利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序的制作方法

利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序的制作方法
【专利摘要】提供一种能够在基于利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量逐个检测单个粒子的扫描分子计数法的单个粒子检测技术中，在非发光粒子和发光粒子混合存在的样本溶液中分别识别并检测非发光粒子和发光粒子的存在的技术。关于本发明的检测样本溶液中的单个粒子的技术，一边使显微镜的光检测区域的位置在包含非发光粒子和发光粒子的样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光，生成按时间序列的光强度数据，将时序光强度数据中相对于背景光强度的光强度的增大检测为表示发光粒子的存在的信号，将相对于背景光强度的光强度的下降检测为表示非发光粒子的存在的信号。
【专利说明】利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种单个粒子检测技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统测量依赖于单个粒子的存在的光强度的变化来检测单个粒子并进行各种分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序。

【背景技术】
[0002]由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的光分析计数。作为这样的光分析技术，例如已知有突光相关光谱分析(Fluorescence Correlat1n Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献1_3、非专利文献1-3)、突光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribut1nAnalysis:FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon CountingHistogram:PCH。例如专利文献5)等。另外,在专利文献6?8中提出了一种根据使用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。
[0003]并且，本申请的 申请人:在专利文献9?11中提出了一种利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的、基于与FCS、FIDA等光分析技术不同的原理的新的光分析技术。在上述的FCS、FIDA等光分析技术的情况下，如果清楚地进行描述则是，针对通过连续地测量来自浮游于作为样本溶液内的光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的荧光分子的光而得到的光强度数据执行统计性的运算处理，从而检测荧光分子的浓度和/或其它特性。与此相对，在专利文献9?11所提出的新的光分析技术中，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发出光的粒子(发光粒子)时逐个检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐一地进行检测来进行发光粒子的计数、获取与样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十UL左右)，另外，测量时间短(在一次测量中反复进行多次秒级时间的测量。)，并且能够在作为观测对象的粒子的浓度低于FCS、FIDA等光分析技术能够良好地进行测量的水平(InM左右)的样本溶液中检测发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。因而，期待“扫描分子计数法”在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查且能够检测无法良好地执行FCS、FIDA等的程度的更低浓度的粒子的浓度和/或特性的强力工具。
[0004]专利文献1:日本特开2005-098876
[0005]专利文献2:日本特开2008-292371
[0006]专利文献3:日本特开2009-281831
[0007]专利文献4:日本特许第4023523号
[0008]专利文献5:国际公开2008-080417
[0009]专利文献6:日本特开2007-20565
[0010]专利文献7:日本特开2008-116440
[0011]专利文献8:日本特开平4-337446号公报
[0012]专利文献9:国际公开第2011/108369
[0013]专利文献10:国际公开第2011/108370
[0014]专利文献11:国际公开第2011/108371
[0015]专利文献12:国际公开2010-119098
[0016]非专利文献1:金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438页1999年
[0017]非专利文献2:F.J.Meyer-Alms> 突光相关谱(Fluorescence Correlat1nSpectroscopy)、R.Rigler 编、Springer、柏林、2000 年、204-224 页
[0018]非专利文献3:加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol.6、N0.2,271-277页
[0019]非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))


【发明内容】

[0020]发明要解决的问题
[0021]另外，在如上所述的扫描分子计数法中使用的共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的情况下，由于光轴方向的分辨率高于普通的光学显微镜，因此在从共焦区组织(光检测区域)释放出有意义的背景光的情况下，当不发光的单个粒子通过共焦区组织的内部时，观测到来自共焦区组织的光强度的下降(专利文献12)。因此，本申请的 申请人:在日本特愿2011-184635中提出了如下一种“反转型扫描分子计数法”:使用不发光的单个粒子作为观测对象粒子，利用与通过光检测区域扫描释放出实质固定的背景光的样本溶液内的“扫描分子计数法”同样的方法进行光的检测，检测不发光或发光强度低于背景光的单个粒子被包含在光检测区域内时的单个粒子的光强度的下降，从而检测单个粒子的存在。根据所述的“反转型扫描分子计数法”，能够检测低浓度的不发光的单个粒子。
[0022]另外，根据本发明的发明人等的研究发现，如上述的“反转型扫描分子计数法”的情况那样，即使在来自共焦区组织的光中存在有意义的背景光，如果来自发光粒子的发光强度高于背景光，则也能够逐个检测单个发光粒子所释放的光。因而，在包含在检测光波长下不发光或发光强度低于背景光的单个粒子(以下称为“非发光粒子”。)和在检测光波长下发光强度高于背景光的单个发光粒子的溶液中，如果进行依照扫描分子计数法的光测量，贝1J与非发光粒子对应的信号(光强度的变化)表现为向下凸，与发光粒子对应的信号表现为向上凸。即，在这种情况下，能够同时且相互区分地检测包含在同一样本溶液中的非发光粒子和发光粒子各自的存在。在本发明中，有利地利用所述知识。
[0023]这样，本发明的主要课题在于提供一种在检测光波长下不发光或发光强度低于背景光的单个粒子(非发光粒子)和在检测光波长下发光强度高于背景光的单个粒子(发光粒子)包含在同一样本溶液内的情况下能够利用扫描分子计数法的原理来识别并检测非发光粒子和发光粒子各自的存在的单个粒子检测技术。
[0024]用于解决问题的方案
[0025]根据本发明的一个方式，通过下述单个粒子检测装置来达成上述课题，该单个粒子检测装置使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测装置的特征在于，包括:光检测区域移动部，其使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个单个粒子的存在的信号，其中，由光检测部检测出的来自光检测区域的光包含实质固定的背景光，单个粒子包含具有比背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，第一单个粒子的信号为在该第一单个粒子进入到光检测区域内时产生的、由光检测部检测出的光强度的增大，第二单个粒子的信号为在该第二单个粒子进入到光检测区域内时产生的、由光检测部检测出的光强度的下降。
[0026]在所述结构中，“在样本溶液中分散并随机运动的单个粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等，只要是不固定在基板等上而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚到的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。)。“上述来自光检测区域的光包含实质固定的背景光”是指光检测区域内不存在作为观测对象的单个粒子时的检测光(即，背景光)的强度值为收敛于允许误差范围内的有意义的强度值。换言之，背景光被调节成其变动与单个粒子进入到光检测区域内时产生的检测光的强度的变动幅度相比充分小。此外，在本说明书中，在称为“单个粒子的信号”的情况下，只要没有特别限定，就是指表示单个粒子的存在的信号。“逐个检测表示各个单个粒子的存在的信号”即是指按每个单个粒子逐一地检测按时间序列的光强度数据上的单个粒子进入到光检测区域内时产生的光强度的暂时性的增大或下降。另外，在下面，将具有比背景光的发光强度高的发光强度的单个粒子(第一单个粒子)称为“发光粒子”，将具有比背景光的发光强度低的发光强度的单个粒子(第二单个粒子)称为“非发光粒子”。即，关于非发光粒子，优选检测光的波长频带下的发光强度几乎为0，但是即使是与背景光的强度相比有意的低水平，也是可以允许的。
[0027]如从上述理解的那样，在本发明的装置中，基本上与专利文献9?11所记载的“扫描分子计数法”同样地，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边逐次进行光的检测。在所述结构中，在来自光检测区域的光中包含了有意义的强度的背景光的情况下，在发光粒子(第一单个粒子)进入到光检测区域时或在样本溶液内移动的光检测区域包含有发光粒子时，由于发光粒子的存在而来自光检测区域的到达光检测部的光强度或光量增大，在非发光粒子(第二单个粒子)进入到光检测区域时或在样本溶液内移动的光检测区域包含有非发光粒子时，由于非发光粒子的存在而来自光检测区域的到达光检测部的光强度或光量下降。这样，在本发明的装置中，在样本溶液中包含发光粒子和非发光粒子作为观测对象粒子即单个粒子的情况下，以从光检测区域检测出有意义的(比发光粒子的光强度低且比非发光粒子的光强度高的值的)背景光强度的状态进行光检测，生成时序光强度数据。然后，在时序光强度数据上，将光强度或光量的增大和/或下降分别逐个检测为第一和第二单个粒子的信号，从而以第一和第二单个粒子的存在被相互识别出的方式进行检测。根据所述结构，样本溶液中的互不相同的粒子、即各第一和第二粒子被分开检测出、即按种类被检测出，按种类获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。换言之，在本发明的装置中，在某检测波长频带下的光测量中，能够逐个检测种类互不相同的至少两种单个粒子。
[0028]在上述本发明的装置中，作为来自光检测区域的光中应该包含的背景光，可以是在样本溶液内分散的物质所产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光。在这种情况下，可以在释放光或使光散射的物质未分散于作为样本溶液使用的溶液中的情况下，在所述溶液中主动地溶解或分散释放光或使光散射的物质。另外，在作为样本溶液使用的溶液发出自体荧光的情况下，可以利用该自体荧光作为上述背景光。特别是在产生背景光的物质以及作为观察对象粒子的发光粒子需要激励光或照明光的情况下，在显微镜装置中配备照明光用的光源和光学系统。另一方面，在产生背景光的物质没有激励光或照明光而发光的情况下，例如在通过化学发光或生物发光而发光的物质的情况下，在显微镜装置中不需要照明光。并且，应该理解到，对于背景光，如果在光检测区域内存在非发光粒子的情况下减少，则也可以是通过透射照明等产生的照明光。
