一种萘检测生物细胞传感器及其制备方法和使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种萘检测生物细胞传感器及其制备方法和使用方法，所述萘检测生物细胞传感器为基因重组细胞，所述基因重组细胞以水杨酸检测光传感细胞为宿主细胞，并且所述基因重组细胞的质粒由萘降解基因与载体质粒重组。本发明的萘检测生物细胞传感器在萘存在时可以立即发光，选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简易和仪器价格低廉、能在复杂体系中进行在线连续稳定检测。本发明还提供了所述细胞传感器的制备方法，所采用的构建条件温和、方法可控及简单易行，采用Gibson克隆技术完成了大分子降解片段的体外重组，是对专一污染底物进行检测的重要手段。
【专利说明】一种萘检测生物细胞传感器及其制备方法和使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物细胞传感器及其制备方法和用途，具体而言，本发明涉及一种萘检测生物细胞传感器及其制备方法和使用方法。
【背景技术】
[0002]多环芳经(PAHs— Polycyclic Aromatic Hydrocarbons),多环芳经是指一类含有2个或2个以上苯环，以线状、角状或簇状排列的稠环型化合物，熔点和沸点较高，具有疏水性强等特点，目前已知的多环芳烃有200多种。PAHs具有致癌、致畸、致突的“三致”效应，由于它具有脂溶性，很容易被动物的肠胃吸收，并能经食物链级联放大而富集并迅速的被广泛的分散到不同的组织中发挥作用。由于其毒性效应显著，有16种PAHs列入了美国环保局制定的129种优先污染物中。
[0003]PAHs的主要来源包括自然源和人为源。自然源包括燃烧和生物合成，如森林大火和火山喷发以及沉积物成岩过程、生物转化过程和焦油矿坑内气体等。人为源的数量则随着工业生产的发展大大增加，主要存在于石油、煤等燃料以及木材、天然气、汽油、重油、纸张、作物秸杆、烟草等含碳氢化合物的物质不完全燃烧或在还原性气氛中热分解的产物中。原油和煤炭中存在大量的PAHs，而含碳燃料的不完全燃烧也可产生PAHs。近年来大量调查研究表明，空气、土壤、水体及生物体等都受到了多环芳烃的污染。由于石化厂、焦化厂、炼油厂等工业污染原的广泛存在，土壤和地下水系统中PAHs的污染相当普遍和严重。我国部分石化厂和石油开采区污染地区地下水中萘、菲、蒽、芘、苯并(a)芘等PAHs的检出率高达50%以上。
[0004]萘是一种常见的双环芳香烃化合物，是最简单的PAHs，是分子量最小的PAHs，是煤焦油和杂酚油的主要成分，是多环芳烃中水溶性和挥发性最强的一种。随着对萘研究的不断深入，萘的毒性特别是三致作用引起有关学者的高度重视。长期接触萘会引起人体内血液成份的变化，肝转氨酶活性升高，出现黄疸，严重威胁人体健康；萘对水生生物也有毒害作用，表现为抑制呼吸强度，降低叶绿素含量，最终导致水生生物萎缩死亡。由于其结构简单、较高水溶性和容易从自然界分离得到其降解菌株等原因，常被用作PAHs生物降解的模式化合物，其相关研究最早也最为深入和透彻。
[0005]萘可用作制造染料、塑料、合成纤维、杀真菌剂、杀虫剂和油漆等的原料，还用作木材防腐剂和家用防虫剂。在20世纪七八十年代,常被用作家用杀虫药(樟脑丸)。随着石油化学工业的发展，萘的需要量显著增多，已成为石化工业的八大原料之一，广泛应用于塑料、石油、化工、煤加工、纺织和制药等行业中，在这些行业的生产废水中都可以检测到萘。世界上许多水体，包括 湖泊甚至地下水中也都有萘的存在；萘还分布于受石油污染的海港、土壤、垃圾集散和处理场。是一类广泛存在于环境中的有机污染物。因此消除萘的污染已经成为全世界关注的重大问题之一，各国的研究者们都在争相寻找消除萘污染的有效途径。
[0006]PAHs的检测和修复机理及其污染控制对策是一项国际性技术难题。之前诸多专家学者对此开展了大量研究工作并取得了重要进展，多数研究集中在PAHs的毒性表征研究。对多环芳烃的检测方法分为化学分析方法和生物分析方法。化学分析方法是通过对样品进行色谱等化学分析手段得到PAHs的浓度，目前而言，对于PAHs的检测往往是在经过复杂的前处理之后，再用气相色谱(GC)、气质联用(GC-MS)、高效液相色谱(HPLC)、激光质谱以及荧光光谱法等。这类方法需要对样品进行复杂的处理和化学分析，仅从物质的角度而不是生物效应的角度来衡量其毒性效应。多环芳烃性质稳定、难于降解，可以长期存在于环境之中，也是环境中常见的系列有毒化合物。土壤是环境中PAHs的储库和中转站，但是它可以通过大气直接沉降，雨水冲刷以及生物合成等途径进入水体生态系统。在对环境中液相和固相的PAHs进行治理修复工作之前，其测定工作是至关重要的，但由于一般PAHs含量很低，在进行仪器分析之前必须进行预处理以富集目标化合物，传统的萃取，浓缩净化法较为复杂，且耗用大量对环境有害试剂，所需时间长，难以满足应急需要，仅从物质的角度而不是生物效应的角度来衡量其毒性效应。
