专利名称：一种半定量检测孕酮胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物监测试剂领域，涉及一种半定量检测孕酮胶体金试纸条。
背景技术：
早期妊娠诊断(配种后一个情期内)在家畜繁殖中意义重大。母畜血液或乳汁中孕酮(P4)浓度变化范围是反应母畜所处生理状态的一项特异性指征。在妊娠早期，母畜外周血浆中的孕酮含量远高于发情期，所以可通过测定血液中的孕酮含量来进行早期妊娠诊断。母畜P4的主要来源是卵巢黄体及胎盘，处于妊娠早期的母畜，其外周血浆和乳中P4含量维持较高水平。所以，通过测定血液、乳汁或尿液中P4的浓度，可以对其进行早期妊娠诊断。早期妊娠诊断对于减少空怀时间、缩短产仔(羔)间隔、提高繁殖效率和养殖业的经济效益具有重要意义。胶体金免疫层析技术是20世纪80-90年代在酶联免疫吸附技术、乳胶凝集技术、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型快速简易免疫检测技术，其检测结果通过肉眼即可判断，操作简便且耗时短，已经广泛用于食品安全检测等领域。目前，虽然人的早孕诊断试纸已很成熟，但在家畜上仍缺少简便易行、成本低的早孕诊断方法。目前家畜妊娠诊断方法主要有外部观察法、直肠诊断法、阴道检查法、公畜试情法、免疫学诊断法、早孕因子诊断法(EPF)、血小板计数法、超声波诊断法及孕酮测定法等，或多或少存在耗费时间长、过程繁琐、仪器昂贵、技术人员缺乏、准确率偏低、只适用于妊娠中晚期、对母畜有一定损伤等缺点。其中孕酮测定是早孕诊断常用的方法。目前测定P4的方法主要有放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、乳胶凝集抑制试验(LAIT)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等。放射免疫测定法(RIA)具有特异性强、取样少、测定样本多的优点，但是该法对设备条件和操作人员的技术水平要求比较高，费时且又有放射性潜在危害，从而限制了该技术的普及应用；酶联免疫测定法(EIA)快速、灵敏、重复性好，常用于乳中P4的测定；乳胶凝集抑制试验(LAIT)是一种利用样品中的P4与P4抗体发生竞争性结合来快速定性测定P4浓度的一种免疫测定方法，LAIT的灵敏度比ELISA低，但未孕诊断的准确率较ELISA高；近年来国外用ELISA测定孕酮进行妊娠诊断取得了较大进展，一些成套的试剂盒已经面市，使得在牧场实地测定孕酮，进行早期妊娠诊断成为现实。然而在生产实践应用中发现ELISA敏感度较低，背景较深，结果判定比较困难，测定结果不够稳定等问题。上述各种孕酮测定方法由于操作比较复杂，对专业设备及操作人员的技术水平要求比较高、费时、成本偏高、对于一些基层农户及中小养殖场难以推广使用。鉴于上述原因，研究新型适用于早期妊娠诊断的、敏感、特异、简便、准确和容易操作的孕酮检测技术就显得十分必要，这对提高家畜繁殖效率、提高养殖业的经济效益具有重要意义。
实用新型内容本实用新型的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种半定量检测孕酮胶体金试纸条。[0005]本实用新型的目的可通过如下技术方案实现:一种半定量检测孕酮胶体金试纸条，包括含有金标孕酮抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜样品垫、吸水垫、PVC底板；所述的玻璃纤维膜样品垫、含有金标孕酮抗体复合物的金标垫与硝酸纤维素膜由上而下依次交叠粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜的另一侧粘贴有吸水垫；硝酸纤维素膜上有检测线和对照线。其中，检测线距离含有金标孕酮抗体复合物的金标垫近于对照线。检测线包被Ila-羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物。对照线包被羊抗小鼠IgG 二抗。有益效果:半定量检测孕酮胶体金试纸条采用全新的技术方案，具有操作简单、检测时间短、结果清晰、可通过肉眼判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、无污染及携带方便等优点。可在养殖场现场采样，现场出结果，方便实用。利用该试纸条检测配种或胚胎移植后的母畜(一个月内)，对未孕母畜进行及时的补配或淘汰，从而大大降低饲养成本及产科疾病发生率，提高繁殖效率和经济效益。本实用新型工艺简单，操作方便，经济实用，更容易在基层推广。
图1.半定量检测孕酮胶体金试纸条俯视图；其中，I为样品垫，2为金标垫，3为检测线，4为对照线，6为吸水垫，7为硝酸纤维素膜。图2.半定量检测孕酮胶体金试纸条侧视结构示意图；其中，1为样品垫,2为金标垫,5为PVC底板,6为吸水垫,7为硝酸纤维素膜。