[0029]另外，在上述本发明的装置中的发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系中，优选发光粒子的发光强度大到足以能够与背景光强度相区分。因此，优选的是，调整发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系，使得发光粒子的发光强度高于从与光检测区域内存在发光粒子时的排除体积相当的体积区域释放的背景光强度。即，优选调整背景光强度和发光粒子的发光强度使得从每单位体积的发光粒子(第一单个粒子)释放的发光强度超过从每单位体积的光检测区域内发出的背景光强度。另一方面，在本发明的装置中的非发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系中，如果调整非发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系使得非发光粒子的发光强度低于从与光检测区域内存在非发光粒子时的排除体积相当的体积区域释放的背景光强度，则由于非发光粒子的存在而产生光强度的减少。因而，优选调整背景光强度和非发光粒子的发光强度使得从每单位体积的非发光粒子(第二单个粒子)释放的发光强度低于从每单位体积的光检测区域内发出的背景光强度。特别是在检测由于非发光粒子的存在而引起的背景光的减少的情况下，背景光的减少程度依赖于非发光粒子的尺寸与光检测区域的尺寸之间的关系。关于该点，根据考虑了后面记述的背景光的变动幅度的估计，发现在非发光粒子的发光强度实质为O的情况下，优选的是，非发光粒子的外径为光检测区域的直径的15%以上，更为优选的是，非发光粒子的外径为光检测区域的直径的35%以上。(参照日本特愿2011-184635)。在发光粒子的情况下，每单位体积的发光强度越强，则能够检测的发光粒子的外径与光检测区域的直径之比越小。对于背景光的调节，例如可以通过调节样本溶液中任意发光物质的分散量来进行。
[0030]可以根据单个粒子的特性或者样本溶液中的数密度或浓度适当地变更上述本发明的装置中的光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度。特别地，当光检测区域的移动速度变快时，由于单个粒子的存在而引起的光强度或光量的增大/下降的程度减少，因此优选的是，能够适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度或高灵敏度地测量由单个粒子引起的光强度或光量的增大/下降。
[0031]另外，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的单个粒子的扩散移动速度(由布朗运动引起的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，本发明的装置在光检测区域通过单个粒子的存在位置时检测由于该单个粒子的存在而引起的光强度或光量的增大/下降来逐个检测单个粒子。然而，单个粒子在溶液中由于进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，导致从一个单个粒子多次检测到表示其存在的信号，难以使检测出的信号与一个单个粒子的存在对应起来。因此，如上述那样，将光检测区域的移动速度设定得比单个粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个单个粒子对应一个(表示单个粒子的存在的)信号。此外，扩散移动速度因单个粒子的特性的不同而变化，因此，如上所述，优选的是本发明的装置构成为能够根据单个粒子的特性(特别是扩散系数)适当地变更光检测区域的移动速度。
[0032]可以通过任意的方式进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动。例如，可以使用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜(Galvano-miiror)等变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置，或者可以(例如移动显微镜的台等)移动样本溶液的位置来移动光检测区域在样本溶液内的相对位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。特别是在变更显微镜的光学系统的光路来变更光检测区域的位置的情况下，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此作为检测对象的单个粒子不会受到力学作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。
[0033]另外，在上述本发明的装置的信号处理部的处理中，可以根据由光检测部检测出的按时间序列的表示光的信号的形状来进行根据逐次的来自光检测部的检测值的信号判断是否一个粒子进入到了光检测区域的判断。在一个实施方式中，可以在检测出从背景光的强度起进行计量而具有比规定的阈值高或低的光强度的信号时，判断为一个单个粒子进入到了光检测区域。更具体地说，如后面的实施方式一栏中说明的那样，通常表示单个粒子的存在的信号在光检测部的按时间序列的检测值、即光强度数据上表现为超过某种程度的强度的向上凸的吊钟型的脉冲状的信号(在发光粒子的情况下)、或者表现为低于某种程度的强度的向下凸的吊钟型的脉冲状的信号(在非发光粒子的情况下)，噪声不是吊钟型的脉冲状或者表现为振幅小的信号。因此，本发明的装置的信号处理部可以构成为将时序光强度数据上从背景光的强度起进行计量而超过规定阈值的向上凸的吊钟型的脉冲状的信号或低于规定阈值的向下凸的吊钟型的脉冲状的信号检测为表示单个粒子的存在的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为适当的值。
[0034]并且，通过本发明的装置得到的光强度比较微弱，产生细小的增加和减少，所述的光强度的细小的增加和减少使表示单个粒子的存在的信号的检测精度变差。因此，信号处理部可以构成为使按时间序列的光强度数据平滑化，在对数据进行加工以能够忽略光强度的细小的增加和减少之后，将平滑化后的时序光强度数据上从背景光的强度起进行计量而超过规定阈值的向上凸的吊钟型的脉冲状的信号或者具有低于规定阈值的强度的向下凸的吊钟型的脉冲状的信号检测为表示单个粒子的存在的信号。
[0035]并且，在另一个实施方式中，单个粒子的信号的检测处理可以通过以下方式进行(参照日本特愿2012-32421):计算光强度数据上的光强度的时间变化的、假定在光检测区域内不存在单个粒子的状态的情况下的产生概率和假定在光检测区域内存在单个粒子的状态的情况下的产生概率，根据这些产生概率检测单个粒子在光检测区域内存在的时间来检测表示各个单个粒子的存在的信号。如果清楚地进行描述，则在扫描分子计数法的时序光强度数据上发现，噪声始终是随机地瞬间的光强度的增大/下降，与此相对地，如果是单个粒子的信号，则是在时间上集中的光强度的增大/下降。即，单个粒子的信号和噪声在时序光强度数据上的光强度值的时间变化的图案不同，因此在时序光强度数据上的某部分的光强度值的时间变化的图案为在光检测区域内没有单个粒子的情况下容易产生的图案时，能够判断为该部分是只有噪声的部分，在时序光强度数据上的某部分的光强度值的时间变化的图案为在光检测区域内存在单个粒子的情况下容易产生的图案时，能够判断为该部分是与单个粒子的信号对应的部分。因此，计算在时序光强度数据上出现的光强度值的时间变化的图案的、在光检测区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况的各个情况下产生的概率，辨别该光强度值的时间变化的图案是在光检测区域内存在单个粒子的情况和在光检测区域内不存在单个粒子的情况的哪一个情况下容易产生的图案，由此能够检测单个粒子的信号。
[0036]并且，在上述本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测区域中的单个粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在这种情况下，通过将所检测出的单个粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被分类的单个粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度之比，或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比来确定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等而能够确定出光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算单个粒子的数密度或浓度。特别地，在本发明的情况下，能够对混合存在于同一样本溶液中的发光粒子和非发光粒子分别分开地进行计数和/或浓度的估算。
[0037]此外，关于如上所述的粒子的计数，在其典型的方式中是对在任意设定的测量时间中获得的单个粒子的信号的个数进行计数。然而，在这种情况下，根据设定的测量时间的长度的不同而检测出的单个粒子的信号数发生变动，特别地，在单个粒子浓度低时，基于检测信号数估算的单个粒子浓度值的偏差变大而精度可能下降。因此，在上述本发明的装置中，作为粒子计数的其它方式，可以执行测量直到单个粒子的信号数达到任意设定的个数为止，根据测量时间估算单个粒子浓度值。即，上述本发明的装置可以构成为重复进行光检测区域移动部使光学系统的光检测区域的位置的移动、光检测部对来自光检测区域的光的检测以及信号处理部对表示单个粒子的存在的信号的检测直到信号处理部检测出的表示单个粒子的存在的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据表示单个粒子的存在的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的单个粒子的浓度。在这种情况下，对于单个粒子的浓度高的样本溶液，期待测量时间的缩短，对于单个粒子的浓度低的样本溶液，花费充分的时间执行测量。即，根据上述结构，与单个粒子的浓度相应地使测量时间最优化。另外，如果事先将预先决定的个数设定为达成结果所要求的精度的个数，则能够将检测预先决定的该个数的单个粒子所需要的时间或基于时间导出的任意结果中的偏差抑制得小，从而满足结果的精度。
[0038]在上述本发明的装置中，也能够通过通用的计算机实现一边使光检测区域的位置在发光粒子和非发光粒子混合存在的样本溶液内移动一边在背景光的存在下进行光检测并将光强度或光量的增大或下降分别逐次地检测为发光粒子或非发光粒子的信号的单个粒子检测技术的处理。因而，根据本发明的另一个方式，提供一单个粒子检测用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测用计算机程序使计算机执行以下步骤:使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据；以及在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个单个粒子的存在的信号；其中，检测出的来自光检测区域的光包含实质固定的背景光，单个粒子包含具有比背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，第一单个粒子的信号为在该第一单个粒子进入到光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的增大，第二单个粒子的信号为在该第二单个粒子进入到光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的下降。此外，通过存储到计算机能够读取的存储介质中来提供计算机程序。计算机通过读出存储在存储介质中的程序来执行信息的加工、运算处理，由此实现上述步骤。在此，计算机能够读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、⑶_R0M、DVD-R0M、半导体存储器等。并且，上述的程序也可以通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
[0039]在所述的结构中也同样，背景光可以是分散在样本溶液内的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光、或者是照明光。另外，优选的是，调整背景光强度以及发光粒子和非发光粒子的发光强度，使得在发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系中，从每单位体积的发光粒子(第一单个粒子)释放的发光强度超过从每单位体积的光检测区域内发出的背景光强度，并且在非发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系中，从每单位体积的非发光粒子(第二单个粒子)释放的发光强度低于从每单位体积的光检测区域内发出的背景光强度。特别地，非发光粒子的外径优选为光检测区域的直径的15%以上，更优选为光检测区域的直径的35%以上。
[0040]另外，在上述的计算机程序中，也可以根据按时间序列的信号的形状来进行表示各个单个粒子的存在的信号的逐个检测。在实施方式中，典型地是，在逐个检测表示单个粒子的存在的信号的步骤中，可以形成为在检测出从背景光的强度起进行计量而具有高于规定的阈值的光强度的信号时，判断为一个发光粒子进入到了光检测区域，在检测出从背景光的强度起进行计量而具有低于规定的阈值的光强度的信号时，判断为一个非发光粒子进入到了光检测区域。具体地说，在逐个检测表示单个粒子的存在的信号的步骤中，可以将时序光强度数据上从背景光的强度起进行计量而具有超过规定阈值的强度的向上凸的吊钟型的脉冲状信号检测为表示发光粒子的存在的信号，将从背景光的强度起进行计量而具有低于规定阈值的强度的向下凸的吊钟型的脉冲状信号检测为表示非发光粒子的存在的信号，此时，可以对时序光强度数据进行平滑化，将平滑化后的时序光强度数据上的吊钟型的脉冲状信号检测为表示单个粒子的存在的信号。或者，作为不同的、表示各个单个粒子的存在的信号的逐个检测的其它方式，也可以对在时序光强度数据上出现的光强度值的时间变化的图案计算其在光检测区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况的各情况下产生的概率，辨别该光强度值的时间变化的图案是在光检测区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况的哪一个情况下容易产生的图案，由此进行单个粒子的信号的检测。