[0007]生物传感器处在生命科学和信息科学的交叉区域，是一个非常活跃的研究和工程【技术领域】，是多种学科互相渗透、综合交叉的一门技术。它具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简易和仪器价格低廉、能在复杂体系中进行在线连续检测等特点，甚至可以进行活体分析，并趋向微型化、集成化和智能化，给生物医学、环境监测等领域直接带来新技术革命，有着重要的应用价值，已引起世界各国的极大关注。生物传感器是一种把生物体本身或生物物质作为识别元件的测量系统，用来检测与生理或生化过程相关的参数。按照识别元件可将生物传感器分为三类:基于分子(酶、抗原或抗体、受体、核酸、脂质体等)的，基于细胞的和基于组织切片的。就敏感元件而言，前者是固定化的生物体成分，后两者是生物体本身。基于分子的生物传感器具有高度选择性和敏感性，只对靶分子有响应。但正因为这种高度选择性，可能会使某些具有相同功能的相关分子检测不到。而将活细胞作为探测单元，可以检测到许多未知的物质。近几年，随着半导体微细加工技术的发展，分析技术的微型化为细胞微环境分析提供了强有力的手段，以活细胞作为敏感元件已成为生物传感器研究领域的一大热点。
[0008]近年来，随着生物细胞传感技术的发展，微生物细胞传感器作为一种新型的检测技术被用于检测环境污染物，给环境监测等领域直接带来新技术革命，有着重要的应用价值。
[0009]微生物细胞传感器是由选择性较好的微生物体构成的分子识别元件，因此一般不需要样品的预处理:同时由于其体积小、响应时间短，因此可以实现在采样点的原位监测，并且大多可以实现连续在线监测；另外由于微生物体本身可以快速繁殖的特点，使得该类传感器的制造和分析成本远低于大型分析仪器:此外，最为重要的是其测定的污染物浓度是样品中具有生物有效性的部分，因而得到的数据更有实际意义。
[0010]由于PAHs种类繁多，降解途径复杂，对于其典型特异种类的快速生物监测还未取得突破性进展。随着分子生物技术的发展，近年来对于PAHs的生物降解途径已经有了深入的认识。目前，利用生物细胞传感器对持久性污染物PAHs代谢终端的小分子物质如水杨酸、邻苯二酚的检测也已经取得了可喜的成果。
[0011]近年来，将特异性因子融合到发光基因上而得到的重组发光细菌菌株已经开始用于环境监测，该利用重组发光细菌作为生物传感单元的优势在于反应快速，成本低，可重复性好。[0012]1998年Sayler将tod操纵兀和luxCDABE融合，转化到假单胞菌(Pseudomonasputida)Fl菌株中，获得了一个对苯、甲苯、乙苯和二甲苯等苯系物有检测效应的生物传感器菌株TVA8。2004年Gu等利用固定化的重组发光细菌成功构建了检测污染土壤中PAHs毒性的生物传感器，采用鼠李糖作为表面活性剂提取PAHs，液相中的菲的浓度(数量级为ng/mL)与传感器得到的毒性数据关联很好，该传感器可用于现场检测土壤中疏水性污染物的毒性以及PAHs的含量。2006年Van der Meer等将对菲有降解作用的菌株伯克氏菌(Burkholderia sp.)RP007 的基因启动子(phnS putative promoter/operator region)克隆出来，并将其与GFP基因连接，构建出新的菌株伯克氏菌RP037，对菲一类的污染物有检测效果。
[0013]King和他的同事(1990年)建造的第一个萘和水杨酸敏感的生物细胞传感器，使用质粒为基础的luxCDABE基因并融合源于荧光假单胞菌产生的NAH7质粒。后来在实验室得到广泛使用以及在现场检测系统中提供良好的系统检测工具。King构建的传感细胞的光感时间是15min (对萘污染物反应15min后才开始发光)，灵敏度不够高、分析速度较慢，详见 King 等的文章 “Rapid, sensitive bioluminescent reporter technology fornaphthalene exposure and biodegradation，，，〈〈Science〉〉,第 249 期，P778 - 781。
[0014]1990年Sayler等利用萘降解代谢途径中的nah操纵元和发光基因lux融合，构建了对萘有特异检测效果的微生物传感器。1994年Sayler又利用nahG基因和luxCDABE融合改进了上面的报告菌株，并将构建成功的新菌株用于对污染河流中萘和水杨酸类物质的生物有效性进行连续在线的监测。2004年Van der Meer等利用Psal启动子和luxAB基因融合构建的菌株，首次报道可以直接监测气态物质中的有机污染物，可以检测到50nmol/L水平的萘类物质。
