基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法,属于食品安全分析领域。是利用土霉素和卡那霉素适配体同时修饰在纳米磁性微球表面，通过碱基互补分别结合荧光基团标记的互补链，当待测物存在时，适配体与待测物结合引起互补链解离，导致荧光强度的变化，以此达到对土霉素和卡那霉素进行定量检测的目的。本发明利用磁性纳米材料快速分离样品中待测目标物，缩短了检测时间，降低了检测成本，提高了检测灵敏度，操作简单，达到了多残留分析的目的。
【专利说明】基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法
【技术领域】
[0001]本发明设计利用适配体技术对土霉素和卡那霉素进行检测，属于食品安全、检验检疫【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来食品安全事件频发，严重影响了消费者的信心。其中，抗生素残留成为人们关注的焦点。在养殖过程中，四环素类抗生素和卡那霉素常被用作抗菌促生长添加剂和治疗用药。由于使用方法不当和不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，经过食物链被人体吸收后，可能产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡、造成肠道功能紊乱和增强细菌耐药性，给人类健康带来严重危害。
[0003]目前，抗生素检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳技术(CE)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析分析法(GICA)等。仪器分析方法具有灵敏度高、结果准确可靠等优点，但设备昂贵，前处理繁琐，检测时间长，不能满足大量样品筛选和现场快速检测的需要。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，其中以ELISA和GICA方法应用最多，但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在快速检测技术中的应用。
[0004]核酸适配体(Aptamer)技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。核酸适配体是利用指数富集配体系统进化技术(SELEX)，从随机单链寡核苷酸库中筛选出的能与靶分子高特异性结合的核苷酸片段。其空间结构的多样性几乎可以与所有种类的靶分子(细胞因子、蛋白、生物毒素、金属离子、小分子物质、细胞、微生物等)发生结合。具有高亲和力和特异性、制备简单、变性与复性可逆、性质稳定、易于标记等优点，日渐成为分析化学领域研究和应用的焦点。
[0005]目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中抗生素检测的报道，检测方法多以电化学生物传感器为主，虽然这些方法灵敏度高、选择性好，但是检测目标均是单一抗生素，无法满足抗生素多残留检测的需要。本发明针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、前处理繁琐、以及免疫分析方法需要制备抗体的缺点，建立了基于磁珠分离-适配体识别的荧光检测方法，可用于食品中土霉素和卡那霉素多残留的快速、高灵敏度检测。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种同时检测食品中土霉素和卡那霉素残留的快速分析方法。其特点是将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，分别与FAM和ROX标记的适配体互补链杂交，在不同的激发和发射波长下检测互补链上荧光标记物。当加入靶分子时，核酸适配体与靶分子特异性结合，导致与其互补杂交的荧光标记DNA短链的解离，引起荧光强度的变化来定量分析样品中土霉素和卡那霉素。
[0007]本发明所提供的食品中抗生素多残留适配体识别荧光检测方法，通过以下步骤实现。
[0008]1.氨基化纳米磁珠的制备:采用文献(Wu SJ, Duan NJ, Wang ZP, et al.Analyst, 2011, 136，2306-2314)报道的方法进行制备，在30mL乙二醇中加入6.5g的I, 6-己二胺，2.0g无水醋酸钠(CH3COONa)和1.0g六水合三氯化铁(FeCl3.6H20), 50。。搅拌，得胶体溶液，将溶液转移到50mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198°C反应6h。室温冷却，弃上层液体，去离子水冲出下层固体物质，磁分离收集。分别用去离子水和乙醇洗涤2次，50°C干燥 5-10h。
[0009]2.亲和素偶联氨基化的纳米磁珠:定量称取纳米材料悬浮于PBS (IOmM)中，超声分散15min，加入戊二醛溶液，使其终浓度为5% (v/v)。然后室温振荡2h，磁分离，弃上清，IOmM PBS洗涤三次，除去多余的戊二醛。然后加入IOmM的PBS，超声分散，加入一定量的亲和素，室温振荡12h，磁分离，弃上清，IOmM PBS清洗三次。采用紫外分光光度计于280nm处测亲和素结合磁性纳米颗粒前后的吸光值。
[0010]3.生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠:将亲和素修饰的纳米材料悬浮于IOmM PBS中超声分散,加入一定浓度的核酸适配体溶液,室温振荡4h,磁分离,弃上清，IOmM PBS清洗三次以除去未结合的适配体，重悬于PBS缓冲液中。
[0011]4.适配体与互补链杂交:将一定浓度的FAM和ROX标记的互补链，加入上述悬浮液中，37°C避光孵育lh，磁分离，弃上清，PBS洗涤三次以除去游离的互补链，重悬于PBS缓冲液，利用突光分光光度计，分别于495nm、588nm激发波长和520nm、608nm发射波长下，测其荧光值。
[0012]5.加样与检测:将步骤3的纳米材料复合物溶解于解离液中(2.38g HEPES,
7.02g NaCl，0.37g KCl, 1.9g MgCl2, 2.22g CaCl2,0.37g KC1，去离子水定容至 lOOOmL)，加入待测样品或标品溶液，45°C孵育避光反应40-60min，磁分离，弃上清，PBS洗涤三次除去解离下的互补链，重悬于PBS中，在同样条件下检测荧光值。
[0013]6.标准曲线的绘制:按上述操作步骤对土霉素和卡那霉素标准品进行检测，建立标准曲线。标准品浓度依次为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL，置于石英比色皿中，分别在不同的激发波长(FAM: Ex495nm, ROX: Ex588nm)和发射波长下(FAM: Em520 nm,ROX: Em 608 nm)，测其荧光值。标准品浓度为Ong/mL所对应荧光值为/,，不同浓度标准品对应的荧光值为I,以不同标准品浓度为横坐标，以相对荧光值(Λ 1-10)为纵坐标作图，绘制标准曲线。
