采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法
【专利摘要】一种采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，其特征在于：选用人支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞作为评价体系，将细胞接种于培养皿中，加入卷烟烟气总粒相物样品进行暴露，暴露过的细胞经培养和甲醇溶液固定，采用DAPI溶液染色并在荧光显微镜下拍照计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的细胞数量，与对照样品相比，通过分析微核增加的数量，进而判断烟气遗传毒性的大小。本发明采用烟气作用于人体的靶器官来源细胞进行卷烟烟气遗传毒性评价，针对性更强；实验过程中无需加入代谢活化体系（大鼠肝S9混合液），荧光染色直接在细胞培养皿中进行无需转移至载玻片，具有操作简便，灵敏度高，结果可靠等特点。
【专利说明】采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及烟草及卷烟烟气安全性评价【技术领域】，具体是一种采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，是通过测定卷烟烟气总粒相物引起的细胞微核率来进行的，用于评价卷烟烟气的遗传毒性。
【背景技术】
[0003]卷烟烟气中有69种化合物已经确定为致癌物，另外还有一部分物质是肿瘤促进因子或辅助致癌物，因此有关卷烟烟气的毒理学评估成为吸烟与健康领域的热点问题之一。有关遗传毒性的体外毒理学测试常用来评价烟气气溶胶的致突变潜力。微核试验是化学物质或混合物的遗传毒性测试中常用的一种评价方法，卷烟烟气和烟气冷凝物均可以导致细胞微核的出现。比如，将BALB/C-3T3细胞或V79细胞暴露于主流烟气和烟气冷凝物中均可发现微核率的明显增加[参考文献1:Gu Z ff, Whong W Z, Wallace W E, et al.1nduction of micronuclei in BALB/c_3T3 cells by selected chemicals and complexmixtures [J].Mutation Research, 1992, 279:217-222.参考文献2:Channarayappa, NathJ, Ong T.Clastogenic and aneuploidogeniceffects of cigarette smoke condensate,Mitomycin C and vincristine sulfate [J].Mutagenesis, 1992, 7 (6):457-260.参考文献
3:Veltel D, Hoheneder A.Characterzation of cigarettesmoke-1nduced micronucleiin vitro [J], Exp.Toxic Pathol, 1996，48:548-550.]。国际上，C0RESTA 体外毒理学特别工作组也推荐选用微核试验方法来评价卷烟烟气的遗传毒性。基于此，国内的烟草科技人员通常采用中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)作为体外微核试验的暴露体系来评价卷烟烟气总粒相物的遗传毒性，并且在实验中分别设计了添加代谢活化体系和不添加代谢活化体系的处理过程(YQ 4烟草及烟草制品烟气安全性生物学评价第3部分:体外微核试验)。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对目前一些采用哺乳动物细胞来测试卷烟烟气总粒相物遗传毒性的方法不够简便等特点，按照遗传毒理学检测应着重来源于人体组织细胞的原则，而专门开发的一种采用人支气管上皮细胞系(BEAS-2B细胞)来进行卷烟烟气遗传毒性测试的方法，本方法省略了添加代谢活化体系的处理过程，可以较好的反映卷烟烟气的体外遗传毒性，操作简单，灵敏度高，针对性强，结果可靠。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，包括以下步骤:先在培养好的BEAS-2B细胞中加入卷烟烟气总粒相物(TPM)的提取物样品进行暴露，暴露过的细胞经培养和冷甲醇固定，然后用DAPI溶液荧光染色，选择分布均匀、染色较好的区域，在荧光显微镜下拍照计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的细胞数量，与不加卷烟烟气总粒相物暴露的对照样品比较，判断卷烟烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟烟气的遗传毒性的大小；具体步骤如下:
a.细胞培养及接种:将BEAS-2B细胞接种于细胞培养液中并置于CO2培养箱孵育，当细胞生长达到70%-80%汇合时采用0.05%胰酶溶液消化细胞并制备细胞悬浮液，将制备好的细胞悬浮液计数后接种至直径35mm培养皿中，使每皿的细胞数量为1.5 X 105_2.0 X IO5个，添加培养液至总体积为2mL，于CO2培养箱中继续培养24h ；
