一种多糖及其组份定量方法
【专利摘要】本发明涉及糖类测定【技术领域】，特别是涉及一种多糖及其组份定量方法，多糖样品溶液经高效液相凝胶排阻色谱(HPSEC)或不对称场流分离，联用激光光散射(LLS)、示差折光(RI)和紫外检测(UV)技术分析，以比折光指数增量值(dn/dc)为0.146mL/g(0.130-0.160mL/g)或先经示差折光检测技术测得的多糖或其组份dn/dc值，计算选定分子量分布范围的多糖或其组份含量。本发明可用于植物、真菌等多糖及其产品的含量测定，为多糖类物质的质量控制提供准确、高效、简便方法。
【专利说明】一种多糖及其组份定量方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖类测定【技术领域】，特别是涉及一种多糖及其组份定量方法。
【背景技术】
[0002]多糖是由单糖分子缩合而成的一类高分散、多聚的碳水化合物。作为生命有机体必不可少的成分，它与维持生命的能量代谢及多种生理机能有着密切联系。现代药理研究证明糖类物质具有广泛的生物活性和药理作用，已与蛋白质、核酸、脂类并称为生命四大基础物质。近年来,真菌类、植物类、海洋产物等来源的多糖因其显著及特异的生物活性如抗癌、抗肿瘤、免疫调节、降血糖及血脂、抗氧化以及抗炎抗病毒等引起了人们的广泛关注。目前市面上已有大量的不同种类的多糖类医药保健品在销售。然而，多糖及其产品定量分析一直缺乏特异准确的方法，已成为多糖及其产品质量控制亟待解决的关键问题。
[0003]目前，多糖定量方法常将多糖彻底水解为单糖，再经显色或者色谱方法测定含量，然而这些定量方法常因强酸条件下单糖容易被破坏或具还原性质的成分及单糖和寡糖干扰而导致结果失真。此外，气相色谱法等需要对单糖进行衍生化处理，操作繁琐、耗时，并且这些方法一般只能测定总糖含量，不能同时实现多糖及其不同分子量组份的含量测定。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种快速、准确测定多糖及其组份含量的方法。本发明可克服现有技术准确性差、操作繁琐等不足。实现多糖及其组份特异、准确、快速定量分析。
[0005]本发明是通过如下技术方案实现的:一种多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤如下:
[0006](I)、制备标准多糖溶液并测定多糖比折光指数增量值(dn/dc):采用流动相配制系列浓度的标准多糖溶液(包括不同系列分子量的右旋糖酐、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡甘露聚糖、木葡聚糖、燕麦葡聚糖等)，经微滤膜过滤后，以示差折光检测待测样品多糖dn/dc值。
[0007](2)、制备待测样品多糖溶液并测定多糖比折光指数增量值:不同植物或真菌样品(包括冬虫夏草、蛹虫草、赤芝、紫芝、松杉灵芝、人参、竹节参、手掌参、黄芪、香菇、茯苓、猴头菇、银耳、木耳、绿茶、乌龙茶、决明子、石斛、枸杞、龙眼等)，采用水提醇沉方法制备多糖，并使用流动相配制合适系列浓度(如0.2,0.4,0.6,0.8、1.0、1.2mg/mL)多糖溶液，经示差折光检测器(RI)测定不同待测样品多糖dn/dc值。在测定植物或真菌多糖时，dn/dc值可直接选用 0.146mL/g 或 0.130-0.160mL/g 间任一值。
[0008](3)、在线分离及激光光散射(LLS)、示差折光(RI)和紫外(UV)检测联用技术分析:采用单柱或者多柱高效凝胶排阻色谱模式(HPSEC)或不对称场流对标准多糖或样品多糖进行分离，并联用LLS、RI以及UV检测器，剔除样品中有明显UV信号的主要非多糖物质，再利用步骤2测得的多糖dn/dc值，根据LLS和RI信号，利用比折光指数增量与浓度关联方程:ci = a (V1-Vibaseline)/(dn/dc)计算多糖或其选定分子量组份含量。[0009]式中α是示差折光检测器仪器常数，Vi和Viba-是多糖示差信号和基线信号，dn/dc是多糖比折光指数增量。
[0010](4)、方法准确性评价:比较本发明方法测定标准多糖含量与实际配制的多糖含量，以平均相对偏差评估方法的准确性。此外，分别以自身标准多糖和葡萄糖作对照，分别比较本发明方法与硫酸一苯酚法和HPLC-ELSD法一致性。
[0011](5)、定量方法的简化:准确dn/dc值的测定依赖于纯的多糖对照品，实际工作中难以实现，这也是目前硫酸-苯酚法常以葡萄糖为对照品进行多糖定量主要原因。因此，选择一个合适的dn/dc值，对样品多糖进行定量估算具有非常重要的意义。本发明方法测定多种标准多糖以及植物和真菌来源的样品多糖，以其平均dn/dc值或其范围内其他dn/dc值代替样品真实dn/dc值直接估算多糖含量，结果准确性高，切实可行。
[0012]本发明的一种多糖及其组份定量方法，该方法不会因为强酸条件下单糖容易被破坏或具还原性质的成分及单糖和寡糖干扰而导致结果失真，不仅能测定总糖含量，而且能同时实现多糖及其不同分子量组份的含量测定。可用于植物、真菌等多糖及其产品中多糖及其组份含量测定，为多糖类物质的质量控制提供准确、高效、简便方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1-1为右旋糖酐251mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0014]图1-2为右旋糖酐2701mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0015]图1-3为右旋糖酐4101mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0016]图1-4为阿拉伯半乳聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0017]图1-5为阿拉伯聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0018]图1-6为葡甘露聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0019]图1-7为燕麦葡聚糖251mg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0020]图1-8为木葡聚糖lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL溶液的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0021]图2-1为本发明中人参多糖的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0022]图2-2为本发明中三七多糖的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0023]图2-3为本发明中竹荪多糖的HPSEC和绝对分子量分布图；