[0015]建立、完善和发展PAHs污染物的检测方法是环境科学的热点研究课题，也是环境综合治理的关键环节之 一，具有重要的研究意义。同时构建一种新的高灵敏、低成本的细胞生物传感器的检测方法对完善现有的检测技术亦具有重要意义和较好的应用价值。由于PAHs降解的多样性，以往对于PAHs的生物传感器研究较少，大部分的细胞传感器主要是用于小分子PAHs (如:萘和菲)及部分PAHs降解的中间产物(如:水杨酸)的研究等。对于萘生物传感器的构建多是通过将对萘有降解作用的基因同光报告基因的融合实现的。现有的方法构件复杂，稳定性低，检测时间长。
【发明内容】
[0016]本发明通过萘的传感器的构建，以建立新型的PAHs污染物降解的生物传感器，这种构建思路是环境领域的创新。具体而言，本发明是从萘的降解途径出发，由于多种PAHs，包括萘的降解过程中都会产生共同的中间产物——水杨酸，通过把对大分子的萘降解基因与已经构建好的在细胞内的对水杨酸识别和光报告的生物传感系统进行融合，通过荧光报告基因的发光强度来指示水杨酸浓度，从而间接地实现对萘的检测。上述构建方法为其他多种的PAHs构建传感细胞奠定了基础。同时本发明针对传感细胞构建技术的难点，对大分子融合基因构建和转化、融合基因启动和表达载体的筛选等关键过程进行创新，实现了萘检测生物细胞传感器的成功构建，既为萘污染的修复机制提供有利的依据，又实现了对不同污染环境样品的快速灵敏检测，为萘污染环境全面分析及有效生物修复提供可行的理论依据和实际应用技术。
[0017]本发明重点在于萘的大分子降解基因片段与启动基因的重组结合，实现降解基因在受体细胞中的表达。由于大片段降解基因跟载体连接的困难，本发明将借助新型高性能的Gibson克隆法，Gibson克隆法是2009年发表在Nature Methods上的一种新颖的大片段基因重组的方法，本发明采用的是Gibson —步恒温法实现DNA重组(详见现有技术文献Gibson D G, Young L, Chuang R等,Enzymatic assembly of DNA molecules up to severalhundred kilobases [J].Nature Methods, 2009, 6 (5): 341-343 中的第 343 页 method 部分One-step isothermal DNA assembly—段中),通过运用等温,单反应的方法重组多个重叠的DNA分子，通 过外切酶，DNA聚合酶的联合作用准确的完成大分子扩增和基因重组过程。此
【发明内容】
的实现为其他的PAHs污染物的检测和降解修复提供宝贵的基础。
[0018]本发明的萘检测生物细胞传感器的构建原理如图1所示，技术路线如图2所示。
[0019]具体而言，本发明提供的一种萘检测生物细胞传感器，其特征在于:
[0020]所述萘检测生物细胞传感器为基因重组细胞，所述基因重组细胞以水杨酸检测光传感细胞为宿主细胞，并且所述基因重组细胞的质粒由萘降解基因与载体质粒重组。
[0021 ] 所述萘降解基因与所述载体质粒通过Gibson —步恒温法实现DNA重组(One-stepisothermal DNA assembly)得到所述基因重组细胞的质粒。
[0022]所述萘降解基因为NahAD ；
[0023]所述载体质粒为pWH1274 ；
[0024]所述水杨酸检测光传感细胞为不动杆菌ADPWH_lux(Acinetobacter ADPWH_lux)。
[0025]本发明还提供了一种所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
[0026]1)宿主细胞水杨酸检测光传感细胞的培养；
[0027]2)获取载体质粒和萘降解基因；
[0028]3)通过Gibson法将载体质粒和萘降解基因重组得到所述基因重组细胞的质粒；
[0029]4)将步骤3)得到的所述基因重组细胞的质粒转入步骤1)得到的宿主细胞水杨酸检测光传感细胞。
[0030]其中，所述步骤2)包括以下步骤:
[0031]2-1)载体质粒的选择与处理
[0032]其中，载体质粒的选择是选择带有强启动子质粒载体的菌株；本发明的实施例所需要的包含带有萘降解基因NahAD的质粒pDTGl的细菌——假单胞菌NCIB9816、包含质粒载体pWH1274的细菌——乙酸钙不动杆菌以及水杨酸检测光传感细胞不动杆菌ADPWH_lux均是由英国谢菲尔德大学黄巍教授赠与。
[0033](Huang, ff.E., Wang.Η., Zheng.Η.J., Huang.L.F., Singer.A.C., Thompson.L.and ffhiteley.A.S.(2005) Chromosomally located gene fusions constructedin Acinetobacter sp.ADP1 for the detection of salicylate.Environ.Microbiol.7(9):P1339_1348.)
[0034]其中，对载体质粒进行处理，包括以下步骤:
[0035]2-1-1)提取载体质粒、2-1-2)对载体质粒DNA进行检测、2_1_3)载体质粒聚合酶链式反应，即PCR (Polymerase Chain Reaction)、2-l_4)载体质粒的PCR产物的纯化、2-1-5) PCR产物的检测；
[0036]2-2)萘的降解基因的选择和处理，包括以下步骤:
[0037]其中，对萘的降解基因的选择是分析降解菌对PAHs污染物的降解机理，选择能够降解奈的囷株；
[0038]2-2-1)提取含萘的降解基因的质粒、2-2-2 )萘降解基因的质粒DNA的检测、2-2-3)所述含萘降解基因质粒的PCR反应、2-2-4) PCR产物的纯化、2_2_5) PCR产物的检测。
[0039]其中所述步骤2-1-3)的聚合酶链式反应中，质粒载体引物1274EcoRV的序列分别是:
[0040]1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC ；
[0041 ] 1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC ；
[0042]所述步骤2-1-3) PCR的反应体系共50 μ L，其中包括正向引物2.0 μ L，反向引物
2.0 μ L，10mM的四种脱氧核糖核苷三磷酸，即包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，或称为dNTPs，其加入体积是1 μ L，10 X缓冲液5 μ L，Dream Taq聚合酶0.5 μ L，模板质粒载体PWH1274为1 μ L，去离子水38.5 μ L，该步骤的热循环条件分别为:95°C预变性3min ；95°C变性30s ;56-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35个循环；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在 4。。。
[0043]其中所述步骤2-2-3)的聚合酶链式反应中，萘降解基因NahAD的引物序列分别是:
[0044]NahAD正向引物序列:
[0045]AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATTGACAT ATAACGTCGTATTCACG
[0046]NahAD反向引物序列:
[0047]GCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATACGATCAG GTCAACCACTTATATC
[0048]其中步骤2-2-2)的PCR的反应体系共50 μ L，其中包括正向引物2.Ομ L，反向引物 2.Ο μ L, 10mM 的 dNTPs 加入体积 1 μ L，10 X 缓冲液 5 μ L，Dream Taq 聚合酶 0.5 μ L，模板质粒pDTGl为1 μ L，去离子水38.5 μ L，该步骤的热循环条件分别为:95°C预变性3min ；95°C变性30s ;57-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35个循环；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在4 C。
[0049]所述步骤3)包括以下步骤: [0050]3-1)运用 Gibson—步恒温法(One-step isothermal DNA assembly)实现 DNA 重组、3-2) PCR产物的检测。
[0051]所述步骤3-1)的Gibson反应体系为20 μ L，其中5X恒温重组混合物(ISAmaster mixture) 15 μ L，载体质粒pWH1274的PCR产物与萘降解基因的PCR产物浓度均为10-100ng/ μ L，载体pWH1274的PCR产物与萘降解基因的PCR产物的体积共为5 μ L，在50°C反应一夜；
[0052]其中恒温重组混合物的组成包括:5 X恒温重组缓冲液40 μ L、0.2U/ μ L的T5外切酶4 μ L、2U/ μ L的Phusion聚合酶2.5 μ L、40U/ μ L的Taq DNA连接酶20 μ L以及去离子水共83.5 μ L ;
[0053]其中5Χ恒温重组缓冲液包括1Μ的ρΗ=7的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris_HCl)500μ L，2M的氯化镁(MgCl2) 25 μ LUOOmM的脱氧鸟苷三磷酸三钠(dGTP) 10 μ LUOOmM的去氧胞苷三磷酸(dCTP)lOy L、100mM的脱氧胸苷三磷酸(dTTP)10 μ L、lOOmM的三磷酸脱氧腺苷(dATP) 10μ L、1M 的二硫苏糖醇(DTT) 50 μ L、聚乙二醇 8000 (PEG-8000)为 0.25 μ L、50mM的辅酶I (NAD) 100 μ L和去离子水共75 μ L，其中用于T5外切酶稀释的缓冲液包括100%甘油10mL、lM的pH为7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris_HCl)为lmL、0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)4y L、1M的二硫苏糖醇(DTT)20 μ L、1M的氯化钠(NaCl)2 μ L、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 20 μ L和去离子水695 μ L。