b.卷烟烟气总粒相物暴露:按照国标的方法通过吸烟机抽吸卷烟，并制备TPM的二甲基亚砜(DMSO)提取物样品，去除培养皿中的培养液，设四类实验组:细胞对照组、溶剂对照组、阳性对照组和TPM组，各组内每个检测剂量均设3个平行皿；TPM组根据细胞半数致死剂量IC5tl，取1/2 IC5Q、l/4 IC5Q、1/8I C5tl和1/16 IC50 4个剂量，分别加入不同剂量的TPM样品，并用DMSO补齐各TPM浓度组使得组内培养皿中DMSO的浓度一致；细胞对照组只加细胞培养液；溶剂对照组加入DMS0，加入的DMSO量与TPM组1/2 IC50剂量的体积数一致；阳性对照组加2 μ L环磷酰胺溶液；各组加入受试物后，同时每皿内加入12 μ L细胞松弛素B溶液，最后用细胞培养液将每皿内溶液体积补足至2 mL，继续在CO2培养箱中培养24 h ；
c.微核测试:移除培养皿内的溶液，用PBS溶液漂洗2遍，弃掉洗液后，用约2mL甲醇溶液固定10 min，倒置晾干，向培养皿中加入I μ g/mL的DAPI 1.5 mL避光染色10 min,用蒸馏水冲洗3次，黑暗处自然晾干或风干；在荧光显微镜下紫外激发进行观察，选择分布均匀，染色良好的区域，进行拍照及图像计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的数量；选择观察的双核细胞核质应相互分开，微核不与主核重叠，易于分辨；
d.数据处理和分析:将TPM组与溶剂对照组相比，统计分析微核率是否有剂量反应关系并有统计学差异，评价卷烟烟气的遗传毒性。
[0006]在本发明中，测试细胞培养液为LHC-8培养基。
[0007]所用的DMSO为细胞培养级。
[0008]细胞松弛素B溶液采用DMSO配制成I mg/mL并在_20°C条件保存。6 μ g/mL的细胞松弛素B溶液是由细胞松弛素B和细胞培养液按比例混合配制而成
环磷酰胺溶液采用PBS配制成0.2 mg/mL,过滤除菌后在_20°C条件保存。
[0009]DAPI染色液的配制方法为:用蒸馏水配制成I mg/mL的储存液，_20°C避光保存，使用时用蒸馏水稀释至I μ g/mL的工作液。
[0010]本发明依据的测试原理在于:先在培养好的细胞中直接加入TPM的提取物样品进行暴露，暴露过的细胞经培养和冷甲醇固定，然后用DAPI溶液荧光染色，再在荧光显微镜下计数细胞中含微核的细胞数量，与不加卷烟烟气总粒相物暴露的对照样品比较，判断卷烟烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟烟气的遗传毒性的大小。
[0011]本发明采用BEAS-2B细胞作为暴露体系，实验过程中无需添加S9代谢活化体系，采用DAPI荧光染色测试时可直接在细胞培养皿中进行，无需转移细胞至载玻片，比较客观地反映了卷烟烟气的毒性作用，且能定量评价卷烟烟气的遗传毒性，与现有技术相比具有操作简单，灵敏度高，结果可靠的特点，开创了一种新的用于卷烟烟气遗传毒性测定的方法。
【专利附图】
【附图说明】[0012]图1为实施例1卷烟烟气引起BEAS-2B细胞的微核增加率的柱状图。
[0013]图2为实施例2卷烟烟气引起BEAS-2B细胞的微核增加率的柱状图。
[0014]图3为实施例3卷烟烟气引起BEAS-2B细胞的微核增加率的柱状图。
[0015]
【具体实施方式】
[0016]本发明结合以下实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
[0017]实施例1
对国产某参比卷烟进行评价。将参比卷烟在恒温恒湿箱中平衡48小时，选取重量和吸阻一致的卷烟。按国标方法，分别在吸烟机上抽吸20支卷烟，剑桥滤片按10 mg/mL TPM加入DMSO浸泡，超声波提取20 min，最后用滤纸过滤，分装到冻存管中，保存于-70°C超低温冰箱中备用。
[0018]将测试细胞接种于细胞培养液中，在CO2细胞培养箱中37°C下培养，当细胞繁殖到一定浓度时计数，并将细胞转移至35 mm培养皿中，浓度为1.0 X IO5细胞/皿，添加培养液至总体积2 mL，于CO2细胞培养箱中37°C下培养24 h ;根据细胞毒性试验中计算出的半数致死剂量IC5tl为32 μ g/mL,设置TPM组4个检测剂量分别为2.0 μ g/mL、4.0 μ g/mL、8.0μ g/mL和16.0 μ g/mL;去除培养皿中的培养液，细胞对照组每皿加入2 mL细胞培养液，溶剂对照组每皿加入3.2 μ L DMSO,阳性对照组每皿加入2 μ L浓度为0.2 mg/mL的环磷酰胺溶液，16.0 μ g/mL TPM组每皿加入3.2 μ L TPM, 8.0 μ g/mL TPM组每皿加入1.6 μ LTPM 和 1.6 μ L DMSO, 4.0 μ g/mL TPM 组每皿加入 0.8 μ L TPM 和 2.4 μ L DMSO, 2.0 μ g/mL TPM组每皿加入0.4 μ L TPM和2.8 μ L DMSO,各组加入受试物后，均用细胞培养液将培养皿内溶液体积补足至2 mL，同时每皿内加入12 μ L细胞松弛素B溶液使得细胞松弛素B的终浓度为6 μ g/mL,继续在CO2培养箱中培养。