[0041]并且，可以根据单个粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度来适当地变更光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的单个粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行光检测区域的位置这样本溶液内的移动，优选的是，可以通过变更显微镜的光学系统的光路或者移动样本溶液的位置来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
[0042]并且，在上述的计算机程序中也同样，可以包括以下步骤:对逐个检测出的单个粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的单个粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的单个粒子的个数来确定样本溶液中的单个粒子的数密度或浓度。此外，在上述的计算机程序的情况下也同样，在粒子的计数中，典型地是，对在任意设定的测量时间中获得的单个粒子的信号的个数进行计数，但是也可以执行测量直到单个粒子的信号数达到任意设定的个数为止，根据测量时间估算单个粒子浓度值。因而，上述的计算机程序也可以包括以下步骤:重复进行光检测区域的位置的移动、来自光检测区域的光的检测以及表示单个粒子的存在的信号的检测直到表示单个粒子的存在的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据表示单个粒子的存在的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的单个粒子的浓度。
[0043]根据上述本发明的装置或计算机程序，实现一边使光检测区域的位置在发光粒子和非发光粒子混合存在的样本溶液内移动一边在背景光的存在下进行光检测并将光强度或光量的增大或下降分别逐次地检测为发光粒子或非发光粒子的信号的新的方法。这样，根据本发明，还提供一种单个粒子检测方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测方法的特征在于，包括以下过程:使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据；以及在按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个单个粒子的存在的信号，其中，检测出的来自光检测区域的光包含实质固定的背景光，单个粒子包含具有比背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，第一单个粒子的上述信号为在第一单个粒子进入到光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的增大，第二单个粒子的上述信号为在第二单个粒子进入到光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的下降。
[0044]在所述结构中也同样，背景光可以是分散在样本溶液内的物质产生的突光、磷光、化学发光、生物发光或散射光、或者是照明光。另外，优选的是，调整背景光强度以及发光粒子和非发光粒子的发光强度，使得在发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系中，从每单位体积的发光粒子(第一单个粒子)释放的发光强度超过从每单位体积的光检测区域内发出的背景光强度，并且在非发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系中，从每单位体积的非发光粒子(第二单个粒子)释放的发光强度低于从每单位体积的光检测区域内发出的背景光强度。特别地，非发光粒子的外径优选为光检测区域的直径的15%以上，更优选为光检测区域的直径的35%以上。
[0045]另外，在上述的方法中也同样，可以根据按时间序列的信号的形状来进行表示各个单个粒子的存在的信号的逐个检测。在实施方式中，典型地是，在逐个检测表示单个粒子的存在的信号的过程中，可以在检测出从背景光的强度起进行计量而具有高于规定的阈值的光强度的信号时，判断为一个发光粒子进入到了光检测区域，在检测出从背景光的强度起进行计量而具有低于规定的阈值的光强度的信号时，判断为一个非发光粒子进入到了光检测区域。具体地说，在逐个检测表示单个粒子的存在的信号的过程中，将时序光强度数据上从背景光的强度起进行计量而具有超过规定阈值的强度的向上凸的吊钟型的脉冲状信号检测为表示发光粒子的存在的信号，将从背景光的强度起进行计量而具有低于规定阈值的强度的向下凸的吊钟型的脉冲状信号检测为表示非发光粒子的存在的信号，此时，可以使时序光强度数据平滑化，将平滑化后的时序光强度数据上的吊钟型的脉冲状信号检测为表示单个粒子的存在的信号。或者，作为表示各个单个粒子的存在的信号的逐个检测的其它方式，也可以对在时序光强度数据上出现的光强度值的时间变化的图案计算其在光检测区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况的各情况下产生的概率，辨别该光强度值的时间变化的图案是在光检测区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况的哪一个情况下容易产生的图案，由此进行单个粒子的信号的检测。
[0046]并且，可以根据单个粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度，优选的是，将光检测区域的位置在样本溶液内的移动速度设定得比作为检测对象的单个粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动，优选的是，可以通过变更显微镜的光学系统的光路或者移动样本溶液的位置来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
[0047]并且，在上述的方法中也可以包含以下过程:对逐个检测出的单个粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的单个粒子的个数进行计数；和/或根据检测出的单个粒子的个数来确定样本溶液中的单个粒子的数密度或浓度。此夕卜，在上述的方法的情况下也同样，在粒子的计数中，典型地是，对在任意设定的测量时间中获得的单个粒子的信号的个数进行计数，但是也可以执行测量直到单个粒子的信号数达到任意设定的个数为止，根据测量时间估算单个粒子浓度值。因而，上述的方法也可以包括以下过程:重复进行光检测区域的位置的移动、来自光检测区域的光的检测以及表示单个粒子的存在的信号的检测直到表示单个粒子的存在的信号的个数达到预先决定的个数为止，根据表示单个粒子的存在的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定样本溶液中的单个粒子的浓度。
[0048]上述本发明的单个粒子检测技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、月旨质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、脂质体、金属胶体、微珠(磁珠、聚苯乙烯珠、胶乳珠等)、消光剂(偶氮苯类(dabcyl、BHQ等))、金属粒子等)在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
[0049]发明的效果
[0050]如果清楚地进行描述，本发明的单个粒子检测技术是依照扫描分子计数法来在溶液中分散有发光粒子和非发光粒子的情况下进行这些单个粒子的检测的技术。应该理解的是，根据本发明的技术，通过一个检测光波长频带下的光测量能够同时检测发光粒子和非发光粒子的存在。因而，在本发明的技术中，通过将发光粒子和非发光粒子调制为不同种类的观测对象粒子，能够通过一次测量来针对两种观测对象粒子进行各个种类的存在检测、粒子的计数、浓度检测等。
[0051]通过本发明的以下优选实施方式的说明可清楚本发明的其它目的和优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0052]图1的(A)是本发明的执行扫描分子计数法的单个粒子检测装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的光检测区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的(D)是移动微板的水平方向位置来移动样本溶液内的光检测区域的位置的机构的示意图。
[0053]图2的(A)、⑶分别是说明本发明的扫描分子计数法中的检测单个粒子的存在的原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。
[0054]图3是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理步骤的一个方式(时序光强度数据的平滑化以及利用吊钟型函数的拟合进行的单个粒子信号的检测)的图。
[0055]图4的(A)、(B)分别是表示在单个粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时以及在通过以比单个粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而粒子横穿光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图4的(C)是说明用于依照图3的处理根据所测量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测单个粒子的存在的处理步骤中的检测信号的信号处理过程的例子的图。
[0056]图5是说明基于时序光强度数据上的光强度变化的产生概率的单个粒子信号的检测原理的图。(A)表示时序光强度数据的示意性的例子。(左)图是存在亮度大的发光粒子的情况。(中)图是存在亮度小的发光粒子的情况。(右)图是不存在发光粒子的情况。(B)是说明在本发明中在时序光强度数据上设定的解析窗的图。
[0057]图6是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的另一方式(基于时序光强度数据上的光强度变化的产生概率检测单个粒子信号)的图。
[0058]图7是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的另一方式(执行单个粒子信号的检测直到计数出规定的粒子数为止的情况)的图。
[0059]图8的(A)示出依照本发明的扫描分子计数法获得的时序光强度数据(光子计数数据)的一部分。图8的(B)示出分别假定(A)的数据中存在非发光粒子的情况和不存在非发光粒子的情况而计算出的产生概率的比值比，图8的(C)示出分别假定(A)的数据中存在发光粒子的情况和不存在发光粒子的情况而计算出的产生概率的比值比。
[0060]图9表示对不含粒子的溶液(0:0)、仅含非发光粒子的溶液(2:0)、仅含发光粒子的溶液(0:2)、包含发光粒子和非发光粒子的溶液(1:1)依照本发明的扫描分子计数法检测出的脉冲数的平均值(直方图表)和标准偏差(误差条)。
[0061]附图标记说明
[0062]1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤(single-mode opticalfiber) ；4:准直透镜；5:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光镜(condenser lens) ；13:针孔；14:屏蔽滤波器；14a:分色镜或偏振分束器；15:多模光纤(mult1-mode optical fiber) ；16:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。

【具体实施方式】
[0063]下面，详细说明本发明的优选实施方式。
_4] 单个粒子检测装置的结构
[0065]实现本发明的单个粒子检测技术的单个粒子检测装置可以是如下的装置:在基本结构中，如图1的(A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器而成。参照该图，单个粒子检测装置I由光学系统2?17以及用于控制光学系统的各部分的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。单个粒子检测装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。