[0054]所述步骤4)采用电转化实验步骤将步骤3)得到的所述基因重组细胞的质粒转入步骤1)得到的宿主细胞水杨酸检测光传感细胞。 [0055]所述质粒载体引物1274EcoRV的序列:
[0056]1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC ；
[0057]1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC ；
[0058]以及所述萘降解基因NahAD的引物序列:
[0059]NahAD正向引物序列:
[0060]AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATTGACAT ATAACGTCGTATTCACG[0061 ] NahAD反向引物序列:
[0062]GCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATACGATCAG GTCAACCACTTATATC
[0063]都列入序列表(SEQUENCE LISTING),上述序列均为人工(Artificial)序列。
[0064]本发明还提供了所述的萘检测生物细胞传感器的使用方法，其特征在于包括以下步骤:
[0065]1)将所述萘检测生物细胞传感器加入不同浓度的萘溶液中，记录所述萘检测生物细胞传感器对于不同浓度溶液在0-6h时的发光量，得出浓度与第3h时的发光量的线性关系;
[0066]2)根据上述浓度与第3h时的发光量的线性关系，根据所述萘检测生物细胞传感器在待测萘溶液中实际发光量计算出待测溶液中萘的浓度。
[0067]实验发现，所述萘检测生物细胞传感器在不同浓度的萘溶液诱导后的第3h时的发光量与浓度呈较好的线性关系，可以作为检测溶液中萘的浓度标准曲线。
[0068]本发明提供的萘检测生物细胞传感器，其为基因重组细胞，其以水杨酸检测光传感细胞为宿主细胞，包括由萘降解基因与载体质粒重组的质粒。本发明的细胞传感器在萘存在时立即有发光反应，选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简易和仪器价格低廉、能在复杂体系中进行在线连续稳定检测。本发明利用在水杨酸检测光传感细胞转入萘的降解质粒的方法构建的萘传感细胞，主要用于检测萘，而上述构建方法也可以用于构建其他多种PAHs生物传感细胞，且构建方法简单，快速，发光稳定。本发明还提供了所述细胞传感器的制备方法，所采用的构建条件温和、方法可控及简单易行，采用Gibson克隆技术完成了大分子降解片段的体外重组，是对专一污染底物——萘进行检测的重要手段。
[0069]具体而言，本发明的有益效果如下:
[0070]1.本发明所采用的构建条件温和、方法可控及简单易行，采用Gibson克隆技术完成了大分子降解片段的体外重组，是对专一污染底物进行检测的重要手段。
[0071]2.本发明通过降解基因的整合重组，结合染色体上构建的稳定的荧光报告基因进行报告，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、操作简易和仪器价格低廉、能在复杂体系中进行在线连续稳定检测等特点。
[0072]3.在环境石油类多环芳烃类污染物的检测中解决了对特定污染物——萘进行专一检测的实际问题。在完善我国现有检测技术手段具有重要意义和较好的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0073]图1为本发明的生物细胞传感器的构建原理图。
[0074]图2为本发明的技术路线图。
[0075]图3为本发明的生物细胞传感器ADPWH_Nah及对照组细胞ADPWH_1274对50 μ Μ萘的发光曲线与对DMS0的发光曲线对比图。
[0076]图4为本发明的生物细胞传感器ADPWH_Nah对于不同浓度萘的发光曲线对比图。
[0077]图5为本发明的生物细胞传感器ADPWH_Nah对于不同浓度萘诱导后的第3h时的发光量与萘浓度的关系图。
【具体实施方式】
[0078]如图2所示，本发明的技术路线如下:
[0079](1)水杨酸检测光传感细胞不动杆菌ADPWH_lux (Acinetobacter ADPWH_lux)的
