分子量蛋白Marker，泳道2为纯化复性后的重组蛋白1024b (用以作为猪胞内劳森氏菌抗体间接ELISA检测试剂盒的包被抗原)。
【具体实施方式】
[0018]1.0MP1024b基因的扩增及原核表达载体的构建
[0019]依据GeneBank中LI的基因序列(登录号:AM180252)，设计一对特异性引物扩增胞内劳森氏菌外膜蛋白1024的基因，上游引物为:5’-CTGTGTAATATACTTTATTGTAATAT-3’
(序列表 SEQ.1D.N0.4);下游引物为:5’ -TTAGAAGAATTGCCCCATTGAAAATTC-3’(序列表 SEQ.1D.N0.5)；以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板PCR扩增0MP1024基因(图1，序列表SEQ.1D.N0.3)。PCR 反应体系为 10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (IOmM) 0.25 μ L，Ex-Taq 聚合酶(5U/y L)0.25μ L，上下游引物 Pl/P2(25pmol/y L)各 0.5μ L，以无菌 ddH20 加至 25μ L。PCR 反应程序 95°C 5min ；94°C lmin、55°C 30s,72°C 2min30s，共 35 个循环；72°C IOmin ；4°C保存。目的基因回收并克隆至PMD-18T载体中获得克隆质粒pMD-1024。再设计一对添加酶切位点(BamH I和Hind III)的特异性引物PCR扩增1024基因中抗原性较强的后半段，即 1024b (图 2，序列表 SEQ.1D.N0.2)，上游引物为:5’ -GCGGATCCCTCCGACGCTCTAATGAA-3’
(序列表 SEQ.1D.N0.7 );下游引物为:5’ -GCCAAGCTTGGCAAATCGCAAATCTC-3’(序列表 SEQ.1D.N0.8)ο PCR 体系为 10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (IOmM) 0.25 μ L, Ex-Taq 聚合酶(5U/yL)0.25yL，上下游引物 P1/P2 (25pmol/μ L)各 0.5 μ L，以无菌 ddH20 加至 25 μ L。PCR反应程序 95°C5min ；94°C lmin、55°C 30s、72°C lmin，共 33 个循环；72°C IOmin ;4°C保存。目的基因回收并克隆至PMD-18T中获得克隆质粒pMD-1024b，经BamH I和Hind III双酶切以及测序鉴定正确后再将1024b基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，经BamH I和Hindm双酶切以及测序鉴定正确得到原核表达质粒pET32a-1024b (图3)。
[0020]2.1PTG诱导表达
[0021]将原核表达质粒pET32a_1024b转入到宿主表达菌BL21 (DE3)中，将阳性菌株接种于新鲜含有AMP (100 μ g/mL)的LB培养基中，37°C震荡培养，待0D600达到0.6左右时加入IPTG (终浓度1.0mM)诱导表达，SDS-PAGE和Western-blot结果表明重组蛋白1024b得到高效表达(图4和图5)。收集表达菌株，冻融数次并进行超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果表明重组蛋白1024b的表达形式为包涵体。用猪胞内劳森氏菌阳性血清作为一抗，二抗用山羊抗猪IgG抗体，对重组蛋白的抗原性进行分析，结果表明重组蛋白1024b具有良好的抗原性。
[0022]3.重组蛋白的纯化
[0023]因重组蛋白1024b融合有多聚组氨酸(6XHis)标签，故采用Ni2+亲和层析的方法纯化重组蛋白1024b。经鉴定重组蛋白1024b以包涵体的形式得到表达，故取包涵体溶解液过N1-NTA，通过改变缓冲液的pH值来洗去杂蛋白，纯化目的蛋白。纯化后得到大小为57kDa,条带单一的目的蛋白，对纯化后的重组蛋白1024b复性后进行Western-blot分析其抗原性，结果表明纯化复性后的重组蛋白1024b具有良好的抗原性(图6，序列表SEQ.1D.N0.D0
[0024]4.包被液、洗涤液、稀释液的配制
[0025]包被液为ρΗ9.6 的 0.05Μ 碳酸盐缓冲液(Na2CO30.159g，NaHCO30.293g，加灭菌ddH20 至 IOOmL) ;10X 洗涤液为含 0.5%Tween_20 的 0.1M 的 PBS 溶液(pH7.2-7.4);稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%叠氮钠的0.01M的PBS溶液(pH7.2-7.4)。
[0026]5.显色液及终止液的配制
[0027]显色液A:称取200mg四甲基联苯胺，溶于IOOmL的无水乙醇中，双蒸水定容至1000mL ;显色液B:称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL，双蒸水定容至1000mL,调节PH值为4.5-5.0。终止液为2M H2SO4，将11.1mL的浓硫酸缓慢加入水中稀释，并定容至100mL。
[0028]6.ELISA反应条件的确定
[0029]最佳包被浓度和最佳二抗稀释度的确定。采用方正试验，分别将包被抗原进行1:10, 1:20, I: 40, 1:80, I: 160 和 1:320 稀释，酶标二抗进行 1:1000，1:2000, 1:4000, 1:8000和1:16000稀释，组成方正进行ELISA。最终确定最佳抗原包被量为50ng，酶标二抗的最佳稀释度为1:8000。并对最佳包被条件、最佳封闭液及封闭条件、待检血清稀释倍数、血清孵育时间、二抗作用时间以及底物显色时间等作了逐一优化，最终确定本研究的检测猪胞内劳森氏菌抗体间接ELISA的最佳反应条件为:最佳包被抗原量为50ng，37°C湿盒包被2h ；5%的脱脂奶粉，37°C封闭2h ;待检血清稀释40倍，37°C孵育Ih ;二抗稀释度为1:8000，37°C反应30min ;底物显色条件为TMB底物室温避光显色lOmin。 [0030]7.猪胞内劳森氏菌抗体间接ELISA阴阳性临界值的确定