[0014]7.样品测定:(I)牛奶样品测定:取牛奶样品5.0 mL，加1%三氯乙酸溶液5mL，涡旋混合，10000r/min离心lOmin。弃去上层脂肪层，吸取清液200 μ L用10mmol/L PBS缓冲液定容至I mL用于分析，根据标准曲线计算样品中待测物含量。(2)动物组织样品测定:称取猪肉样品2.0g于50mL离心管中，加入1%三氯乙酸溶液10mL，涡旋混合lmin，超声提取5min, 10000r/min离心IOmin0取上清液250uL用10mmol /T, PBS缓冲液定容至I mL用于分析，根据标准曲线计算样品中待测物含量。
[0015]与现有技术相比，本发明的有效效果:(1)不需要制备抗体，适配体可体外人工合成，制备简单；(2)检测成本低于传统的免疫分析方法；(3)在外加磁场的作用下通过磁分离可实现样品一步分离和富集，操作简单，缩短了检测时间；(4)通过在磁性纳米材料上连接多种适配体可满足抗生素多残留快速检测。【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1.纳米磁性粒子扫描图。
[0017]图2.基于适配体技术同时检测土霉素和卡那霉素的实验原理图。
[0018]图3.亲和素结合纳米磁珠的紫外扫描图。a.亲和素原液吸光值；b.亲和素结合纳米磁珠后的上清液吸光值。
[0019]图4.土霉素标准曲线图。
[0020]图5.卡那霉素标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021]下面通过实施例对本发明做进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]本发明实施例中所用的磁性纳米粒子是根据文献(Wu SJ, Duan NJ, Wang ZP, etal.Analyst, 2011，136，2306-2314)合成。适配体是根据文献报道(Niazi J H.，Lee SJj Gu M B.Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008， 16， 7245-7253.Song KMj ChoMj Jo H，et al.Anal.Biochemj 2011，415，175 - 181 )，由上海生物工程技术有限公司合成。
[0023]土霉素核酸适配体序列为 5’ -CGTACGGAATTCGCTAGCGGGCGGGGGTGC TGGGGGAATGGAGTGCTGCGTGCTGCGGGGATCCGAGCTCCACGTG-3 ’。卡那霉素适配体序列为
5， -TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3，。
[0024]实施例1:标准曲线的建立。
[0025]应用
【发明内容】
中的方法测定土霉素和卡那霉素标准品，建立标准曲线。分别配置土霉素和卡那霉素的系列标准浓度为0、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL,以不同标准品浓度为横坐标，以相对荧光值为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。土霉素和卡那霉素线性范围分别为Ι-lOOng/mL和2-100ng/mL。
[0026]实施例2牛奶样品检测。
[0027]购买牛奶5份，量取牛奶样品5.0 mL,加1%三氯乙酸溶液5mL，涡旋混合，IOOOOr/min离心lOmin。弃去上层脂肪层，吸取清液200 μ L用10mmol/L PBS缓冲液定容至I mL,按
【发明内容】
中检测方法进行检测，根据标准曲线对检测结果进行定量分析。5个样品中有I个检出土霉素，含量为76.2 ng/ml，用GB/T 22990-2008方法检测，该样品土霉素检测值为71.8 ng/ml ο卡那霉素全部未检出，从中选取一个样品做卡那霉素添加回收实验，添加浓度为 100 ng/ml，本发明方法测定值为 80.0 ng/ml, GB/T 22969-2008 测定值为 85.3 ng/ml。
[0028]实施例3动物组织样品检测。
[0029]市场购买猪肉样品5份，各称取2.0g于50mL离心管中，加入1%三氯乙酸溶液IOmL,润旋混合lmin,超声提取5min, 10000r/min离心lOmin。取上清液250uL用IOmmol/L PBS缓冲液定容至I mL用于分析，根据标准曲线计算样品中待测物含量。5个样品中均未检出土霉素和卡那霉素，从中选取一个样品做土霉素和卡那霉素添加回收实验，添加量均为100 ng/g，本发明方法土霉素检测值85.4 ng/g，卡那霉素检测值87.9 ng/g，按GB/T20764-2006 土霉素检测值为90.2 ng/g，卡那霉素没有相应国标未作比较。
[0030]通过回收率实验和与现有国标分析结果比较，表明该发明方法准确、可靠，可以满足检测需要。
【权利要求】
1.基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法，其特征在于:将土霉素和卡那霉素适配体修饰于纳米磁珠表面，分别与两种荧光标记的适配体互补链杂交，加入目标分子后，核酸适配体与靶分子特异性结合，导致与其互补杂交的荧光标记DNA短链的解离，引起荧光强度变化，依据标准曲线求得样品中土霉素和卡那霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法，其特征在于:所述的纳米磁珠是采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，然后利用戊二醛法将氨基化的纳米材料与亲和素偶联。
3.根据权利要求1所述的基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法，其特征在于:所述土霉素核酸适配体apt I和卡那霉素核酸适配体apt 2的5’端均修饰了生物素,通过生物素-亲和素系统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面。
4.根据权利要求1所述的基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法，其特征在于:与土霉素适配体和卡那霉素适配体互补的杂交链在5’端分别标记了两种荧光基团，通过与适配体互补，构成荧光标记核酸探针。
5.根据权利要求1所述的基于适配体的磁纳米荧光传感器检测抗生素多残留的方法，其特征在于:该方法可同时检测两种抗生素。
【文档编号】G01N21/64GK103852460SQ201410111739
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】卢春霞, 唐宗贵, 罗小玲, 刘长彬, 王远, 贺玉凤, 王国红, 罗志根, 刘丽, 刘成江 申请人:新疆农垦科学院