培养
[0080]>前期工作是对已获得的水杨酸检测光传感细胞ADPWH_lux进行培养。
[0081](2)大分子片段萘降解基因和`载体质粒的获得
[0082]首先分析降解菌对PAHs污染物的降解机理。可通过已有报道获得需要的降解功能细菌或具有相关功能的降解质粒。载体质粒的选择是选择带有强启动子质粒载体的菌株。实施例所需要的包含带有萘降解基因NahAD的质粒pDTGl的细菌——假单胞菌NCIB9816、包含质粒载体pWH1274的细菌——乙酸钙不动杆菌以及水杨酸检测光传感细胞不动杆菌ADPWH_lux均是由英国谢菲尔德大学黄巍教授赠与。
[0083]>根据已知萘污染物质降解(同源)基因搜索，设计基因简并引物，定位、扩增降解基因片段。大分子片段的获得具有一定的难度，采用高效能PCR扩增多聚酶进行扩增。
[0084]>选择具有强启动子质粒pWH1274做载体，设计PCR扩增引物，扩增载体基因片段。与降解片段NahAD进行体外重组连接克隆。因为大分子的降解基因跟载体连接的困难，因此运用Gibson克隆的方法实现降解基因和质粒载体的连接。
[0085]>将重组质粒电转入到已构建好(含水杨酸检测的传感系统)的宿主细菌不动杆菌ADPWH_lux内。完成萘检测传感细胞的重组构建，检测基因的稳定表达及生物学性能分析。
[0086](3)细胞生物细胞传感器的敏感反应条件测试筛选和应用参数优化
[0087]>对萘检测细胞传感细胞在不同环境条件，如pH，温度，萘的最适浓度范围等因
素进行动力学测试分析，确定其应用的最佳敏感性和稳定性参数条件。
[0088]本发明的主要构建方法包括以下步骤:
[0089]A.水杨酸检测光传感细胞不动杆菌ADPWH_lux的培养[0090]>前期工作是对已获得的水杨酸检测光传感细胞不动杆菌ADPWH_lux进行培养。
[0091]B.大片段的萘降解基因的获得及体外重组质粒构建
[0092]1.载体质粒pWH1274的处理
[0093]1.1载体质粒pWH1274的提取
[0094]用天根生化科技(北京)有限公司生产的高纯度质粒小提试剂盒(目录号:DP104)从一株乙酸钙不动杆菌中提取载体质粒PWH1274。
[0095]1.1.1.柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L的平衡液BL，12，OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0096]1.1.2.取5mL过夜培养的菌液加入离心管中，12，OOOrpm离心lmin，尽量吸除上清。
[0097]1.1.3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μ L溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
[0098]1.1.4.向离心管中加入250 μ L溶液Ρ2，温和地上下翻转6_8次使菌体充分裂解。
[0099]1.1.5.向离心管中加入350 μ L溶液Ρ3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，12，OOOrpm离心lOmin,将上清转移到过滤柱CS。
[0100]1.1.6.12，OOOrpm离心2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液转移到吸附柱CP3 中。
[0101]1.1.7.12，OOOrpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
[0102]1.1.8.向吸附柱CP3中加入500 μ L去蛋白液PD，12，OOOrpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
[0103]1.1.9.向吸附柱CP3中加入600yL漂洗液PW，12，000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
[0104]1.1.10.重复操作步骤 1.1.9。
[0105]1.1.11.将吸附柱CP3放入收集管中，12，OOOrpm离心2min，目的是将吸附柱中残
余的漂洗液去除。
[0106]1.1.12.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 μ L洗脱缓冲液ΤΒ，室温放置2min，12，OOOrpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
[0107]1.2质粒DNA的检测
[0108]吸取5μ L质粒DNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余DNA存于_20°C冰箱。用1XTAE按照质量浓度比配制琼脂糖，在80V的电压下电泳，电泳结果经用溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统紫外下观察。