[0031]收集20份猪胞内劳森氏菌阴性猪血清，用优化好的ELISA反应条件检测这20份胞内劳森氏菌阴性血清的OD45tl值。经计算20份阴性血清的OD45tl值的平均值为0.182，标准差为0.0463，所以阴阳性临界值=阴性血清样本的平均值+3倍标准差=0.182+3X0.0463=0.321。故将阴阳性临界值定为0.321。即在已优化好的ELISA反应条件下，P/N值≥2.1，待检血清样本OD450值≥0.321即判定为阳性，反之为阴性。
[0032]8.猪胞内劳森氏菌抗体间接ELISA检测试剂盒组成:
[0033]I) ELISA板条(预包被重组蛋白1024b):5块；
[0034]2) 10X浓缩洗涤液，规格为200mL ；
[0035]3)样品稀释液，规格为IOOmL ；
[0036]4)羊抗猪酶标二抗(酶标抗体)，美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得，规格为60mL;
[0037]5 )显色液A，规格为60mL ；
[0038]6)显色液B，规格为60mL ；
[0039]7 )终止液为2M的H2SO4溶液，规格为30mL ；
[0040]8)胞内劳森氏菌阴阳性对照血清各2mL。
[0041]9.猪胞内劳森氏菌抗体间接ELISA操作步骤:
[0042]I)在稀释板中将待检血清及阴阳性对照血清用样品稀释液进行40倍稀释，混匀后取100 μ L加入到酶标板中，37°C孵育60min ;倾去酶标板内液体，加入300 μ L洗涤液洗涤3-5次，每次3min，最后一次拍干；加入酶标抗体100μ L，37°C孵育30min ;倾去酶标板内液体，加入300 μ L洗涤液洗涤3-5次，每次3min，最后一次拍干；依次加入显色液A和显色液B各50 μ L，室温避光显色IOmin ;加入终止液50 μ L终止显色，用酶标仪测定OD450值，并根据OD值判定结果。[0043]2 )结果判定:当阳性对照的OD45tl值与阴性对照的OD45tl值的比(P/N值)≥2.1，待检血清样本OD45tl值> 0.321即判定为阳性，反之为阴性。
[0044]10.胞内劳森氏菌抗体ELISA检测试剂盒的临床应用
[0045]利用本发明建立好的L1-1024b间接ELI SA检测广西南宁、柳州、桂林、贵港和玉林地区的各阶段猪血清共计648份，计算出阳性率，分析广西部分地区胞内劳森氏菌流行情况及各阶段猪群LI抗体水平。样本血清信息见表1。
[0046]表1检测血清样品信息
[0047]
【权利要求】
1.一种检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，包括包被酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、酶标二抗、浓缩洗涤液、样品稀释液、显色液和终止液，其特征在于:所述包被酶标板以重组蛋白1024b作为包被抗原。
2.根据权利要求1所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述重组蛋白1024b具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的喊基序列的基因编码。
3.根据权利要求2所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于:所述包被酶标板每孔包被重组蛋白1024b50ng，包被缓冲液采用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液，并用5%的脱脂奶粉作为封闭液进行封闭。
4.根据权利要求3所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于: 所述阴性对照血清和阳性对照血清各2mL ； 所述酶标二抗为60mL，由美国Earthox公司生产的山羊抗猪IgG稀释8000倍而得； 所述浓缩洗涤液为10 X洗涤液，为含0.5%吐温-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL ； 所述样品稀释液为含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%叠氮钠pH7.2-7.4的0.0lM的PBS溶液，共IOOmL ； 所述显色液包括显色液A和显色液B，显色液A:称取200mg四甲基联苯胺，溶于IOOmL的无水乙醇中，双蒸水定容至IOOOmL ;显色液B:称取柠檬酸21g、无水磷酸钠28.2g，量取0.75%过氧化氢尿素6.4mL,双蒸水定容至IOOOmL,调节PH值为4.5-5.0 ;显色液A和显色液B均为60mL。 所述终止液为2M的H2SO4溶液，共30mL。
5.根据权利要求4所述的检测猪胞内劳森氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述重组蛋白1024b按以下操作制备:以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板，PCR扩增猪胞内劳森氏菌外膜蛋白1024的基因并克隆得到克隆质粒pMD-1024 ;以克隆质粒pMD-1024为模板，扩增1024b并克隆获得克隆质粒pMD_1024b，再将1024b亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中筛选获得原核表达质粒pET32a-0MP1024b ;将原核表达质粒pET32a-0MP1024b转化进宿主表达菌BL-21 (DE3)中，经IPTG诱导表达获得重组蛋白1024b ;利用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白1024b，复性后得到具有生物学活性的重组蛋白1024b。
【文档编号】G01N33/569GK103698514SQ201310698065
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】黄伟坚, 刘磊, 薛辉, 洪绍峰 申请人:广西大学