[0066]典型地是，在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了 I μ L?几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在样本容器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域(激励区域)。此外，在样本溶液中典型地是分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子、非发光粒子以及产生背景光的任意的发光物质，在观测对象粒子未进入激励区域时，发光物质被激励而释放出实质固定的光成为背景光，当非发光粒子进入激励区域时，背景光降低，当发光粒子进入激励区域时，发光粒子释放的光加上背景光而光强度增大。
[0067]这样，从激励区域释放出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13，透过屏蔽滤波器14 (在此，只选择特定波长频带的光成分。)，被导入到多模光纤15，到达光检测器16，在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于单个粒子检测的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，在上述结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的(B)示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，来自激励区域以外的光被遮断。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL?1fL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域(典型地是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有效体积是以光强度为Ι/e2的面为边界的大致椭圆球体的体积。)，被称为共焦区组织。
[0068]另外，在本发明中，检测由来自几个分子左右的荧光色素分子的微弱光构成的背景光存在下的、由于单个粒子的存在而引起的光量的增大或下降，因此作为光检测器16，优选使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行的情况下，以在规定时间内按每个规定的单位时间(BIN TIME)逐次测量来到光检测器的光子的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度的数据是按时间序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
[0069]并且，在上述的单个粒子检测装置的光学系统中，设置有用于通过光检测区域扫描样本溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17 (移动光检测区域的绝对位置的方式)。所述反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。或者，作为其它的方式，如图1的(D)所例示的那样，也可以使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置而使光检测区域在样本溶液内的相对位置移动(使样本溶液的绝对位置移动的方式)。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成所期望的光检测区域的位置的移动图案。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以设为在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案。)。另外，可以将使光检测区域的绝对位置移动的方式与使样本溶液的绝对位置移动的方式组合来使样本溶液的位置移动并执行光检测区域的绝对位置的移动。在这种情况下，避免由于光检测区域在短时间内通过同一区域而反复检测同一单个粒子。或者，也可以通过使光检测区域的绝对位置移动的方式，有意地使光检测区域反复通过同一区域，来周期性地多次检测同一单个粒子而实现信号精度的提高。在这种情况下，可以在规定时间内执行光检测区域的绝对位置的移动之后，间歇地移动样本溶液的位置，在样本溶液内的其它场所执行同一单个粒子的反复检测而实现被检测的单个粒子的个数的增大。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动，从而将光检测区域的位置的轨迹在样本溶液内三维地展开。
[0070]在作为观测对象粒子的发光粒子以及生成背景光的发光物质通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。另外，在生成背景光的发光物质不通过激励光而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2?5。在生成背景光的发光物质通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。并且，也可以通过照明光来提供背景光。在这种情况下，从物镜的上方，通过透射照明(可以是库勒照明(Kohler illuminat1n)。)来对样本溶液进行照明。
[0071]并且，在光分析装置I中，如图示那样，可以设置多个激励光源2，可以根据发光粒子或提供背景光的物质的激励波长来适当地选择激励光的波长。另外，也可以构成为具备多个光检测器16，各个光检测器16分别检测来自光检测区域的光中的互不相同的成分。在这种情况下，在通过针孔13后的检测光光路中设置用于以任意方式分割光路的机构。例如，在检测光光路的部位14a处，通过在检测光光路上插入对特定波长频带的光进行反射并使其它的波长频带透过的分色镜14a，能够分别检测波长频带互不相同的光成分。
[0072]计算机18具备CPU以及存储器，通过CPU执行各种运算处理来执行本发明的过程。此外，各过程也可以通过硬件构成。在本实施方式中说明的处理的全部或一部分可以由计算机18使用存储有实现这些处理的程序的计算机能够读取的存储介质来执行。即，计算机18可以通过读出存储在存储介质中的程序执行信息的加工、运算处理来实现本发明的处理过程。在此，计算机能够读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、⑶_R0M、DVD-R0M、半导体存储器等，或者也可以将上述程序通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
[0073]本发明的单个粒子检测技术的原理
[0074]如“
【发明内容】
” 一栏所记载的那样，如果清楚地进行描述，则在本发明的单个粒子检测技术中，在样本溶液中包含有发光粒子和非发光粒子的情况下，在背景光存在下依照扫描分子计数法测量光检测区域的光来获得时序光强度数据，在所述的时序光强度数据上将光强度的有意义的增大检测为发光粒子的信号，将光强度的有意义的下降检测为非发光粒子的信号。根据所述结构，在一个检测光波长频带下的一次光测量中，能够进行作为观测对象粒子的两种互不相同的粒子的检测、对这些粒子的计数、或者与样本溶液中的浓度有关的信息的获取等。下面，说明本发明的扫描分子计数法的原理。
[0075]在“扫描分子计数法”(专利文献9?11)中，基本上是驱动用于移动光检测区域的位置的机构(反射镜偏转器17)来变更光路或者移动注入了样本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置，如图2的(A)示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。此时,特别地，在本发明的情况下，使光检测区域释放背景光(或者，用照明光对光检测区域进行照明)，由此，在光检测区域CV的移动过程中(图中为时间t0?t3)，大致一致地检测到背景光。而且，在光检测区域CV通过存在一个发光粒子的区域时(tl)，除了背景光以外，还从发光粒子释放出光，因此如图2的(B)所描绘的那样在按时间序列的光强度数据上出现吊钟型的脉冲状的有意义的光强度的增大。另外，在光检测区域CV通过存在一个非发光粒子的区域时(t2)，来自光检测区域CV的光量减少，因此如图2的(B)所描绘的那样在按时间序列的光强度数据上出现吊钟型的脉冲状的有意义的光强度的下降。因此，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐一检测在该期间出现的如图2的(B)所例示的那样的脉冲状的信号(有意义的光强度的增大和下降)，由此一边逐个地且分别识别发光粒子和非发光粒子一边进行检测，通过对发光粒子和非发光粒子各自的个数进行计数，能够获取存在于所测量的区域内的发光粒子的个数或者与浓度或数密度有关的信息以及非发光粒子的个数或者与浓度或数密度有关的信息。
[0076]如上所述，为了达成背景光存在下的发光粒子的信号和非发光粒子的信号的检测，需要适当地调整发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系以及非发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系。关于发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系，如果清楚地进行描述，则只要光检测区域中存在发光粒子时、即发光粒子占有光检测区域内的一部分空间时的整个光检测区域内的检测光波长频带下的光强度大于光检测区域中不存在发光粒子时的整个光检测区域内的检测光波长频带下的光强度即可，因此在检测光波长频带，使每单位体积的发光粒子的发光量大于每单位体积的背景光的光量。然而，实际上，背景光强度并不完全固定，因此调整发光粒子的发光强度和/或背景光强度以使每单位体积的发光粒子的发光量充分大于每单位体积的背景光的光量。(具体地说，可以通过实验调整两者的光强度。)
[0077]另一方面，关于非发光粒子的发光强度与背景光强度之间的关系，只要光检测区域中存在非发光粒子时、即非发光粒子占有光检测区域内的一部分空间时的整个光检测区域内的检测光波长频带下的光强度小于光检测区域中不存在非发光粒子时的整个光检测区域内的检测光波长频带下的光强度即可。因而，调整非发光粒子的发光强度和背景光强度使得检测光波长频带下的非发光粒子的每单位体积的发光量小于每单位体积的背景光的光量。(即，应该理解为，非发光粒子只要在检测光波长频带下的发光强度低于背景光的发光强度即可，也可以不是完全不发光的粒子。)
[0078]此外，关于非发光粒子，能够根据非发光粒子的直径与光检测区域的直径之间的关系来估计光强度下降的程度。典型地是，光检测区域内的光强度分布具有在中心具有最大强度Imax并向半径r方向强度降低的吊钟型的轮廓f(r)(参照图5的(C))。因而，使用使f (r)大致为O的光检测区域的半径a，通过下式给出在光检测区域内不存在非发光粒子时从光检测区域内释放出的光的总量α。
[0079]α = 4 π / r2f (r) dr [积分区间为 O ?a]
[0080]另一方面，在半径b的非发光粒子进入光检测区域内并位于光检测区域的中心时，由于提供该区域的背景光的空间(以下称为“发光空间”。)被排除，因此降低与被排除的发光空间相当的光量。与该被排除的发光空间相当的光量、即下降量β通过下式给出。
[0081]β = 4 π / r2f(r) dr [积分区间为 O ?b]
[0082]这样，能够通过β/α估计光强度的下降比例。在此，f(r)为高斯函数，在α =
1、a = I时，成为
[0083]f (r) = 0.684exp (~2r2)。
[0084]典型地是，背景光的变动率为1%左右，当非发光粒子所引起的光强度的下降比例为I %以下时，不能检测信号，因此当通过上述式子进行运算时，非发光粒子半径相对于光检测区域的半径之比b/a应该设为0.15以上。另外，在将非发光粒子所引起的光强度的下降比例设为10%以上的情况下，能够检测的非发光粒子半径相对于光检测区域的半径之比b/a为0.35。此外，在要观测的非发光粒子是消光剂、荧光能量转移的受体的情况下，非发光粒子吸收周围(例如1nm)的光，因此能够检测的非发光粒子半径与上述例示的半径相比能够减小。另外，在非发光粒子发光的情况下，能够检测的非发光粒子半径与上述例示的半径相比能够增大。
[0085]这样，在如上所述的本发明的单个粒子检测技术中，不进行如荧光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理而是逐一检测粒子，因此即使在要观测的粒子的浓度低至通过以往的FCS、FIDA等无法以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或数密度有关的信息。另外，特别地，根据存在有意义的背景光，具有降低杂散光、拉曼散射光的影响这样的优点。并且，重要的是，在本发明的单个粒子检测技术中，在一个检测光波长频带的光强度数据(Ich的光强度数据)上能够识别发光粒子的信号和非发光粒子的信号，因此达成同时检测两种互不相同的粒子且识别出其种类的方式。所述优点在分子的相互作用等的分析中是非常有利的。