[0109]1.3PCR 质粒 pWH1274
[0110]其中引物由发明人设计，生工生物工程(上海)股份有限公司合成:
[0111]1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC
[0112]1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC
[0113]PCR的反应体系共50 μ L，其中包括正向引物2.0 μ L，反向引物2.0 μ L，10mM的四种脱氧核糖核苷三磷酸，即包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，或称为dNTPs，其加入体积是1 μ L，10 X缓冲液5 μ L，Dream Taq聚合酶(λ 5 μ L，模板质粒载体pWH1274为1 μ L，去离子水38.5 μ L，该步骤的热循环条件分别为:95°C预变性3min ;95°C变性30s ;56_60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35个循环，即PCR循环次数为35次；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在4°C ;具体见下表1。
[0114]表1PCR弓丨物及反应条件
【权利要求】
1.一种萘检测生物细胞传感器，其特征在于:所述萘检测生物细胞传感器为基因重组细胞，所述基因重组细胞以水杨酸检测光传感细胞为宿主细胞，并且所述基因重组细胞的质粒由萘降解基因与载体质粒重组。
2.根据权利要求1所述的萘检测生物细胞传感器，其特征在于:所述萘降解基因与所述载体质粒通过Gibson —步恒温法实现DNA重组(One-stepisothermal DNA assembly)得到所述基因重组细胞的质粒。
3.根据权利要求1所述的萘检测生物细胞传感器，其特征在于:所述萘降解基因为NahAD ；所述载体质粒为PWH1274 ；所述水杨酸检测光传感细胞为不动杆菌ADPWH_lux (Acinetobacter ADPWH_lux)。
4.一种如权利要求1~3所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤:1)宿主细胞水杨酸检测光传感细胞的培养；2)获取载体质粒和蔡降解 基因；3)通过Gibson—步恒温法将载体质粒和萘降解基因重组得到所述基因重组细胞的质粒;4)将步骤3)得到的所述基因重组细胞的质粒转入步骤1)得到的宿主细胞水杨酸检测光传感细胞。
5.根据权利要求4所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤2)包括以下步骤:2-1)载体质粒的选择与处理其中，载体质粒的选择是选择带有强启动子质粒载体的菌株；其中，对载体质粒进行处理，包括以下步骤:2-1-1)提取载体质粒、2-1-2)对载体质粒DNA进行检测、2_1_3)载体质粒聚合酶链式反应，即 PCR (Polymerase Chain Reaction)、2-l_4)载体质粒的 PCR 产物的纯化、2-1-5)PCR产物的检测；2-2)萘的降解基因的选择和处理，包括以下步骤:其中，对萘的降解基因的选择是分析降解菌对PAHs污染物的降解机理，选择能够降解萘的菌株；2-2-1)提取含萘的降解基因的质粒、2-2-2)萘降解基因的质粒DNA的检测、2_2_3)所述含萘降解基因质粒的PCR反应、2-2-4) PCR产物的纯化、2_2_5) PCR产物的检测。
6.根据权利要求5所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于:其中所述步骤2-1-3)的聚合酶链式反应中，质粒载体引物1274EcoRV的序列分别是:1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC ；1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC ；所述步骤2-1-3) PCR的反应体系共50 μ L，其中包括正向引物2.0 μ L，反向引物·2.0 μ L，10mM的四种脱氧核糖核苷三磷酸，即包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，或称为dNTPs，其加入体积是1 μ L，10 X缓冲液5 μ L，Dream Taq聚合酶0.5 μ L，模板质粒载体PWH1274为1 μ L，去离子水38.5 μ L，该步骤的热循环条件分别为:95°C预变性3min ；95°C变性30s ;56-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35个循环；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在 4。。