[0024]其中A表示RI信号图，B表示分子量分布图，C表示紫外信号线。
【具体实施方式】
[0025]实施例1:
[0026]配制标准多糖溶液:采用0.9% NaCl溶液分别配制系列浓度(0.2,0.4,0.6,0.8、
1.0、1.2mg/mL)右旋糖酐25、右旋糖酐270、右旋糖酐410、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、葡甘露聚糖、燕麦葡聚糖、木葡聚糖溶液，过0.45 μ m微滤膜后，示差折光检测器测定各标准多糖dn/dc ;采用0.9% NaCl溶液配制右旋糖酐25、右旋糖酐270、右旋糖酐410、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯聚糖、葡甘露聚糖、燕麦葡聚糖、木葡聚糖至终浓度分别为lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL,过0.45 μ m微滤膜,用于标准多糖含量测定；
[0027]比折光指数增量值(dn/dc)测定:利用示差折光检测器(RI)，测定各标准多糖系列浓度时RI信号，计算标准多糖dn/dc值；
[0028]在线分离及多角度激光光散射(MALLS)、示差折光(RI)和紫外(UV)检测联用技术分析:色谱条件为流动相，0.9% NaCl溶液；流速，0.5mL/min ;柱温，35°C ;进样量，50至100 μ L ;色谱柱，TSK-GELG-4000PffXL(300mmX 7.8mm, 1.d.);检测器，18 角度激光光散射和示差折光检测器，以及紫外检测器(检测波长λ = 280nm)；
[0029]标准多糖含量计算:利用标准多糖dn/dc值，通过比折光指数增量与浓度关联方程:ci = a (V1-Vibaseline)/(dn/dc)计算标准多糖含量，式中α是示差折光检测器仪器常数，Vi和Vibaseline是多糖示差信号和基线信号，dn/dc是多糖比折光指数增量；另外，可通过
【权利要求】
1.一种多糖及其组份定量方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)、制备标准多糖溶液及待测样品多糖溶液:采用流动相配制合适系列浓度的标准多糖溶液；采用不同提取方法制备待测样品多糖，并采用流动相配制成合适系列浓度的待测样品多糖溶液； (2)、测定标准多糖及待测样品多糖比折光指数增量值:采用示差折光检测器测定标准多糖和/或待测样品多糖的比折光指数增量值； (3)、在线分离与激光光散射、示差折光和紫外检测联用分析:采用高效凝胶排阻色谱或不对称场流分离不同分子量多糖，在线分离与激光光散射、示差折光和紫外检测同时检测，得到待测样品多糖的在线分离与激光光散射、示差折光和紫外信号； (4)、多糖及其组份定量分析:剔除样品中有紫外信号的主要非多糖组份，利用步骤(2)测得dn/dc值，根据在线分离与激光光散射和示差折光信号，利用比折光指数增量与浓度关联方程:ci = a (V1-Vibaseline)/(dn/dc)计算选定分子量范围多糖或其组份含量； 其中，式中α是示差折光检测器仪器常数，Vi和Viba-是多糖示差信号和基线信号，dn/dc是多糖比折光指数增量。
2.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤(I)中所述的流动相为水、氯化钠、硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、氢氧化钠、氢氧化钾或二甲基亚砜水溶液。
3.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤(I)中所述制备待测样品多糖的不同提取方法为:微波辅助水提取、热回流水提取、超声水提取或加压水提取方法。
4.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，在测定植物或真菌多糖时，所述步骤⑵中的dn/dc值，直接选用0.146mL/g或0.130-0.160mL/g间任一值。
5.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤(3)中所述的凝胶排阻色谱，是指利用不同分子排阻尺寸的凝胶色谱柱。
6.根据权利要求5所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为单柱模式。
7.根据权利要求5所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为多柱模式。
8.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤(3)中所述的激光光散射为低角度激光光散射。
9.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤(3)中所述的激光光散射为90°角激光光散射。
10.根据权利要求1所述的多糖及其组份定量方法，其特征在于，步骤(3)中所述的激光光散射为多角度激光光散射。
【文档编号】G01N30/88GK103940940SQ201410172342
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】李绍平, 赵静, 吴定涛, 张杰良 申请人:李绍平