[0086]扫描分子计数法的处理操作过稈
[0087]在依照使用了图1的(A)所例示的单个粒子检测装置I的本发明的扫描分子计数法的实施方式中，具体地说，执行以下的处理:(1)包含单个粒子和生成背景光的发光物质的样本溶液的调制，(2)样本溶液的光强度的测量处理，(3)测量出的光强度的分析处理。图3以流程图的形式示出一个实施方式中的处理。
[0088](I)样本溶液的调制
[0089]作为本发明的光分析技术的观测对象物的粒子，如果是溶解的分子等在样本溶液中分散并在溶液中随机运动的粒子，则可以是任意的粒子，例如可以是蛋白质、肽、核酸、月旨质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞、或金属胶体、其它非生物学分子等。关于发光粒子，在观测对象粒子原本不是发光粒子的情况下，使用以任意的方式对作为观测对象物的粒子附加了发光标识(荧光分子、磷光分子、化学、生物发光分子)的粒子。关于非发光粒子，与发光粒子的情况同样地可以是任意的粒子。另外，背景光可以是荧光、自体荧光、散射(拉曼散射(溶剂(水)二硫化碳、异戊二烯、过渡金属络合物)、发光物质所产生的光，或者也可以是均匀光源产生的照明光。在通过发光物质的分散提供背景光的情况下，发光物质可以是任意的发光分子，例如突光分子、磷光分子、化学、生物发光分子，以在光检测区域内始终存在几个分子以上的浓度溶解或分散在样本溶液中。此外，背景光的光量如上述那样被适当调整为在每单位体积中少于作为观测对象的发光粒子的光量且多于作为观测对象的非发光粒子的光量。样本溶液典型地是水溶液，但是不限定于此，可以是有机溶剂及其它任意的液体。
[0090](2)样本溶液的光强度的测量(图3-步骤100)
[0091]本实施方式的利用扫描分子计数法的光分析中的光强度的测量除了在测量过程中驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a来进行光检测区域的位置在样本溶液内的移动(样本溶液内的扫描)以外，可以通过与FCS或FIDA中的光强度的测量过程相同的方式执行。在操作处理中，典型地是，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，在使用者向计算机18输入开始测量的指示时，计算机18依照存储在存储装置(未图示)中的程序(使光检测区域的位置在样本溶液内移动的过程和在光检测区域的位置的移动过程中检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的过程)，开始样本溶液内的光检测区域中的激励光的照射以及光强度的测量。在所述测量中，在依照计算机18的程序的处理动作的控制下，反射镜偏转器17或台位置变更装置17a驱动反射镜7 (检电镜)或显微镜的台上的微板9，来执行皿10内的光检测区域的位置的移动，与此同时地，光检测器16将逐次检测出的光变换为电信号并发送到计算机18，在计算机18中，通过任意的方式，根据所发送的信号生成按时间序列的光强度数据并保存。光检测器16典型地是能够检测有无单光子的到来的超高灵敏度光检测器，因此在光的检测是利用光子计数来进行的情况下，时序光强度数据可以是按时间序列的光子计数数据。
[0092]光强度的测量过程中的光检测区域的位置的移动速度是任意地、例如是通过实验或为了符合分析目的而设定的规定的速度。在根据所检测出的单个粒子的个数获取与其数密度或浓度有关的信息的情况下，需要光检测区域所通过的区域的大小或体积，因此以能够掌握移动距离的方式执行光检测区域的位置的移动。此外，测量过程中的经过时间和光检测区域的位置的移动距离具有比例关系更容易解释测量结果，因此优选移动速度基本上是固定速度，但是不限定于此。
[0093]另外，关于光检测区域的位置的移动速度，为了定量地高精度地执行基于测量出的按时间序列的光强度数据的单个粒子的逐个检测、或者单个粒子的个数的计数，优选将所述移动速度设定为比单个粒子的随机运动、即布朗运动所引起的移动速度快的值。本发明的单个粒子检测技术的观测对象粒子是在溶液中分散或溶解并自由且随机运动的粒子，因此由于布朗运动，位置随着时间而移动。因而，在光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动所引起的移动慢的情况下，如图4的(A)示意性地描绘的那样，粒子在区域内随机地移动，由此光强度随机地变化(如已经提及的那样，光检测区域的激励光强度以区域的中心为顶点向外方降低。)，难以确定与各个单个粒子对应的有意义的光强度的变化。因此，优选的是将光检测区域的位置的移动速度设定得比粒子的因布朗运动引起的平均移动速度(扩散移动速度)快，使得如图4的(B)所描绘的那样粒子大致直线地横穿光检测区域，由此在按时间序列的光强度数据中，如图4的(C)最上部所例示的那样，与各个单个粒子对应的光强度的变化的轮廓大致一致(在单个粒子大致直线地通过光检测区域的情况下，光强度的变化的轮廓与将激励光强度分布反转得到的轮廓大致相同。)，从而能够容易地确定各个粒子与光强度之间的对应。
[0094]具体地说，具有扩散系数D的粒子由于布朗运动而通过半径Wo的光检测区域(共焦区组织)时所需要的时间At根据以下的平均平方位移的关系式，
[0095](2ffo)2 = 6D.At
[0096]成为
[0097]At = (2ffo)2/6D,
[0098]因此，粒子因布朗运动而移动的速度(扩散移动速度)Vdif大致为
[0099]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo。
[0100]因此，光检测区域的位置的移动速度可以参照所述Vdif设定为与其相比充分快的值。例如在预想观测对象粒子的扩散系数是D = 2.0XlO^V/s左右的情况下，在设Wo为0.62 μ m左右时，Vdif为1.0X 10_3m/s，因此，可以将光检测区域的位置的移动速度设定为其10倍以上的15mm/s等。此外，在观测对象粒子的扩散系数未知的情况下，可以设定各种光检测区域的位置的移动速度，反复执行用于找到使光强度的变化的轮廓为预想的轮廓(典型地是与激励光强度分布大致相同)的条件的预备实验，来决定适合的光检测区域的位置的移动速度。
[0101](3)光强度的分析
[0102]当通过上述处理得到时序光强度数据时，在计算机18中，通过依照存储在存储装置中的程序的处理，执行单个粒子的信号的检测、单个粒子的计数、浓度计算等各种分析。
[0103](i)时序光强度数据的平滑化以及利用吊钟型函数拟合的单个粒子信号的逐个检测
[0104]在按时间序列的光强度数据中，在一个粒子通过光检测区域时的轨迹如图4的(B)所示那样是大致直线状的情况下，与该粒子对应的信号中的光强度的变化具有反映(由光学系统决定的)光检测区域内的光强度分布的大致吊钟状的轮廓。参照图4的(C)最上部，特别地，在非发光粒子(α)通过光检测区域的情况下，光强度的变化为向下凸，在发光粒子(β)通过光检测区域的情况下，光强度的变化为向上凸。这样，在单个粒子信号的逐个检测的一个方式中，基本上，在从背景光起进行计量的、低于适当设定的阈值的光强度的下降所持续的时间宽度处于规定的范围时，而且在从背景光起进行计量的，超过适当设定的阈值的光强度的增大所持续的时间宽度处于规定的范围时，判断为各个具有光强度的下降或增大的轮廓的信号对应于一个粒子通过光检测区域，可以进行一个粒子的检测。另外，在能够将光检测区域的光强度分布假定为从背景光Ibg向下凸的或向上凸的高斯分布，即
[0105]I = Ibg-A-.exp(_2t2/a2)...(α )
[0106]I = Ibg+A+.exp(_2t2/a2)…(β)时，
[0107]在使式α或式β拟合有意义的光强度的下降或增大的轮廓(能够明确地判断为不是背景光的波动的轮廓)而计算出的强度A-、A+以及宽度a处于规定的范围内时，判断为该光强度的轮廓对应于一个粒子通过光检测区域，可以进行一个粒子的检测。(强度A-、A+以及宽度a处于规定的范围外的信号被判断为噪声或异物的信号，在其后的分析等中可以忽略。)
[0108]作为从时序光强度数据中一并检测单个粒子的处理方法的一个例子，首先，对时序光强度数据(图4的(C)、最上部“检测结果(未处理)”)进行平滑(平滑化)处理(图3-步骤110、图4的(C)的中上部“平滑”)。作为观测对象粒子的发光粒子及提供背景光的物质等所发出的光是概率性地释放的，并且，其光强度比较微弱，因此在产生细小的增加和减少时，所述光强度的细小的增加和减小(波动)使表示单个粒子的存在的信号的检测精度变差。通过平滑处理能够忽略所述数据上的细小的增加和减小。例如可以通过移动平均法(例如邻近平均法、Savinsky-golay法的算法)、百分比滤波器法、FFT滤波器法进行平滑处理。可以根据获取光强度数据时的光检测区域的位置的移动速度(扫描速度)、BIN--ΜΕ，适当地设定执行平滑处理时的参数、例如在移动平均法中进行一次平均的数据个数、移动平均的次数等。例如，可以通过移动平均法等来进行。
[0109]接着，在平滑处理后的时序光强度数据中，为了检测有意义的脉冲状的信号(以下称为“脉冲信号”)所存在的时间区域(脉冲存在区域)，对平滑处理后的光时序强度数据的时间运算一次微分值(步骤120)。时序光强度数据的时间微分值如图4的(C)的中下部“时间微分”所例示的那样，在信号值的变化时刻值的变化变大，因此通过参照所述时间微分值，能够有利于确定有意义的信号的起点和终点。
[0110]然后，在时序光强度数据上，逐次检测有意义的脉冲信号，判断检测出的信号是否为与单个粒子对应的信号。具体地说，首先在时序光强度数据的按时间序列的时间微分值数据上，参照时间微分值逐次搜索并确定一个脉冲信号的起点和终点，确定脉冲存在区域(步骤130)。当确定了一个脉冲存在区域时，针对该脉冲存在区域中的平滑后的时序光强度数据，在向上凸的光强度变化的区域进行向上凸的吊钟型函数的拟合，在向下凸的光强度变化的区域进行向下凸的吊钟型函数的拟合(图4的(C)的下部的“吊钟型函数拟合”)，计算吊钟型函数的脉冲的峰值的强度(相对于背景光的最大下降量)Ipeak、脉冲宽度(半峰全宽)Wpeak、拟合时的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。此外，拟合的吊钟型函数典型地是高斯函数，但也可以是洛仑兹型函数。另外，在脉冲存在区域中的光强度变化的朝向以基于时间微分值的起点和终点处的增加和减少的顺序进行识别。然后，判断计算出的吊钟型函数的参数是否处于针对一个单个粒子通过光检测区域时检测出的脉冲信号所描绘的吊钟型的轮廓的参数而设想的范围内，即判断脉冲的峰值强度(式α的A-或式β的Α+、背景光的下降量或增大量的最大值)、脉冲宽度、相关系数是否分别处于规定范围内，例如判断是否满足下述的条件等(步骤150)，即
[0111]20 μ s〈脉冲宽度〈400 μ s
[0112]峰值强度>4.0 [pc/10 μ s]…(A)
[0113]相关系数>0.95。
[0114]这样，将被判断为计算出的吊钟型函数的参数处于针对与一个粒子对应的信号设想的范围内的信号判断为是与一个粒子对应的信号。另一方面，计算出的吊钟型函数的参数不在设想的范围内的脉冲信号作为噪声而被忽略。
[0115]可以在时序光强度数据的整个区域中反复执行上述步骤130?150的处理中的脉冲信号的搜索和判断(步骤160)。特别地，在本实施方式中，在进行脉冲信号的搜索和判断时，可以逐次识别信号是向上凸还是向下凸，来分别分开地对脉冲信号的个数进行计数。
[0116](ii)基于时序光强度数据中的光强度变化的产生概率的单个粒子信号的逐个检测
[0117]作为单个粒子信号的逐个检测的其它方式，也可以计算在时序光强度数据上出现的光强度变化(光子数变化)的图案的产生概率，根据所述产生概率检测单个粒子的信号的存在(参照日本特愿2012-32421)。参照图5的(A)，一般地，在时序光强度数据是光子计数数据的情况下，光强度值为每BIN TIME的检测光子数。因而，如图示那样，光强度值在时间轴方向上离散地分布。在这种情况下，亮度大的粒子信号受噪声信号的影响少，具有大致吊钟状的轮廓(左图)，但是亮度小的粒子信号的强度值与噪声信号大致相同，进一步由于噪声信号叠加(中图)而难以抽出大致吊钟状的轮廓，难以与没有粒子的仅存在噪声信号的时间区域(右图)进行区分。然而，在存在亮度小的粒子信号的时间区域和仅存在噪声信号的时间区域中，检测出光子的事件(光子数为I以上的事件)的产生频率和图案存在差异。在非发光粒子的信号与背景光的波动之间也观察到同样的现象。因此，对于时序光强度数据上的每个规定的时间宽度的光强度值的时间变化(光子数列)，计算在假定为在光检测区域内存在粒子的情况下产生上述光强度值的时间变化的概率(产生概率(存在粒子时))以及在假定为在光检测区域内不存在粒子的情况下产生上述光强度值的时间变化的概率(产生概率(不存在粒子时))，将提供高的产生概率的状态估计为是实际的状态。
[0118]更具体地说，首先，参照图5的(B)，在时序光强度数据上设定任意的时间宽度的区间(以下称为解析窗。)。该解析窗具有按每个单位时间(通常可以是BIN TIME。)ti(i=1，2，…以下相同)检测出的光子数Ci。另外，考虑在各单位时间内产生的光子检测事件的数量依照具有该单位时间内的预期值的泊松分布，因此通过下式给出在任意的单位时间ti中成为检测光子数Ci的概率(单位时间产生概率)。
[0119][数I]

Fiu
[0120]Pi = -~cxp(-Ei)…(I)

Ci!