具体实施方式
实施例1一种半定量检测孕酮胶体金试纸条，如图广2所示，试纸条大小为7.5cmX0.5cm,包括含有金标孕酮抗体复合物的金标垫2、硝酸纤维素膜7、玻璃纤维膜样品垫1、吸水垫6、PVC底板5 ;吸水垫6长2.5cm、样品垫I长2cm、金标垫2长0.5cm、硝酸纤维素膜7长2.5cm ；硝酸纤维素膜7贴在PVC底板5上，与PVC底板5吸水端边缘相距2.5cm ;所述的玻璃纤维膜样品垫1、含有金标孕酮抗体复合物的金标垫2与硝酸纤维素膜7由上而下依次交叠粘贴在PVC底板上，金标垫2位于样品垫I与硝酸纤维素膜7之间，金标垫2与硝酸纤维素膜7的交叠长度为0.25cm ;硝酸纤维素膜7的另一侧吸水垫6与硝酸纤维素膜7交叠贴于底板吸水端。硝酸纤维素膜上有检测线3和对照线4。检测线3喷涂11 a羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物，Ila-羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物喷涂浓度为1.6mg/mL。对照线4喷涂羊抗小鼠IgG 二抗,羊抗小鼠IgG 二抗的喷涂浓度为1.2mg/mL。对照线4距吸水垫6近端
0.6cm,检测线3与吸水垫6近端相距1.1cm检测线和对照线之间为0.5cm。实施例2湖羊早期妊娠诊断试纸条一种能检测早期怀孕湖羊的胶体金试纸条，其由含有孕酮抗体的玻璃纤维素膜金标垫2、硝酸纤维素膜7、玻璃纤维膜样品垫1、吸水垫6、PVC底板5等组成，试纸条检测原理米用竞争法。试纸条大小为7.5cmX0.5cm,吸水垫长2.5cm、样品垫长2cm、金标垫长0.5cm、硝酸纤维素膜2.5cm。将硝酸纤维素膜贴在底板上，与底板吸水端边缘相距；然后依次将吸水垫与硝酸纤维素膜交叠贴于底板吸水端，再依次将样品垫、金标垫与硝酸纤维素由上而下依次交叠，金标垫位于样品垫和硝酸纤维素膜之间，金标垫与硝酸纤维素膜的交叠长度为0.2mm。本试纸条中各材料的材质如下:底板为国产的PVC材料(J-B6)，外观呈白色；吸水垫采用国产的吸水材料，型号为H-8 ;硝酸纤维素膜型号为Milliporel35 ;金标垫为进口的玻璃纤维膜，型号为Ahlstrom8964 ;样品垫为国产的玻璃纤维膜，型号为GF-08 ;对照线4 (C线)和检测线3 (T线)的相对位置:C线距吸水垫近端0.6cm、T线与吸水垫近端相距1.3cm。金标垫处理:将型号为Ahlstrom8964的玻璃纤维素膜浸入金标垫处理液(0.5%BSA、l%Tween-20、0.02%PEG20000、10%蔗糖)中4°C过夜，37°C烘干。金标孕酮单克隆抗体复合物的纯化:将金标抗体在4°C下用1500r/min低速离心15min,小心吸取上清液,弃去沉淀；然后将上清再以13000r/min(4°C)离心lh，弃去上清，最后将沉淀以原体积的PH8.20.0lmol/LTBS (内含1%BSA，0.02%叠氮钠)溶解，重复离心洗涤2 3次，原体积的1/10重悬沉淀。把处理好的玻璃纤维膜浸入金标孕酮单抗复合物，待其充分浸透后取出，用真空冻干机冻干。C线羊抗小鼠二抗喷涂浓度大于0.2mg/mL,本实用新型中的C线喷涂浓度为1.2mg/mL ；T线的11 α -羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物喷涂浓度为1.6mg/mL。一种能检测早期怀孕湖羊的胶体金试纸条的制备方法，其制备步骤如下:第一步，采用柠檬酸还原法制备胶体金:取终浓度0.01%的氯金酸溶液，加热至沸腾，搅动下快速准确加入现配的1%柠檬酸三钠水溶液，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为红色，中档继续煮沸5min直至颜色稳定不变，冷却后用超纯水恢复到原体积，加入0.02%的Na2N3,经0.22 μ m滤膜过滤除菌，装入洁净的经硅化的棕色瓶中4°C保存备用。本实用新型中制备的胶体金颗粒应在30nm左右。第二步，金标孕酮抗体复合物的制备:用0.2mol/L K2CO3调节胶体金溶液的pH至8.2 (单克隆抗体的等电点)，取10个离心管，分别装入0.25mL胶体金，然后依次加入0μ L、15y L、20y L、25y L、30y L、35y L、40 μ L、45 μ L、50 μ L、0 μ L量的浓度为0.lmg/mL孕酮单克隆抗体，混匀。5min后，在上述各离心管中分别加入0.25mL10%NaCl溶液。轻轻摇匀，室温静置2h后观察各管中胶体金溶液变化情况，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。使胶体金溶液保持红色不变的最小抗体用量即为最低稳定量，在此基础上再加20%即为最适稳定量。