；其中所述步骤2-2-3)的聚合酶链式反应中，萘降解基因NahAD的引物序列分别是:NahAD正向引物序列: AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATTGACAT ATAACGTCGTATTCACGNahAD反向引物序列:GCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATACGATCAG GTCAACCACTTATATC其中步骤2-2-2)的PCR的反应体系共50 μ L，其中包括正向引物2.Ο μ L，反向引物.2.Ο μ L，10mM的dNTPs加入体积1 μ L，10 X缓冲液5 μ L，Dream Taq聚合酶0.5 μ L，模板质粒pDTGl为1 μ L，去离子水38.5 μ L，该步骤的热循环条件分别为:95°C预变性3min ；95°C变性30s ;57-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35个循环；72°C最后延伸lOmin，最后保持在 4。。。
7.根据权利要求4所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤3)包括以下步骤:3-1)运用 Gibson—步恒温法(One-step isothermal DNA assembly)实现 DNA 重组、3-2) PCR产物的检测。
8.根据权利要求7所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤3-1)的Gibson反应体系为20 μ L，其中5X恒温重组混合物(ISA mastermixture) 15 μ L，载体质粒pWH1274的PCR产物与萘降解基因的PCR产物浓度均为10-100ng/ μ L，载体pWH1274的PCR产物与萘降解基因的PCR产物的体积共为5 μ L，在50°C反应一夜；其中恒温重组混合物的组成包括:5X恒温重组缓冲液40 μ L、0.2U/ μ L的T5外切酶4μ L、2U/y L的Phusion聚合酶2.5μ L、40U/y L的Taq DNA连接酶20 μ L以及去离子水共83.5 μ L ；其中5Χ恒温重组缓冲液包括1Μ的ρΗ=7的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)500μ L，2M的氯化镁(MgCl2) 25 μ LUOOmM的脱氧鸟苷三磷酸三钠(dGTP) 10 μ LUOOmM的去氧胞苷三磷酸(dCTP)10y L、100mM的脱氧胸苷三磷酸(dTTP)10 μ L、100mM的三磷酸脱氧腺苷(dATP) 10μ L、1M 的二硫苏糖醇(DTT) 50 μ L、聚乙二醇 8000 (PEG-8000)为 0.25 μ L、50mM的辅酶I (NAD) 100 μ L和去离子水共75 μ L，其中用于T5外切酶稀释的缓冲液包括100%甘油10mL、lM的pH为7.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris_HCl)为lmL、0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)4y L、1M的二硫苏糖醇(DTT)20 μ L、1M的氯化钠(NaCl)2 μ L、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 20 μ L和去离子水695 μ L。
9.根据权利要求4所述的萘检测生物细胞传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤4)采用电转化实验步骤将步骤3)得到的所述基因重组细胞的质粒转入步骤1)得到的宿主细胞水杨酸检测光传感细胞。
10.根据权利要求1~3所述的萘检测生物细胞传感器的使用方法，其特征在于包括以下步骤:1)将所述萘检测生物细胞传感器加入不同浓度的萘溶液中，记录所述萘检测生物细胞传感器对于不同浓度溶液在0-6h时的发光量,得出浓度与第3h时的发光量的线性关系；2)根据上述浓度与第3h时的发光量的线性关系，根据所述萘检测生物细胞传感器在待测萘溶液中实际发 光量计算出待测溶液中萘的浓度。
【文档编号】G01N21/76GK103695363SQ201310752396
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】孙寓姣, 赵晓辉, 丁爱中, 陈程, 张惠淳 申请人:北京师范大学