[0121]在此，Ei是单位时间ti内的光子数的预期值。而且，在解析窗中包含n+1个单位时间时，通过下式给出解析窗内产生检测光子数列Ci的概率P (产生概率)。
[0122][数2]
[0123]P = ]~f Pi.■'」1

l-u
[0124]上述的各单位时间ti内的光子检测事件的产生数的预期值Ei根据在光测量中的与解析窗对应的时间区域有无光检测区域内的粒子来确定。这样，在光检测区域内不存在粒子的情况下，光子检测事件总是随机地产生，因此各测量单位时间ti内的预期值Eni可以设定为
[0125]Eni = Bg...(3)
[0126]在此，Bg是背景光的时间平均值。因而，将式(3)的值代入到式(I)，来按时间序列估算各测量单位时间ti内的单位时间产生概率Pni，再通过式(2)计算在假定为在光检测区域内不存在粒子的状态的情况下产生实际的检测光子数列的概率Pn。
[0127]另一方面，在光检测区域内存在粒子的情况下，由于光检测区域CV的位置正在移动，因此粒子如图4的(B)示意性地描绘的那样通过光检测区域CV内。在所述的过程中，从光检测区域中的粒子释放并被检测出的光的强度值或因在光检测区域内存在粒子而减少的背景光的减少量如图5的(C)所示那样，粒子的位置距光检测区域的大致中心越远则越低。因而，在光检测区域内存在粒子时的各单位时间ti内的预期值Epi也表现为以时间为变量的吊钟状的函数。在此，当假设通过高斯函数对该吊钟状的函数进行近似时，通过下式给出预期值Epi。
[0128][数3]
?.? ( (11 — Ic ) _/ Λ \
[0129]Epi = Q.exp--— +Bg…(4)
I 2 W-
[0130]在此，高斯函数被假定为在解析窗内的任意的时间tc (例如解析窗的中心)处具有峰值强度Q。另外，式(4)的高斯函数的半峰全宽等于移动速度为V的光检测区域通过半峰全宽d的时间d/v，该半峰全宽d是如图5的(C)所例示的那样从光检测区域中的粒子释放并检测出的光的强度值或因在光检测区域内存在粒子而减少的背景光的减少量的半径r方向的分布的半峰全宽，根据该条件，通过下式给出W。
[0131][数4]
_2] W = ( °
[0133]此外，图5的(C)的半峰全宽d能够由光学系统决定。
[0134]在观测对象粒子是发光粒子的情况下，当假定为解析窗内的光子数的总计与式
(4)的预期值的总计一致时，通过下式给出式(4)中的峰值强度Q。
[0135][数5]
「 ? t (O-Bg)
[0136]q 1-ο__…C a )
Q- { }
[0137]另外，在观测对象粒子是非发光粒子的情况下，依照式(4)设定光子数的减少量的绝对值的预期值，通过下式给出峰值强度Q。
[0138][数6]

η
T(Bg-Ci)
[0139]q _ ι=υ__...( 7 I

WyflTl
[0140]这样，将式(4)的值代入到式(I)，按时间序列估算各测量单位时间ti内的单位时间产生概率Ppi，再通过式(2)计算假定在光检测区域内存在粒子的状态的情况下产生实际的检测光子数列的概率Pp。而且，在假定存在粒子的状态的情况下的检测光子数列的产生概率Pp超过假定不存在粒子的状态的情况下的检测光子数列的产生概率Pn规定的程度时，判断为在该解析窗中存在粒子的信号。
[0141]此外，在实施方式中，关于在解析窗内是否存在粒子的信号的判断，可以计算产生概率Pp与产生概率Pn的比值比0R，
[0142]OR = Pp (1-Pn) / (1-Pp) Pn...(8)
[0143]在其大小超过规定值时，判断为在解析窗内存在粒子的信号。
[0144]在上述的粒子的信号的检测处理过程中，解析窗优选设定为单个粒子通过光检测区域内所需要的时间以上。如果设为半径r的光检测区域以速度V移动，则将解析窗的时间宽度设定得比
[0145]2r/v...(9)
[0146]长。另外，优选的是，可以在时序光强度数据上针对每个单位时间依次设定解析窗。根据所述设定，能够沿着时序光强度数据计算产生概率Pp、产生概率Pn和/或比值比0R。然而，在这种情况下，运算量变多，因此也可以针对每多个单位时间设定解析窗。并且，也可以在时序光强度数据上以解析窗的时间宽度进行分割来设定解析窗。在这种情况下，解析窗不会被相互重复地设定。
[0147]在针对每个单位时间设定解析窗的情况下，在存在一个粒子信号时，在连续的解析窗中持续作出存在粒子的信号的判断。即，一个粒子的信号对应于持续作出存在粒子的信号的判断的一个区间。因而，通过对持续作出存在粒子的信号的判断的区间数进行计数，能够进行粒子的信号的计数。另外，在上述的粒子的信号的检测处理过程中，BIN --ΜΕ被设定为单个粒子通过光检测区域内所需要的时间(式9)以下。这是为了通过多个BIN TIME捕捉单个粒子通过时的信号而能够检测单个粒子通过期间的光强度值的时间变化的图案。(如果BIN TIME比式9的时间长，则无法捕捉单个粒子通过期间的光强度值的时间变化的图案。)
[0148]图6是以流程图的方式表示利用上述产生检测光子数列的概率Pp、Pn检测单个粒子信号的处理。参照该图，首先，在生成时序光强度数据之后(步骤100)，在时序光强度数据上进行背景光的强度值的计算(步骤310)。背景光的强度值可以是时序光强度数据上不存在粒子的信号的区域的强度值(光子数)的平均值。这样，在背景光的强度值计算的一个方法中，可以采用所获得的时序光强度数据上的光强度值中的、从高值起去除规定比例(例如20% )的数据和从低值起去除规定比例(例如20% )的数据后的总强度值的平均值作为背景光的强度值。这是因为考虑为从光强度值的高值起的规定比例的数据是发光粒子的信号，从光强度值的低值起的规定比例的数据是非发光粒子的信号。此外，也可以采用利用不包含观测对象的粒子的样本溶液获得的时序光强度数据上的光强度值的平均作为背景光的强度值。
[0149]接着，在本实施方式的处理过程中，在时序光强度数据上执行解析窗的设定(步骤320)。如已经提及的那样，一个解析窗的长度可以根据光检测区域的大小和移动速度来决定(参照式(9))。另外，优选的是，可以按时间序列针对每个BIN TIME设定解析窗。然而，为了减少运算量，也可以针对每多个BIN --ΜΕ进行设定，或者也可以以解析窗相互不重叠的方式进行设定。
[0150]这样，当进行了解析窗的设定时，依照上述说明过的原理，分别计算假定为在光检测区域内没有粒子的情况下的解析窗内的光强度值列或光子数列的产生概率Pn(步骤130)、假定为在光检测区域内存在粒子的情况下的解析窗内的光强度值列或光子数列的产生概率Pp (步骤140)。关于该点，特别地，在本发明中，在一个时序光强度数据上可能存在发光粒子的信号和非发光粒子的信号。因而，关于假定为在光检测区域内存在粒子的情况下的产生概率Pp，分别计算假定为在光检测区域内存在发光粒子的情况下的产生概率Pp+以及假定为在检测区域内存在非发光粒子的情况下的产生概率Pp_(Pp+是使用式(6)计算出的概率，Pp-是使用式(7)计算出的概率。)然后，将计算出的产生概率Pp+、Pp-、Pn相互比较，判断在解析窗内是否存在发光粒子或非发光粒子(步骤150)。在所述判断中，计算产生概率Pp+或Pp-与产生概率Pn的比值比(参照式(8))，在发光粒子的比值比为规定值以上时，可以判断为存在发光粒子，在非发光粒子的比值比为规定值以上时，可以判断为存在非发光粒子。此为，在假定为在光检测区域内存在粒子的情况下的产生概率Pp+、Pp-的计算中，可以假定为强度值的预期值在解析窗的中心存在强度的峰值。实际上，粒子的信号的峰值几乎不存在于解析窗的中心，实际的粒子的信号的峰值的位置距解析窗的中心越远，产生概率Pp+、Pp-的值越低，但是相比于不存在实际的粒子的信号时的产生概率Pn的值而言是高的值。
[0151]上述步骤130?150的处理中的解析窗内的产生概率Pp、Pn的计算以及粒子信号的检测可以在光强度数据上设定的所有解析窗中执行(步骤160)。
[0152](iii)粒子浓度的确定
[0153]并且，也可以对检测出的单个粒子的信号的个数进行计数来确定粒子的个数(粒子的计数)。另外，如果通过任意的方法能够确定光检测区域所通过的区域的总体积，则能够根据其体积值和粒子的个数确定样本溶液中的粒子的数密度或浓度(步骤170)。
[0154]光检测区域所通过的区域的总体积可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是也可以通过实验，例如根据针对粒子浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量条件相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、粒子的检测以及计数所检测出的粒子的个数和对照溶液的粒子的浓度来确定。具体地说，例如当针对粒子浓度C的对照溶液，将对照溶液的单个粒子的检测数设为N时，光检测区域所通过的区域的总体积Vt通过下式给出。
[0155]Vt = N/C...(10)
[0156]另外，例如可以准备单个粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过的区域的总体积vt。而且，当给出Vt时，单个粒子的计数结果为η的样本溶液的粒子浓度C通过下式给出。
[0157]c = n/Vt...(11)
[0158]此外，可以不依据上述的方法而通过任意的方法、例如通过利用FCS、FIDA等给出光检测区域的体积、光检测区域所通过的区域的总体积。另外，在本实施方式的装置中，可以针对所设想的光检测区域的移动图案，将针对各种标准的粒子的浓度C与粒子的个数N之间的关系(式(10))的信息预先存储到计算机18的存储装置中，在装置的使用者实施单个粒子检测时能够适当地利用所存储的关系的信息。
[0159]这样，在通过光检测区域在样本溶液中进行扫描来逐个检测粒子的反转型扫描分子计数法中，通过上述的处理过程，能够进行样本溶液中的粒子的计数、浓度的确定等。特别地，在本发明的情况下，分别进行发光粒子和非发光粒子的计数，确定各自的粒子浓度，由此能够确定每个种类的粒子的浓度。
[0160](4)检测固定信号数的单个粒子检测处理