取所需量抗体在磁力搅拌下与胶体金溶液混合，缓慢逐滴加入最佳标记量的单克隆抗体，Img的蛋白质大约5min加完，标记30min ;缓慢滴加5%BSA至终浓度为0.5%作为稳定剂，制备金标抗体。将金标抗体在4°C下用1500r/min低速离心15min,小心吸取上清液,弃去沉淀；然后将上清再以13000r/min4°C离心lh，弃去上清，最后将沉淀以原体积的PH8.20.01mol/LTBS (内含1%BSA，0.02%叠氮钠)溶解，重复离心洗涤2 3次，原体积的1/10重悬沉淀。采用最高吸收峰检测法、0D520nm值测定法和电镜观察法来鉴定金标记孕酮单克隆抗体复合物的质量。[0028]第三步，胶体金试纸膜的制备:用Bio-dot XYZ-3050三维喷点仪中的Arijet喷膜，将11 α羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物和羊抗小鼠IgG分别以1.6mg/mL、1.2mg/mL的浓度包被NC膜，作为检测线和对照线。金标抗体涂抹于已处理好的玻璃纤维膜上，用真空冻干机冻干。第四步，测试条的组装:将NC膜贴于PVC板上，样品垫与金标垫依次贴于NC膜划有检测线的一端，吸水垫贴于划有质控线的一端，彼此重叠处约2_宽。最后用裁纸刀将其切成5_的试纸条。第五步，检测方法:采集配种后一个情期未返情的母畜的血液0.1mL滴到试纸条的样品垫上，水平放置，Smin内可出检测结果，然后与标准试纸条进行对照即可得出结果。第六步，结果判断:本实用新型的孕酮试纸条的原理为竞争法。当血清中孕酮浓度高于极限值时，血清中的孕酮会将金标垫上的金标孕酮抗体全部结合，形成金标抗体一孕酮复合物不会被检测线截留，当该复合物层析到对照线时，会被二抗截留从而显色。因此阳性结果为:检测线3不显色，而对照线4显色；而当血清中的孕酮浓度低于极限值时，血清中的孕酮不能将金标垫上的金标孕酮抗体全部结合，一部分金标抗体复合物会被检测线截留从而检测线显色。因此，阴性结果为:检测线3和对照线4均显色。当对照线不显色时，说明试纸条已失效。
试纸条在湖羊早孕诊断中的实测结果:对85头配种后21天未出现返情的湖羊采用放射免疫测定法(RIA)测定其外周血中的孕酮含量。结果表明，妊娠羊的孕酮含量为2.33±0.70ng/mL，未妊娠羊的孕酮含量为
1.24±0.33ng/mL,怀孕羊的孕酮水平高于未怀孕羊,且差异显著(P〈0.05)。设定孕酮含量大于1.7ng/mL为妊娠,低于1.5ng/mL为未妊娠。根据上述标准，妊娠确诊率为100%,未妊娠确诊率为82.61%。用本试纸条临床检测54头湖羊，与生产记录进行对比后发现，妊娠准确率为83.3%，且试纸条的特异性、重复性及稳定性良好。
权利要求1.一种半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是:包括含有金标孕酮抗体复合物的金标垫(2)、硝酸纤维素膜(7)、玻璃纤维膜样品垫(I)、吸水垫(6)、PVC底板(5);所述的玻璃纤维膜样品垫(I)、含有金标孕酮抗体复合物的金标垫(2)与硝酸纤维素膜(7)由上而下依次交叠粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜(7)的另一侧粘贴有吸水垫(6);硝酸纤维素膜上有检测线(3)和对照线(4)。
2.根据权利要求1所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是:检测线(3)距离含有金标孕酮抗体复合物的金标垫(2)近于对照线(4)。
3.根据权利要求2所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是:检测线(3)喷涂Ila-羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物。
4.根据权利要求2所述的半定量检测孕酮胶体金试纸条，其特征是:对照线(4)喷涂羊抗小鼠IgG 二抗。
专利摘要本实用新型属于生物监测试剂领域，公开了一种半定量检测孕酮胶体金试纸条。一种半定量检测孕酮胶体金试纸条，包括含有金标孕酮抗体复合物的金标垫、硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜样品垫、吸水垫、PVC底板；所述的玻璃纤维膜样品垫、含有金标孕酮抗体复合物的金标垫与硝酸纤维素膜由上而下依次交叠粘贴在PVC底板上，硝酸纤维素膜的另一侧粘贴有吸水垫；硝酸纤维素膜上有检测线和对照线。半定量检测孕酮胶体金试纸条由于采用了全新的技术方案，具有操作简单、检测时间短、结果清晰、可通过肉眼判定结果、无需复杂操作技巧和特殊设备、灵敏度高、无污染及携带方便等优点。
文档编号G01N33/577GK203069598SQ20132000286
公开日2013年7月17日 申请日期2013年1月5日 优先权日2013年1月5日
发明者王 锋, 王子玉, 许欣 申请人:南京农业大学