[0019]暴露过的细胞培养24 h后，吸出培养液并分别用PBS溶液漂洗2遍，然后再用90%甲醇溶液固定经过暴露的细胞培养皿10 min,自然晾干或风干。向风干的培养皿中加入100mg/mL的DAPI溶液浸泡3 min，而后用蒸馏水冲洗培养皿30 S，黑暗处自然晾干或风干，先在10倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在荧光显微镜下计数，每个样品计数1000个细胞中含微核的细胞数量。结果见图1。从图1中可以看出随着烟气暴露浓度的增大，卷烟烟气引起细胞微核率也随之增大，呈明显的剂量-响应关系。
[0020]实施例2
本实施例基本同于实施例1，仅是卷烟样品为含某种添加剂的参比卷烟。结果见图2。
[0021]实施例3
本实施例基本同于实施例1，仅是卷烟样品为国产某品牌卷烟。结果见图3。
【权利要求】
1.一种采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，其特征在于:该测定方法包括以下步骤:先在培养好的BEAS-2B细胞中加入卷烟烟气总粒相物(TPM)的提取物样品进行暴露，暴露过的细胞经培养和冷甲醇固定，然后用DAPI溶液荧光染色，选择分布均匀、染色较好的区域，在荧光显微镜下拍照计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的细胞数量，与不加卷烟烟气总粒相物暴露的对照样品比较，判断卷烟烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟烟气的遗传毒性的大小。
2.根据权利要求1所述的采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，其特征在于:该检测方法的具体步骤如下: a.细胞培养及接种:将BEAS-2B细胞接种于细胞培养液中并置于CO2培养箱孵育，当细胞生长达到70%-80%汇合时采用0.05%胰酶溶液消化细胞并制备细胞悬浮液，将制备好的细胞悬浮液计数后接种至直径35 mm培养皿中，使每皿的细胞数量为1.5 X 105_2.0 X IO5个，添加培养液至总体积为2 mL,于CO2培养箱中继续培养24 h ； b.卷烟烟气总粒相物暴露:按照国标的方法通过吸烟机抽吸卷烟，并制备TPM的二甲基亚砜(DMSO)提取物样品，去除培养皿中的培养液，设四类实验组:细胞对照组、溶剂对照组、阳性对照组和TPM组，各组内每个检测剂量均设3个平行皿；TPM组根据细胞半数致死剂量IC5tl，取1/2 IC5Q、l/4 IC5Q、1/8I C5tl和1/16 IC50 4个剂量，分别加入不同剂量的TPM样品，并用DMSO补齐各TPM浓度组使得组内培养皿中DMSO的浓度一致；细胞对照组只加细胞培养液；溶剂对照组加入DMS0，加入的DMSO量与TPM组1/2 IC50剂量的体积数一致；阳性对照组加2 μ L环磷酰胺溶液；各组加入受试物后，同时每皿内加入12 μ L细胞松弛素B溶液，最后用细胞培养液将每皿内溶液体积补足至2 mL，继续在CO2培养箱中培养24 h ； c.微核测试:移除培养皿内的溶液，用PBS溶液漂洗2遍，弃掉洗液后，用约2mL甲醇溶液固定10 min，倒置晾干，向培养皿中加入I μ g/mL的DAPI 1.5 mL避光染色10 min,用蒸馏水冲洗3次，黑暗处自然晾干或风干；在荧光显微镜下紫外激发进行观察，选择分布均匀，染色良好的区域，进行拍照及图像计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的数量；选择观察的双核细胞核质应相互分开，微核不与主核重叠，易于分辨； d.数据处理和分析:将TPM组与溶剂对照组相比，统计分析微核率是否有剂量反应关系并有统计学差异，评价卷烟烟气的遗传毒性。
3.根据权利要求2所述的采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，其特征在于:细胞松弛素B溶液采用DMSO配制成I mg/mL并在_20°C条件保存。
4.根据权利要求2所述的采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，其特征在于:环磷酰胺溶液采用PBS配制成0.2 mg/mL，过滤除菌后在_20°C条件保存。
5.根据权利要求2所述的采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，其特征在于=DAPI染色液的配制方法为:用蒸馏水配制成I mg/mL的储存液，-20°C避光保存，使用时用蒸馏水稀释至I μ g/mL的工作液。
【文档编号】G01N21/64GK103792218SQ201410059881
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月21日 优先权日:2014年2月21日
【发明者】毛健, 卢斌斌, 李鹏, 孙世豪, 刘俊辉, 谢剑平, 张建勋, 宗永立 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院