[0161]在上述的单个粒子检测处理中，在某设定的时间内执行光测量之后，在所获得的光强度数据上检测单个粒子的信号。在这种情况下，在样本溶液中的粒子浓度未知时，在某固定的测量时间内进行光强度的测量的情况下，如果粒子的浓度低，则测量时间被设定得足够长。另一方面，在样本溶液中的粒子的浓度高的情况下，超过以可允许的或要满足的精度确定浓度等特性所需要的时间地持续进行光强度的测量。另外，在样本溶液中的粒子浓度低于实验者所设想的浓度而所设定的测量时间不足的情况下，导致结果的误差变大。因此，作为单个粒子检测处理的另一方式，可以重复进行一边移动光检测区域一边进行的光强度的测量和单个粒子的信号的检测直到信号的个数达到预先决定的个数为止，测量信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，根据所述单个粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间来确定粒子浓度。根据所述结构，在样本溶液中的粒子浓度高的情况下，光强度的测量所需要的时间缩短，在样本溶液中的粒子浓度低的情况下，能够持续进行光强度的测量直到获得达成结果(即，粒子浓度)所要求的精度为止。而且，通过将单个粒子的信号的个数要达到的预先决定的个数设定为达成结果所要求的精度的粒子数，将达成结果所要求的精度的粒子数反映到单个粒子的信号的个数达到预先决定的个数所需要的时间，因此可以期待基于该时间确定的粒子的浓度值具有可允许的或要满足的精度。此外，在所述结构中也同样，在本发明的情况下，针对多个检测波长中的每个检测波长执行从光测量至粒子浓度的估算的处理。
[0162]⑴基本原理
[0163]粒子的浓度值与信号数达到预先决定的个数所需要的时间被赋予如下的关系。即，在某粒子浓度C的样本溶液中，在时间τ内使光检测区域以扫描速度U移动的情况下，当将光检测区域的截面积设为S时，检测的粒子信号的个数X为
[0164]X = CSutNa...(12)。
[0165]在此，Na是阿伏伽德罗数。因而，当设信号数达到预先决定的个数XE需要时间T时，粒子浓度C作为时间T的函数而通过下式给出。
[0166]C = XE/ (STuNa)...(13)
[0167]此外，每单位时间的粒子的检测速度V根据信号数达到预先决定的个数XE所需要的时间T和粒子检测数XE，通过下式给出，
[0168]V = ΧΕ/Τ …(14)
[0169]因此，粒子浓度C表示为
[0170]C = V/ (SuNa)...(15)。
[0171]在该式(15)中，粒子浓度C与检测速度V成线性比例，容易获知粒子浓度C与检测速度V的对应关系，因此在实际的实验中，也可以使用检测速度V来确定粒子浓度C。
[0172](?)处理操作过程
[0173]例如可以通过图7的流程图所示的处理过程来执行检测固定信号数的单个粒子检测处理。在该图的例子中，如果清楚地进行描述，则光检测区域的位置的移动、来自光检测区域的光的检测、单个粒子的信号的检测以及所检测出的粒子信号的计数的一系列处理按解析时间间隔t (规定的时间间隔)反复执行直到所检测出的粒子数X达到结束粒子数XE(单个粒子数要达到的预先决定的个数)为止。此外，应该理解为通过计算机18的处理动作实现下面记述的一系列的处理和结构。
[0174](a)初始设定
[0175]参照图7，在操作处理中，具体地说，首先，在向微板9的皿10注入样本溶液并载置在显微镜的台上后，当使用者向计算机18输入开始光强度的测量和粒子的检测、计数的处理的指示时，作为初始设定，计算机18进行结束粒子数XE的设定(步骤10)和解析时间间隔t的设定(步骤20)。可以由使用者任意地设定结束粒子数XE和解析时间间隔t。能够参考使用粒子浓度已知的溶液通过预备实验得到的结果来适当决定结束粒子数XE以能够达成粒子浓度的结果值所要求的精度。作为解析时间间隔t，可以考虑装置I的处理速度等适当地设定与从处理开始后起至粒子数(X)达到结束粒子数(XE)为止的时间相比充分短的任意的时间间隔。另外，结束粒子数XE和解析时间间隔t也可以分别为参考使用粒子浓度已知的溶液通过预备实验得到的结果而预先决定的值，将其存储在装置I中，自动地或者通过使用者的选择来使用所述存储值。
[0176](b)粒子数的检测
[0177]当如上述那样设定结束粒子数XE和解析时间间隔t时，如下述那样按解析时间间隔t，反复执行在整个解析时间间隔t内利用扫描分子计数法进行的光强度的测量处理及基于所测量出的光强度数据的粒子信号的检测和粒子数X的检测(步骤30)以及对在步骤30中检测出的粒子数X进行累加来估算粒子的总数X(tn)的处理(步骤40)，直到粒子的总数X(tn)达到结束粒子数XE为止(步骤50)。此外，可以在反复执行步骤30?50的处理之前存储一系列处理的开始时间Ts (步骤25)。
[0178]步骤30中的光检测、粒子数检测的处理可以与图3或图6所示的处理相同。如果清楚地进行描述，则一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动(样本溶液内的扫描)，一边在整个解析时间间隔t内进行光强度的测量，然后，计算机18通过依照存储在存储装置中的程序的处理，来执行所获得的解析时间间隔t的时序光强度数据中的表示单个粒子的存在的信号的检测以及检测数的计数。
[0179]这样，当对整个解析时间间隔t内的时序光强度数据的粒子数X进行了检测时，通过下式计算单个粒子的检测总数X (tn)(图7-步骤40)。
[0180]X(tn) = X (V1) +X...(16)
[0181]此外，X(V1)为直到前一次的解析时间间隔t为止检测出的粒子的检测总数，其初始值为O。而且，按解析时间间隔t反复进行步骤30?40直到单个粒子的检测总数X (tn)达到结束粒子数XE为止、SP
[0182]X(tn)彡 XE...(17)
[0183]成立为止(步骤50)。而且，当在反复进行步骤30?50的期间式(17)成立时，结束样本溶液的光强度的测量和粒子的检测、计数的处理。当步骤30?50的反复处理结束时，可以存储结束时间TE (步骤60)。
[0184](c)粒子数和测量结束时间的显示
[0185]另外，在按解析时间间隔t反复执行步骤30?50的期间(式(17)成立之前)，可以在计算机18的监视器上等显示器上显示粒子的检测总数X(tn)和/或测量结束时间TE或者测量剩余时间Tr。根据所述结构，使用者通过查看这些显示能够预测正在执行的测量何时结束，在这一点上是有利的。
[0186]在执行如上所述的显示的情况下，在图7的步骤50的判断中式(17)没有成立的情况下，执行图中虚线所示的各处理。具体地说，首先，在显示器上显示在步骤40中估算出的最新的粒子的检测总数X(tn)(步骤52)。此外，在已经反复执行了步骤30?50的情况下，更新到目前为止的粒子的检测总数X(tn)的值。接着，为了计算测量结束时间TE或测量剩余时间Tr而计算步骤30?50的处理开始后的粒子的检测速度V(步骤54)。当前的粒子的检测速度V可以通过下式给出。
[0187]V = X(tn)/ (Tp-Ts)...(18)
[0188]在此，Tp是当前的时刻。这样，使用粒子的检测速度V，通过下式来估计测量剩余时间Tr (直到步骤30?50的处理结束为止的时间)，
[0189]Tr= (XE-X (tn)) /v...(19)
[0190]另外，通过下式估计测量结束时间TE (步骤30?50的处理结束的时间)(步骤56)。
[0191]TE = Tp+Tr...(20)
[0192]然后，将所估计出的测量结束时间TE或测量剩余时间Tr显示在显示器上(步骤58)。此外，在已经反复执行了步骤30?50的情况下，更新已经显示的值。另外，在X(tn)=0时，式(18)或(19)运算不出，可以显示为Tr和TE不明。
[0193]如已经记述的那样，按解析时间间隔t反复进行上述图7的步骤30?50的处理。关于该点，可以从测量开始至结束为止在图3或图6的步骤100以外的信号处理步骤的执行过程中也连续地执行步骤100的光强度的测量。即，当在光检测、粒子数检测的处理中一个循环的整个解析时间间隔t内的光强度的测量完成时，直接连续地执行下一个循环的整个解析时间间隔t内的光强度的测量，同时在计算机18中基于在已完成的循环的整个解析时间间隔t内获取到的光强度数据检测粒子的信号、执行计数处理。由此，实时地进行粒子的检测、计数。
[0194](d)浓度计算等分析
[0195]这样，当粒子数达到结束粒子数时，可以使用粒子数达到结束粒子数为止的时间T( = TE-Ts)或者根据所检测出的粒子的信号而获得的其它信息，来执行浓度计算等分析(步骤70)。如已经记述的那样，利用式(12)，根据达到结束粒子数为止的时间T和结束粒子数XE来计算粒子的检测速度V，根据粒子的检测速度V，利用式(13)的关系来确定粒子浓度。
[0196]此外，式(12)?(15)中的光检测区域的通过区域的截面积S可以根据激励光或检测光的波长、透镜的数值孔径、光学系统的调整状态在理论上进行估算，但是也可以根据通过实验、例如针对粒子浓度已知的溶液(对照溶液)以与要检查的样本溶液的测量条件相同的条件进行上述所说明的光强度的测量、粒子的检测、计数而检测出的粒子的个数和对照溶液的单个粒子的浓度来决定。具体地说，例如当针对粒子浓度C的对照溶液，将以移动速度UO在某个时间τ O中执行的光强度的测量中的粒子的检测数设为N时，光检测区域的通过区域的截面积S通过下式给出。
[0197]S = N/ (C.Na.U0.το)...(21)
[0198]另外，可以准备粒子的浓度不同的多个溶液作为对照溶液，针对多个溶液分别执行测量，采用计算出的S的平均值作为光检测区域的截面积S。
[0199]为了验证上述所说明的本发明的有效性而进行了如下的实验。此外，下面的实施例例示本发明的有效性，应该理解不是限定本发明的范围。
[0200]实施例1
[0201]验证了在通过本发明的扫描分子计数法的光测量获得的时序光强度数据中能够识别并检测表示发光粒子的存在的信号以及表示非发光粒子的存在的信号。
[0202]作为样本溶液，调制出使2fM的非荧光微珠(CP-40-10:spherotec(D:4000nm))作为非发光粒子分散在包含3.25nM的荧光色素ATT0488的20%聚乙二醇溶液中得到的溶液、使2fM的荧光微珠(FP-4052-2:spherotec(D:4000nm))作为发光粒子分散在上述聚乙二醇溶液中得到的溶液以及使IfM的非荧光微珠和IfM的荧光微珠分散在上述聚乙二醇溶液中得到的溶液。在光的测量中，作为光分析装置，利用具备共焦荧光显微镜的光学系统和光子计数系统的单分子荧光测量装置MF20 (奥林巴斯株式会社)，依照在上述的“(2)样本溶液的光强度的测量”中所说明的方式，针对上述各个样本溶液获取了时序光强度数据(光子计数数据)。此时，激励光使用50 μ W的488nm的激光，利用带通光学滤波器535BP测量510nm-560nm的波长频带的光，生成了时序光子计数数据。此外，共焦区组织的直径设定为大约4μπι。样本溶液中的光检测区域的位置的移动速度设为9000rpm(67.5mm/秒)JfBINTIME设为50 μ s，关于各溶液各进行了三次100秒的测量。
[0203]以与图6关联说明的基于光强度变化的产生概率的单个粒子信号的逐个检测的方式进行了单个粒子信号的检测。图8的(A)是获得的时序光强度数据的一部分，图8的(B)是假定为存在非发光粒子的情况下的产生概率的比值比，图8的(C)表示假定为存在发光粒子的情况下的比值比。如从图中理解的那样，在(A)中，观察到认为是非发光粒子(α)通过的光强度的下降以及认为是发光粒子(β)通过的光强度的增加，与这些对应地，各自的比值比增大。当观察时序光强度数据整体时，观察到具有背景光的-87%?-2%的峰值强度的非发光粒子的信号和具有背景光的8%?720%的峰值强度的发光粒子的信号。
[0204]图9示出对于不含粒子的溶液(0:0)、仅含非发光粒子的溶液(2:0)、仅含发光粒子的溶液(0:2)、包含发光粒子和非发光粒子的溶液(1:1)通过上述的处理检测出的发光粒子的信号数(凸)和非发光粒子的信号数(凹)各自的平均值(直方图)和标准偏差(误差条)。如从图中理解的那样，分别检测出与样本溶液中包含的粒子的比对应的个数的发光粒子的信号和非发光粒子的信号。该情形表示，根据本发明的光分析技术、即在发光粒子和非发光粒子包含在同一样本溶液中的情况下在适当的背景光存在下执行扫描分子计数法，能够分别识别并检测出样本溶液中的发光粒子和非发光粒子。另外，示出了还能够估计各粒子的含有量。
[0205]这样，如从上述实施例的结果理解的那样，根据依照本发明的教导的扫描分子计数法，能够按粒子的种类进行分散于样本溶液中的发光粒子和非发光粒子的检测以及与其浓度有关的信息的获取。特别地，本发明逐个检测单个粒子的信号，因此即使样本溶液中的粒子浓度低于FCS等光分析技术所要求的浓度区域，也能够检测粒子，所述特征在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下是有利的。
【权利要求】
1.一种单个粒子检测装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测装置的特征在于，包括: 光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个上述单个粒子的存在的信号， 其中，由上述光检测部检测出的来自上述光检测区域的光包含实质固定的背景光，上述单个粒子包含具有比上述背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比上述背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，上述第一单个粒子的上述信号为在上述第一单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、由上述光检测部检测出的光强度的增大，上述第二单个粒子的上述信号为在上述第二单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、由上述光检测部检测出的光强度的下降。
2.根据权利要求1所述的单个粒子检测装置，其特征在于， 上述信号处理部对逐个检测出的表示上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的存在的信号的个数分别进行计数，来对在上述光检测区域的位置移动的过程中检测出的上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的个数进行计数。
3.根据权利要求1或2所述的单个粒子检测装置，其特征在于， 从每单位体积的上述第一单个粒子释放的发光强度超过从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度，从每单位体积的上述第二单个粒子释放的发光强度低于从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度。
4.根据权利要求1?3中的任一项所述的单个粒子检测装置，其特征在于， 上述背景光是由在上述样本溶液内分散的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光，或是照明光。
5.一种单个粒子检测方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测方法的特征在于，包括以下过程: 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据；以及 在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个上述单个粒子的存在的信号， 其中，检测出的来自上述光检测区域的上述光包含实质固定的背景光，上述单个粒子包含具有比上述背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比上述背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，上述第一单个粒子的上述信号为在上述第一单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的增大，上述第二单个粒子的上述信号为在上述第二单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的下降。
6.根据权利要求5所述的单个粒子检测方法，其特征在于， 还包括以下过程:对逐个检测出的表示上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的存在的信号的个数分别进行计数，来对在上述光检测区域的位置移动的过程中检测出的上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的个数进行计数。
7.根据权利要求5或6所述的单个粒子检测方法，其特征在于， 从每单位体积的上述第一单个粒子释放的发光强度超过从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度，从每单位体积的上述第二单个粒子释放的发光强度低于从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度。
8.根据权利要求5?7中的任一项所述的单个粒子检测方法，其特征在于， 上述背景光是由在上述样本溶液内分散的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光，或是照明光。
9.一种单个粒子检测用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该单个粒子检测用计算机程序使计算机执行以下步骤: 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边检测来自上述光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据；以及 在上述按时间序列的光强度数据中逐个检测表示各个上述单个粒子的存在的信号； 其中，检测出的来自上述光检测区域的上述光包含实质固定的背景光，上述单个粒子包含具有比上述背景光的发光强度高的发光强度的第一单个粒子和具有比上述背景光的发光强度低的发光强度的第二单个粒子，上述第一单个粒子的上述信号为在上述第一单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的增大，上述第二单个粒子的上述信号为在上述第二单个粒子进入到上述光检测区域内时产生的、被检测出的光强度的下降。
10.根据权利要求9所述的单个粒子检测用计算机程序，其特征在于， 还包含以下步骤:对逐个检测出的表示上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的存在的信号的个数分别进行计数，来对在上述光检测区域的位置移动的过程中检测出的上述第一单个粒子和上述第二单个粒子的个数进行计数。
11.根据权利要求10所述的单个粒子检测用计算机程序，其特征在于， 从每单位体积的上述第一单个粒子释放的发光强度超过从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度，从每单位体积的上述第二单个粒子释放的发光强度低于从上述每单位体积的上述光检测区域内发出的背景光强度。
12.根据权利要求9?11中的任一项所述的单个粒子检测用计算机程序，其特征在于， 上述背景光是由在上述样本溶液内分散的物质产生的荧光、磷光、化学发光、生物发光或散射光，或是照明光。
【文档编号】G01N21/64GK104246479SQ201380020726
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年3月11日 优先权日:2012年4月18日
【发明者】叶梨拓哉 申请人:奥林巴斯株式会社